Name: בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: למד טכניקת מיקרוכירורגיה להזרקת תאים סרטניים לדופן הצקום בעכברים ליצירת גידולים אורתוטופיים גרורתיים. שיטה זו מאפשרת בידוד תאים סרטניים מחוללים ומספקת מודל אמין למחקר סרטן המעי הגס.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית (WE 3548 / 4-1) ו- Roland-Ernst-Stiftung for Gesundheitswesen (1/14).

ניסויים בבעלי חיים שהוצגו כאן נבדקו באופן עצמאי והותר על ידי מוסד וועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים ונערכו על פי הנחיות הפדרציה של המעבדה למדעי בעלי חיים (FELASA). כל האמצעים האפשריים נלקחו כדי למזער את הסבל כולל הרדמה ומשכך כאבים או, אם יש צורך, המתת חסד מוקדמת. 1. הכנת תאים ואורגנואידים הערה: השתמש בנפח של 20 μL עם 100,000 תאים עבור כל זריקה. השתמש במטריצה ​​קרום במרתף (BMM) על מנת למנוע דליפה ו להבטיח הזרקת סטנדרטי. על מנת להבטיח תוצאות לשחזור, לנהל מבחני אימות קו התא ( למשל , באמצעות פרופיל STR) במרווחי זמן קבועים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת השעיות תא ראשוני מ רקמות טריות הערה: תמיד לעבוד בתנאים סטריליים. העברה מיידית של טרירקמות resected מחדר הניתוח למעבדה על הקרח נדרש כדי להבטיח את הכדאיות של התאים. רווחת המטופל והטיפול המיטבי חייבים להיות תמיד העדיפות הראשונה. לכן, דגימות רקמות למחקר חייב להתקבל באופן שאינו מפריע לעבודת הפתולוגי שלאחר מכן ובימוי של הגידול resected. ברוב המקרים, לכן סביר לקבל את דגימות למחקר שהושג על ידי הפתולוג מאומן על מנת להבטיח אי-הפרעה עם האבחון הפתולוגי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הסרת סטרילית מן הדגימה resected (אידיאלי ~ 1 ס&quot;מ 3 ), במקום מדגם רקמות בצינור 50 מ&quot;ל מראש מלא עם 20-30 מ&quot;ל של מלוחים שנאגרו מלוחים פוספט (PBS). חנות הצינור על הקרח ולהעביר את המעבדה מיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הרקמה בצלחת פטרי לשטוף אותו פעמיים עם הרבה PBS כדי להסיר את הדם הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות (~ 2-4 מ&quot;מ) עם scaLpel ( לדוגמה , עם להב מס &#39;20 או # 36). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש דיסוציאטור על פי הוראות היצרן על מנת לנתק עוד את רקמת הגידול אל ההשעיה תא בודד. לחלופין, להשתמש בפרוטוקולים אחרים של עיכול הגידול האנזימטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים של ההשעיה תא בודד וכתוצאה מכך ( למשל , בדלפק coulter או hemocytometer). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 xg) ולשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים BMM בריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ​​ולשמור אותם על הקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שורות תאים להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את כל שורות תאים סרטניים המעי הגס תחת תנאים קולטורינג סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ) ולהכין אותם ביום הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על פי תקן פרוטוקולים תרבות התא, לספור את התאים ( למשל , ב coulter הדלפק או hemocytometer) ולחשב את reqUired כמות עבור כל זריקות בהתאם למספר בעלי חיים להיות מוזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3-5x של נפח צורך בפועל בחשבון pipetting הפסדים נפח מת של מזרק ההזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 גרם) לשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים BMM בריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ​​ולשמור אותם על הקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה אורגנואידית הערה: כל התרבויות האורגנואידים 3D גדלים בתנאים רגילים culturing (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ). פרוטוקולים מפורטים לתרבות אורגנואידית פורסמו לפני כן. 18 , 19 , 20 בדומה שורות תאים קונבנציונאלי, אנו ממליצים נפח של 20 BMM μL עם 100,000 תאים לכל הזרקת. האורגנואידים מוכנים ביום הניתוח כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום הבא (בהפניה הבאהכדי DMEM / F12 + +): מתקדם Dulbecco השתנה בינוני של הנשר (DMEM) / F12 + 1% HEPES (1M) + 1% גלוטמין (200 מ&quot;מ) + 1% פניצילין / סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מילוי צינורות 15 מ&quot;ל עם 1 מ&quot;ל DMEM / F12 + +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב את האורגנואים מפני השטח של צלחת התרבות ולהעביר את התוכן של 3 עד 5 בארות לתוך צינור 15 מ&quot;ל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשבור את organoids לתוך חתיכות קטנות יותר על ידי pipetting אותם למעלה ולמטה עם פיפטה זכוכית ממושכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל DMEM / F12 + + אל הצינור, ואחריו צנטריפוגה ב XG 1000 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, להסיר את supernatant, resuspend גלולה ב 600 μL חיץ דיסוציאציה μL ולהעביר את ההשעיה היטב אחד של צלחת 6-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 1-5 דקות ולאחר מכן בזהירות pipet ההשעיה מעלה ומטה על מנת להמיס את האורגנואידים. הערה: בדוק את העיכול באמצעות מיקרוסקופ; הוא שלם כאשר כל אשכולות התא היו לנתקד לתאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אכול מוצלח, להוסיף 1.4 מ&quot;ל של DMEM / F12 + + כדי לעצור את העיכול. ואז להעביר את כל הבארות של אורגנואידים מתעכל צינור 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את התאים ולחשב את הסכום הנדרש עבור כל הזריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 3 - 5x של נפח צורך בפועל בחשבון pipetting הפסדים נפח מת של מזרק ההזרקה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (5 דקות ב 1500 xg) ולשטוף את ההשעיה התא פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspended התאים BMM לריכוז של 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל ​​ולשמור אותם על הקרח. </li></ol></li></ol> 2. דגם עכבר Orthotopic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת חיות הנמען לניתוח הערה: השתמש 6-8 שבועות בן NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD גמא SCID, NSG) עכברים כמקבל. 21 NSG הם בין עכברים immunocompromised ביותר, חסר בוגרים, T ו- NK תאים יחד עם מספר רב של חיסון אחר De. 21 הם לגדול באופן אמין גידולים גם אם מספר תאים נמוך מוזרקים והם נוטים מאוד גרורות רחוקות. עכברי NSG הם מגדלים מעולה יכול להישמר קונבנציונאלי ספציפי פתוגן חינם (SPF) יחידות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני החתך הראשון, להזריק 0.05 מ&quot;ג / ק&quot;ג של בופרנורפין תת עורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש sevoflurane ב 3-3.5 כרך% עבור הרדמה כללית. אובדן רפלקס קמצוץ הבוהן מעיד על הרדמה מספקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את העיניים של עכברים הרדים עם משחה עיניים כדי למנוע התייבשות של הקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרסן את העכברים במצב שכיבה על שולחן קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את הבטן עם מכונת גילוח חשמלית (קרם דפילציה ניתן להשתמש לחילופין) לחטא עם לפחות 3 פעמים clorhexidine / יוד ו 70% אלכוהול לחילופין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את שדה כירורגי עם וילונות סטריליים. הערה: השימוש באנטיביוטיקה perioperative הוא אופציונלי ובכפוף להנחיות מוסדיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Midline laparotomy וחשיפה של cecum <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים (אזמלים ניתן להשתמש לחילופין) לעשות חתך קו האמצע קטן (3 - 5 מ&quot;מ) של העור על הבטן התחתונה. להרים את שרירי דופן דופן הבטן עם מלקחיים בזהירות לחתוך אותו במספריים, ובכך לפתוח את חלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזהות בזהירות exteriorize את cecum עם מלקחיים atraumatic. מקם את העטיפה הסופית העיוורת של cecum על הבטן הצביע cranially. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר exteriorized, לשמור על cecum לחות באמצעות מלוחים חמים מלוחים בכל עת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריקה אורתופטית, סגירת הבטן והחלמה לאחר הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקת intracecal, להשתמש מזרק 1 מ&quot;ל רגיל עם צינורית 30 G. הר זה מזרק על משאבת microinjection, אשר בתורו רכוב על micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לתפוס את קצה cecum עם מלקחיים atraumatic בעדינות להחליק אותו על ידי stroking אותו למטהד עם קבוצה שנייה של מלקחיים מולחמים עם מלוחים חמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את הצינור ישירות מעל cecum. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את השלבים הבאים תחת שליטה חזותית עם מיקרוסקופ כירורגי בינוקולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לתפוס את cecum עם שני מלקחיים atraumatic בשני הקצוות של החלק exteriorized של cecum, מעט למתוח אותו ואז לאט למשוך אותו על צינורית אשר ממוקם מקביל ומעל ישירות. זה חיוני לא לנקב את כל דופן המעי (ובכך להזריק את התאים לתוך לומן), כמו גם לא לחורר את serosa מעבר לנקודת החדירה הראשונית, כמו זה יוביל דליפה והפצה הצפק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את המעיים לכיוון הצינורית, לא את הצינורית לכיוון המעיים. החזק ו למתוח את המעיים בין שני מלקחיים. הידיים של המנתח חייב להיות מונח על משטח כדי להפחית את הרעד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק את התאים בין serosa (כפי שנראה דק מאוד, בטנה שקוף מעל thE כלי הדם intramural) ואת השרירים. צינורית ולכן יש להציב ויזואלית מעל כלי הדם מתחת מתחת לממברנה שקוף שקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתג רגל כדי להתחיל את הזריקה כדי להפחית את הרעידות בזמן צינורית היא בתוך דופן המעיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צינורית נמצאת בעמדה, להתחיל את הזריקה. השתמש משך של 20 s, וכתוצאה מכך 1 μL / s הגדרה על יחידת הבקרה של המשאבה. הערה: הזריקה לתוך או ליד כלי דם פגום מוביל להפצה intravascular ישיר גרורות רחוק ולכן יש להימנע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר השלמת הזריקה, להסיר בזהירות את הצינור על ידי משיכת אותו לאחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ספוגית יבשה מתחת cecum, ולאחר מכן לשטוף היטב את cecum עם מים מזוקקים על מנת lyse leaked תאים ובכך למנוע הפצה מלאכותית הצפק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגירת הבטן והתאוששות לאחר הניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי רמזיזים בעדינות את הצואה לחלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את דופן הבטן עם 6-0 התפרים פועל במהירות absorbable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את העור עם קליפ הפצע כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על המפה חימום להגדיר 38 מעלות צלזיוס עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקפידה להתבונן במצב שלאחר הניתוח של העכברים במשך 48 שעות הבאות. במקרה של מצוקה, לטפל עם 0.05 מ&quot;ג / ק&quot;ג buprenorphine כל 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על העכברים לפחות פעם אחת ביום עבור סימנים של מצוקה בשל הגידול בגידול. </li></ol></li></ol> 3. בידוד של תאים סרטניים במחזור מ דוגמאות דם מלא הערה: השגת דם על ידי לנקב קרדיאלי עור על עכברים מורדמים, ואחריו המתת חסד. באופן אידיאלי, 1000 μL של דם נמשכים לתוך מזרק prefilled עם μL 100 של נוגדי קרישה (חומצה Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) או הפרין). השתמש אנטי אנושי, EpCAM (דלקת תא אפיתלמולקולה) נוגדן כדי לזהות את CTCs. זה עובד טוב מאוד אם אנושיים שורות תא אפיתל משמשים את המודל העכבר. עבור מכשירים אחרים, נוגדנים שונים עשויים להיות נדרשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העשרת CTC: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מילוי צינורות 15 מ&quot;ל עם 5 מ&quot;ל צפיפות בינוני שיפוע בזהירות להעביר את הדם לתוך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה (30 דקות ב 300 xg ללא בלימה) בזהירות להסיר את supernatant העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את השאר לתוך צינור חדש 15 מ&quot;ל ו צנטריפוגה (15 דקות, 300 XG עם הבלם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחזר את interfase המכיל את התאים mononuclear (להשליך את שאר) ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה 200 μL PBS / 1% EDTA ולהוסיף 4 μL של נוגדן EpCAM. דגירה 20 דקות על הקרח בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקרנה וקטיף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המאגר הבא (הנקרא להלן חיץ לקטוף): PBS + 10% עגל בסרום בסרום (FCS) + 1% פניצילין / Sטרפטומיצין (1%) + 0.8% EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעט PAP לצייר מעגל ~ 1 ס&quot;מ בצלחת פטרי 6 ס&quot;מ סטרילי (מונע את הנוזל מפיזור בצלחת), ו 700 μL pipet של לקטוף למאגר לתוך מעגל זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL ההשעיה התא למאגר 700 μL לקטוף בתוך המעגל. בדוק את צפיפות התאים עם המיקרוסקופ. פיצול המדגם לתוך מנות שונות אם הוא צפוף מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן לתאים להתיישב (~ 5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך טיפת ההשעיה התא עבור מוכתם (= EpCAM חיובי) תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התא נמצא, לבחור את התא עם micromanipulator ולשים אותו חיץ 50 μL בהתאם ניתוח במורד המיועד ( למשל , חיץ RNA החילוץ או בינוני culturing). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לנתונים במורד הזרם המיועד, לבודד תאים שליליים של EpCAM ו / או בינוני כבקרות שליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ניתוח במורד הזרם ( למשל , תרבות התא, PCR). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26742998">Cancer statistics, 2016.</a> CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).</li>
<li>Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15639298">Colorectal cancer.</a> Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.smartscitech.com/index.php/CCM/article/view/323">Circulating tumor cells of colorectal cancer.</a> Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).</li>
<li>Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+significance+of+circulating+and+disseminated+tumour+cells+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer.</a> Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).</li>
<li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+minimal+residual+disease+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer.</a> World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).</li>
<li>Bork, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+and+outcome+in+non-metastatic+colorectal+cancer%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study.</a> Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).</li>
<li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+differences+of+circulating+tumor+cells+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer.</a> Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).</li>
<li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+Spread+Emerging+From+Liver+Metastases+of+Colorectal+Cancer%3A+Does+the+Seed+Leave+the+Soil+Again%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again?</a> Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).</li>
<li>Rahbari, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-analysis+shows+that+detection+of+circulating+tumor+cells+indicates+poor+prognosis+in+patients+with+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer.</a> Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).</li>
<li>Steinert, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+Escape+and+Survival+Mechanisms+in+Circulating+Tumor+Cells+of+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer.</a> Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mighty+mouse%3A+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li>
<li>Roper, J., Hung, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priceless+GEMMs%3A+genetically+engineered+mouse+models+for+colorectal+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development.</a> Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+combined+with+TLR7%2F8+activation+induces+strong+immune+responses+against+gastrointestinal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors.</a> Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).</li>
<li>Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+activation+and+ionizing+radiation+induce+strong+immune+responses+against+multiple+tumor+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities.</a> Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).</li>
<li>Schölch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+exhibit+stem+cell+characteristics+in+an+orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).</li>
<li>Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. <a target="_blank" href="https://www.omicsonline.org/open-access/mouse-models-of-colorectal-cancerderived-circulating-tumor-cells-2161-0444-1000389.pdf">Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells.</a> Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).</li>
<li>van Noort, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Drug+Candidates+for+the+Treatment+of+Metastatic+Colorectal+Cancer+through+Global+Inverse+Gene-Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling.</a> Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+cultures+derived+from+patients+with+advanced+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer.</a> Cell. 159 (1), 176-187 (2014).</li>
<li>Ito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOD%2FSCID%2Fgamma%28c%29%28null%29+mouse%3A+an+excellent+recipient+mouse+model+for+engraftment+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells.</a> Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).</li>
<li>Simon, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+phenotypic+and+genomic+analysis+of+C57BL%2F6J+and+C57BL%2F6N+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains.</a> Genome Biol. 14 (7), R82(2013).</li>
<li>Kalish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C57BL%2F6N+Mice+Are+More+Resistant+to+Ehrlich+Ascites+Tumors+Than+C57BL%2F6J+Mice%3A+The+Role+of+Macrophage+Nitric+Oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Monit+Basic+Res%22%5BJournal%5D)">C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide.</a> Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).</li>
<li>Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+mouse+model+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Orthotopic mouse model of colorectal cancer.</a> J Vis Exp. (10), e484(2007).</li>
<li>Roper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+PI3K%2FMEK+inhibition+promotes+tumor+apoptosis+and+regression+in+PIK3CA+wild-type%2C+KRAS+mutant+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer.</a> Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).</li>
<li>Coffee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+BRAF+and+PI3K%2FmTOR+blockade+is+required+for+effective+treatment+of+BRAF%28V600E%29+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer.</a> Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).</li>
<li>Belmont, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+to+dual+blockade+of+the+kinases+PI3K+and+mTOR+in+KRAS-mutant+colorectal+cancer+models+results+in+combined+sensitivity+to+inhibition+of+the+receptor+tyrosine+kinase+EGFR%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR.</a> Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).</li>
<li>Hung, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+mouse+model+for+sporadic+and+metastatic+colon+tumors+and+its+use+in+assessing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).</li>
<li>Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Inducible%2C+Large-Intestine-Specific+Transgenic+Mouse+Model+for+Colitis+and+Colitis-Induced+Colon+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research.</a> Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).</li>
<li>Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+transgenic+mouse+for+colorectal+cancer+research+with+intestinal+cre+expression+limited+to+the+large+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine.</a> Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).</li>
<li>Tetteh, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+inducible+colon-specific+Cre+enzyme+mouse+line+for+colon+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

למרות הפעילות המוכחת שלהם במודלים עכבריים תת-עוריים, הרוב הגדול של המרכיבים החדשים נכשל בניסויים קליניים ומעולם לא הגיע למרפאה. 11 זה חוסר ברור של מודלים עכבר תת עוריים כדי לדמות במדויק את הביולוגיה ואת דפוסי הצמיחה של גידולים הובילה לפיתוח מודלים עכבר orthotopic מבוסס על הזרקה של תאים סרטניים ישירות לתוך האיבר המקורי. מודלים עכבר Orthutic מסוגלים לדמות את הביולוגיה והפצה של גידולים מוצקים...

סרטן המעי הגס (CRC) הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר למוות סרטן במדינות מערביות. 1 בעוד הגידול הראשוני יכול לעיתים קרובות להיות resected, את התרחשות גרורות רחוקות באופן דרמטי מחריף את הפרוגנוזה ולעתים קרובות מוביל למוות. 2 , 3 מתאם ביולוגי של גרורות הוא מחזורי תאים סרטניים, אשר לנתק מן הגידול, לשרוד במחזור, לצרף את אפיתל באיבר היעד, לפלוש לאיבר ובסופו של דבר להתגבר על נגעים חדשים. 4 למרות שמדובר בחומר CTC ידוע בעל רלוונטיות פרוגנוסטית, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 הביולוגיה שלהם מובנת חלקית רק כתוצאה מן הנדירות הקיצונית שלהם ב- CRC. 10 מודלים עכבר הם לא חזקOol ללמוד היבטים שונים של ביולוגיה של סרטן. מודלים קלאסיים, תת עוריים מיוצרים על ידי הזרקה תת עורית של תאים סרטניים לעכברים הנמענים, אשר יכול להיות גם immunocompetent (אם תאים סרטניים Murine syngeneic משמשים) או immunodeficient. מודלים גידול תת-עוריים הם זולים ומייצרים נתונים במהירות; צמיחת הגידול של נקודת הסיום שלהם יכולה להיות נמדדת בקלות ובלא פולשניות. עם זאת, 88% של תרכובות חדשות שהפגינו פעילות אנטי-סרטנית במודלים כאלה נכשלות בניסויים קליניים. 11 זה בחלקו בשל הבדלים בין בני-אדם בין עכברים לעכברים; עם זאת, חלק גדול של כישלון זה נובע ערך מנבא נמוך של מודלים עכבר תת עורית. מודלים עכבר Orthotopic, שבו תאים סרטניים מוזרקים לתוך איבר המוצא ובכך לגדול microenvironment המקורי שלהם, ולכן משמשים יותר ויותר במחקר סרטן. 11 , 12 , </sלמעלה&gt; 13 , 14 מודלים אורתופטיים לא רק לדמות את התנאים גידול הגידול המקומי; כתוצאה מהאתר האנטומי של גידול הגידול, מודלים של עכבר אורטוטופיים מאפשרים גם סימולציה מציאותית של גרורות, ולכן הם משתמשים כדי לחקור את הביולוגיה של CTC 8 , 15 , 16 או את תגובתם לטיפולים שונים ב- CRC. 13 , 17 החיסרון העיקרי של מודלים עכבר אורתוטופיים היא המורכבות הטכנית שלהם. בהתאם האיבר שבו תאים להיות מוזרק, עקומת למידה עד הנסיין הוא מסוגל לגדל גידולים לשחזור הוא ארוך למדי. זה במיוחד חל על מודלים של סרטן המעי הגס, כמו תאים סרטניים צריך להיות מוזרק לתוך דופן המעיים, אשר לעתים קרובות התוצאות ניקוב, דליפת תא הגידול או הפסד endoluminal תא הגידול. זהRticle מיועד לתאר את השיטה של ​​הכנת תאים דגימות רקמה ראשונית, שורות תאים 2D ותרבות אורגנואידית 3D הזרקתם לתוך cecum של עכברים. הטכניקה המתוארת כאן מוביל לגידולים אחידים מאוד, בהתאם לביולוגיה הגידול של קו התא המשמש להזרקת, היווצרות של גרורות מרוחקות ו CTCs בעכברים הנמען. 15

<table><tbody><tr><td><חזק>תרבית תאים מדיה ורכיבים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתקדם DMEM F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634010</td><td>DMEM/ F12 +++ HEPES בינוני</td></tr><tr><td>(1 מ')</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15630056</td><td>DMEM/ F12 +++ תוסף</td></tr><tr><td>גלוטמקס-I בינוני (200 מ"מ)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>35050038</td><td>DMEM/ F12 +++</td></tr><tr><td>בינוני פניצילין/ סטרפטומיצין (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>15140122</td><td>DMEM/ F12 +++ מדיום</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>61965026</td><td>מדיום בסיסי של קווי תאים דו-ממדיים (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>מדיום בסיסי של קווי תאים דו-ממדיים (DMEM/10% FCS)</td></tr><tr><td>TrypLE Express מאגר דיסוציאציה אנזימטי</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת ממברנת הבסיס של מטריג'ל (BMM, ללא פנול אדום)</td><td>CORNING B.V. Life Sciences</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered</td><td>Saline Life Technologies GmbH</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%, פנול-אדום)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6/48 בארות עם מכסה</td><td>CORNING</td><td>3516/3548</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים 75 ס"מ&sup2;, 250 מ"ל</td><td>VWR International GmbH</td><td>734-2066</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים 150 ס"מ&, 600 מ"ל</td><td>צינורות קורנינג 355001 מדעי</td><td></td><td></td>החיים</tr><tr><td>1,5 מ"ל / 2 מ"ל</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.706.400/ 72.695.400</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל, 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>Greiner-Bio-One GmbH</td><td>188271/227270</td><td></td></tr><tr><td>TC10 שקופיות ספירה (למכונת ספירה TC20)</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1450016</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר (זכוכית, 150 מ"מ)</td><td>Fisher Scientific GmbH</td><td>11546963/ FB50251</td><td>נמשכות דק באמצעות מבער בונסן</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>להכנת רקמת גידול ראשונית</td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>להכנת רקמת גידול ראשונית</td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>להכנת רקמת גידול ראשונית</td></tr><tr><td>ערכת דיסוציאציה של גידול אנושי</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>להכנת רקמת</td></tr> <tr><td>גידול ראשוניתפלקון 70 ומיקרו; m מסננת תאים</td><td>Corning B.V. מדעי החיים</td><td>352350</td><td>להכנת רקמת גידול ראשונית</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Surgical Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>AbbVie Germany GmbH & Co. KG-Medical</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>oxygen</td><td>Air Liquide Medical GmbH-Buprenorphine</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Temgesic-Bepanthen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>- משחה אופטית</td><td>Bayer Vital GmbH</td><td>10047757</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח רגילה 0.9% (E154)</td> <td>Serumwerk Bernburg AG</td><td>10013</td><td></td></tr><tr><td>Aqua ad Injectabilia</td><td>Braun</td><td>235144</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל (ללא נפח מת) - Injekt-F SOLO</td><td>Braun/neoLab</td><td>194291661</td><td></td></tr><tr><td>מחט הזרקה 30G</td><td>BECTON DICKINSON</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>ספוגיות תאית</td><td>Lohmann & Rauscher Deutschland</td><td>13356</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-אדסון מלקחיים</td><td>FST - כלים מדעיים עדינים</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>מספריים איריס - ToughCut</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט Olsen-Hegar</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>AutoClip Kit</td><td>FST - Fine Science Tools</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>PDS Z1012H 6/0 C1 (כירורגי תפר)</td><td>ג'ונסון & ג'ונסון רפואי GmbH</td><td>Z1012H</td><td></td></tr><tr><td>מכונת הרדמה מחקר שולחני עם שטיפה O2 ומכשיר אידוי Sevoflurane</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PS/PK</td><td></td></tr><tr><td>משאבת UltraMicro עם בקר Micro4</td> ציוד מכשירי <td>דיוק עולמיים</td><td>UMP3-4</td><td>להזרקה אורתוטופית מבוקרת מאוד</td></tr><tr><td>מתג רגליים עבור בקר SYS-Micro4</td> מכשירי <td>דיוק עולמיים</td><td>15867</td><td>ציוד להזרקה אורתוטופית מבוקרת מאוד</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ידני תלת צירי</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>M325</td><td>ציוד להזרקה אורתוטופית מבוקרת מאוד</td></tr><tr><td>מעמד מגנטי למיקרומניפולטור</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>M10</td><td>ציוד להזרקה אורתוטופית מבוקרת מאוד</td></tr><tr><td>לוחית בסיס פלדה למעמד מגנטי M10</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>5479</td><td>ציוד להזרקה אורתוטופית מבוקרת במיוחד</td></tr><tr><td>פלטה חמה 062</td><td>Labotect</td><td>13854</td><td></td></tr><tr><td>Isis - מכונת גילוח</td><td>לשיער AESCULAP -</td><td></td> מיקרוסקופ כירורגי משקפת בראון <td></td></tr><tr><td></td><td>Parkland Scientific</td><td>VS-2Z</td><td></td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>CTC isolation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td></td></tr><tr><td>צפיפות שיפוע בינוני &ndash; Ficoll</td><td>StemCell - Lymphoprep</td><td>7801</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 אנטי אנושי CD326 (EpCAM) שיבוט נוגדנים 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324210</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-mouse CD326 (EpCAM) שיבוט נוגדנים G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118210</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי, &oslash; 60 x 15 מ"מ, 21 ס"מ&sup2;, Vent</td><td>Greiner bio-one</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ תרבית תאים פלואורסצנטיים</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transferman 4r Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTram Air</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>משאבת שאיבה המחוברת למיקרומניפולטור</td></tr><tr><td>Dmz Universal Microelectrode Puller</td><td>Dagan Corporation</td><td></td><td>הנדרשת לייצור מיקרו נימים לשאיבת תא בודד</td></tr><tr><td>נימי זכוכית פריזמה</td><td>תאגיד דגן</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עט PAP</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate Buffered</td><td>Saline Life Technologies GmbH</td><td>מאגר איסוף</td><td>14190169</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td> <td>BIOCHROM AG</td><td>S 0115</td><td>מאגר איסוף</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין (PenStrep)</td><td>Life Technologies GmbH</td><td>מאגר איסוף 15140122</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>8040.1</td><td>מאגר פיקינג</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק</td><td>><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>אימונוהיסטוכימיה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>שיבוט נוגדנים אנטי-אנושי מטוהר CD326 (EpCAM) 9C4</td><td>BioLegend</td><td>324201</td><td>EpCAM אימונוהיסטוכימיה (ראה, איור 2C)</td></tr><tr><td>HRP ארנב אנטי עכבר IgG</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td>EpCAM אימונוהיסטוכימיה (cf, איור 2C)</td></tr></tbody></table>

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

למרות היתרונות של תחולה קלה ויעילות עלות, מודלים עכברי תת עוריים יש מגבלות חמורות לא מדויק המדמה גידול ביולוגיה גידול תאים סרטניים. מודלים עכבר Orthotopic כבר הציג להתגבר על מגבלות אלה; עם זאת, מודלים אלה הם תובעניים מבחינה טכנית, במיוחד איברים חלולים כגון המעיים הגדולים. כדי לייצר גידולים אחידים אשר לגדול באופן אמין גרורות, טכניקות סטנדרטיות של הכנת תאים סרטניים הזרקה הם קריטיים. פיתחנו מודל עכבר אורטוטופי של סרטן המעי הגס (CRC), אשר מפתחת גידולים אחידים מאוד וניתן להשתמש בו ללימודי ביולוגיה של הגידול, כמו גם ניסויים טיפוליים. תאים סרטניים משני גידולים ראשוניים, תאים דו מימדיים (2D) או תאים תלת מימדיים (3D) מוזרקים לתוך cecum, בהתאם לפוטנציאל הגרורתי של תאים סרטניים מוזרקים, יוצרים גידולים גרורתיים מאוד. בנוסף,CTCs ניתן למצוא באופן קבוע. אנו מתארים כאן את הטכניקה של הכנת תאים סרטניים משני שורות תאים דו-ממדיים ואורגנואידים תלת-ממדיים, כמו גם ברקמת הגידול הראשית, טכניקות ההזרקה וההזרקה, כמו גם בידוד של CTCs מן העכברים הנושאים גידולים, ומציעים עצות לפתרון בעיות.

מוצלח לשעתקו של גידולים המעי הגס במודל זה באופן ביקורתי תלוי הזרקת מדויק של תאים ללא דליפה או דליפה. אם זה הושג, מודל זה הוא אמין מאוד ורק לעתים רחוקות תוצאות ההפצה הצפק מלאכותית. קינטיקה הצמיחה של גידולים כמו גם דפוסי ההפצה שלהם תלויים בביולוגיה של אורגנואידים בשימוש ותאים. 15 בעוד HCT116 תאים גרורות באופן אמין לכבד במודל זה, SW620 תאים טופס גידולים אורטוטופיים, אבל לא גרורות. 15 <p class="jove_c...

אנו מתארים את הקמתם של גידולים המעי הגס אורטוטופיים באמצעות הזרקה של תאים סרטניים או אורגנואידים לתוך cecum של עכברים הבידוד הבאים של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מן המודל הזה.

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

המטרה הכללית של טכניקה מיקרו-כירורגית זו היא להחדיר תאי גידול של קולורקטום לדופן העקום (cecum) כדי להשראת גידולים קולורקטומים שחזירים ומטסטטיים בעכברים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מרכזיות בתחום הביולוגיה של תאי גידול במחזור הדם; יתרונותיה העיקריים הם גידולים אחידים ושחזרים מאוד, המאפשרים ניבוי מהימן של השלב ושל כמות תאי הגידול במחזור הדם. התחילו בשימוש בפינצטה לאטראומטית כדי להוציא בזהירות את העקום של עכבר עם מערכת חיסון לקויה בן שש עד שמונה שבועות.הנחת הקצה העיוור של העקום (cecum) על הבטן כך שהשקיק פונה קרניאלית. עבור ההזרקה תוך-עקומה, הרכיבו מזרקה סטנדרטית של מיליליטר אחד המצוידת מקנולה במידה 30 ומלאו אותה בתאי הגידול, והניחו אותה על משאבת מיקרו-הזרקה המורכבת על מיקרו-מניפולטור. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה לא-טראומטית כדי לתפוס בזהירות את קצה העקום והשתמשו בפינצטה שנייה, מולחשת בסליין חמים, כדי להחליק בעדינות את העקום בתנועות כלפי מטה.כעת העבירו את בעל החיים תחת מיקרוסקופ כירורגי בינוקולרי, כאשר הקנולה מקבילה ישירות למעי העיוור ומעליו, והשתמשו בשתי פינצטות אטראומטיות כדי למתוח בזהירות את הרקמה בשני קצותיו של הקצה החיצוני של המעי העיוור. משכו לאט את המעי העיוור מעל הקנולה, תוך הקפדה לא לנקב את כל חגורת הדופן או את הסרוזה מעבר לנקודת החדירה הראשונית, והניחו את הקנולה מעל כלי הדם ומתחת לממברנה השקופה והדקה בתוך חגורת הדופן. כאשר הקנולה במקומה, השתמשו במפסק רגל כדי להזריק 20 µL של תאים לאורך 20 שניות.בין שכבת הסרוזה השקופה והדקה, מעל כלי הדם האינטרה-מוראליים ומעל השכבה השרירית (muscularis). לאחר שכל התאים הוזרקו, הוצא בזהירות את הקנולה והנח ספוג יבש תחת העומה (cecum). כדי למנוע פיזור פריטוניאלי מלאכותי, השמד תאים שדלפו באמצעות שטיפה יסודית במים מזוקקים והחזר בעדינות את העומה לחלל הבטן.סגור את דופן הבטן באמצעות תפרים רצים שנספגים במהירות, ואת העור באמצעות סיכות לסגירת פצעים כירורגיים. לאחר מכן, הנח את העכבר על משטח חימום המכוון ל-38 degrees celsius עם ניטור עד להחלמה מלאה. כדי לבודד את תאי הגידול במחזור הדם, בנקודת הסיום הניסויית המתאימה, מלא מבחנות קוניות של 15 milliliter בחמישה milliliters של מצע מדרג צפיפות לכל מבחנה, והעבר בזהירות דגימות דם מלא שנאספו מבעלי חיים הנושאים גידול אל מעל לשכבות מדרג הצפיפות.הפרידו את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה, ואספו בזהירות את השכבה המנחית (interface) המכילה את התאים חד-גרעיניים. העבירו את התאים חד-גרעיניים באמצעות פיפט לשפופרת חדשה של 15 milliliter לצנטריפוגה שנייה. לאחר מכן, שטפו את השפופרת ב-PBS.לאחר השטיפה השנייה, השביה מחדש את המשקעים ב-200 microliters של PBS, בתוספת EDTA, והוסף ארבעה microliters של נוגדן anti amp camp לכל דגימה, להדגרה למשך 20 דקות על קרח בחשכה. לאחר מכן, השתמש בטוש למחסום הידרופובי כדי לצייר מעגל של כ-one centimeters בתוך צלחת פטרי סטרילית אחת בקוטר six centimeters עבור כל דגימה, והוסף 700 microliters של picking buffer לכל מעגל, ולאחריו 50 microliters של תרחיף תאים. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק את צפיפות התאים, והמתן עד שהדגימות ישקעו במשך כחמש דקות.לאחר מכן, סרקו את טיפת התאים לבדיקת חיוביות ל-amp camp והשתמשו במיקרו-מניפולטור כדי להעביר את התאים הרצויים ל-15 µL של הבאפר המתאים לניתוח המשכי המתוכנן. השימוש בתאי מעי גדול במודל זה מוביל באופן עקבי להופעה מרובה יותר של עכברים תוך 35 ימים מהזרקת תאי הגידול, כאשר הגידולים הראשוניים מגיעים לגודל של כ-10 millimeters, ובמרבית המקרים קיימים גרורות בכבד ובראה, וכן תאי גידול במחזור הדם. יתרה מכך, ניתן לבודד בקלות את תאי הגידול במחזור הדם לצורך ניתוחים המשכיים.לאחר השליטה בטכניקה ובמידה ובוצעה כה properly, ניתן לבצע אותה בתוך 10 דקות, דבר המקל על יצירת גידולים אחידים וגרורתיים שניתן להשתמש בהם הן למחקרים טיפוליים והן למחקרים מולקולריים. מגבלות המודל כוללות את התלות שלו בתליית תאים (cell lyse), שיש להן מגבלות משלהן, וכן את חסר החיסון של העכברים; שתי מגבלות אלו ניתנות להתגברות באמצעות שימוש בתאי סרטן דוקולורקטליים מוטנטיים. בשל פשטותו, מודל זה עשוי להוות תוספת בעלת ערך למודלים הקיימים כיום של סרטן דוקולורקטלי.

isolation-circulating-tumor-cells-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

שתי טכניקות שניתן להשתמש בהם כדי לבסס את המודל הזה: הזרקה של השעיה תא סרטני בקיר cecal או השתלה של פיסת גידול תת עורי על cecum. מודל זה שימושי לחקר התפתחות טבעית של סרטן המעי הגס בדיקות סוכני טיפולית חדשה נגד סרטן המעי הגס.

עכבר דגם orthotopic של סרטן המעי הגס

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול לביסוס מודל עכבר גרורות ספונטני של קסנוגרפטים או PDX שמקורם בסרטן המעי הגס. מודלים אלה של xenograft מחקים חלקית את המאפיינים של קרצינומה אנושית ומבינים את ההיבטים הקריטיים של ממאירויות אנושיות, כולל פלישה וגרורות.

מודלים ספונטניים של גרורות בעכבר: פלטפורמה לחקר הפוטנציאל הגרורתי של תאי סרטן המעי הגס בהזרקה אורתוטופית

סרטון זה מתאר את הפרוטוקול ליצירת גרורות על ידי אורגנואידי CRC הנגזרים מ-PDX המסומנים ב-GFP lentivirus לתוך הטחול של עכבר מדוכא חיסון. מיקרו-גרורות סרטניות המאכלסות איברים אחרים יכולות להיות מזוהות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להעריך את ביטוי GFP.

ביסוס מודל עכבר גרורות ניסיוני: השתלת תאי אורגנואיד CRC המבטאים GFP במודל PDX לאיתור מיקרוגרורות

הסרטון מתאר את הטכניקה להזרקה עקתית של תאים סרטניים לפיתוח מודל עכבר אורתוטופי עם גידולים אחידים ביותר. לכן, מודל העכבר האורתוטופי מאפשר הדמיה מציאותית של גרורות, ומספק כלי רב ערך לחקר השינויים בפנוטיפ במהלך צמיחת הגידול והפצתו.

הזרקת תאי גידול עקבתיים: טכניקה להעברת תאים סרטניים להקמת מודל עכבר אורתוטופי לסרטן המעי הגס

סרטון זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גידול במחזור הדם מכל דגימת הדם של מודל עכבר גידול מעי גס שעבר המתת חסד. ניתן לתרבית CTCs מבודדים אלה ולהשתמש בהם לניתוח מיועד במורד הזרם.

בידוד CTC מדגימת דם שלמה: שיטה להשגת CTCs ממודל סרטן המעי הגס מורין

תאי גידול במחזור הדם (CTCs) הוכחו כממלאים תפקיד חשוב בגרורות גידול. כאן, מתוארת שיטה לבידוד והתפשטות של CTCs מהדם המלא של מודל גידול עכבר סינגני של גרורות קרצינומה של הכבד (HCC).

בידוד וריבוי תאים סרטניים במחזור מסרטן מודל עכבר

כדי לאפשר זיהוי רגישה מאוד של סרטן המעי הגס האנושי disseminating (CRC) תאים להמדינות רקמות, במסמך זה נראה עבור התמרה חושית יעילה של חלקיקים lentiviral חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לתוך תאים תא צורב PDX-derived CRC פרוטוקול לפני הזרקת שלהם לתוך עכברים הנמען, עם תצפית מיקרוסקופית סטריאו-זריחה.

רגישות גבוהה זיהוי של Micrometastases שנוצרו על-ידי Organoids Lentivirus transduced GFP תרבותי מגידול נגזר המטופל הגס

פרוטוקול זה מתאר את הדור של החולה הנגזר הנושא מודלים מבע על ידי פנים-ומבחינה משפטית הקניית תאים קרצינומה של תא ברמה גבוהה urothelial או פנים-rectally הזרקת תאים סרטניים המעי הגס לתוך סוכרת שמנים/חמור משולב כשל חיסוני (הנהון/SCID) עכברים לגידול הגידול הראשוני גרורות מתחת להשפעה של תאים סטרומה בצומת הלימפה, אשר מחקה את ההתקדמות של מחלות גרורתית האדם.

מטופל-נגזר אורתוטופית מודלים של תאים האדם Urothelial קרצינומה של סרטן המעי הגס ואת הגידול גרורות ספונטנית

הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים מסרטן המעי הגס (CRC) יוצרת גרורות כבד עשירות בסטרומה. מודל עכבר זה של גרורות כבד CRC מייצג כלי שימושי לחקר אינטראקציות בין גידול לסטרומה ולפיתוח טיפולים חדשניים המכוונים לסטרומה כגון טיפולים גנטיים בתיווך וירוסים הקשורים לאדנו.

הזרקת וריד פורטל של אורגנואידים לסרטן המעי הגס לחקר סטרומה גרורות בכבד

פרוטוקול זה מתאר השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בדופן הצקום של עכברים מדוכאי חיסון. המודל משחזר מחלה גרורתית מתקדמת של סרטן המעי הגס והחלחולת ומאפשר הערכה של תרופות טיפוליות חדשות בתרחיש רלוונטי קלינית של גרורות ריאה וכבד.

השתלה אורתוטופית של תאים סרטניים שמקורם בחולה בעכברים משחזרת סרטן מעי גס מתקדם

מחקר זה מתמקד באינדוקציה תת עורית in vivo של תאי סרטן המעי הגס הזוהרים במודל עכברי ובמדידת הזוהר שלאחר מכן באמצעות מערכת הדמיה. ההליך נועד לבסס מודל גידול הניתן לשחזור לניטור והערכה טיפולית בזמן אמת.

הזרקה תת עורית של תאי סרטן המעי הגס האנושיים בעכברים עירומים אתימיים להערכת יעילות אנטי-גידולית

למד טכניקת מיקרוכירורגיה להזרקת תאים סרטניים לדופן הצקום בעכברים ליצירת גידולים אורתוטופיים גרורתיים. שיטה זו מאפשרת בידוד תאים סרטניים מחוללים ומספקת מודל אמין למחקר סרטן המעי הגס.

בידוד של תאים סרטניים במחזור מודל עכבר אורתופטי של סרטן המעי הגס

גלה סרטונים נוספים