Organotypic תרבויות פרוסה בהיפוקמפוס כמודל מחקר Neuroprotection, Invasiveness של תאים סרטניים
27 באוגוסט 2017
Organotypic פרוסה בהיפוקמפוס תרבויות (OHSC) מייצגים במבחנה דגם המדמה את המצב ויוו היטב. כאן נתאר מבוסס-vibratome משופרת עם פרוסות פרוטוקול כדי לקבל פרוסות באיכות גבוהה לשימוש בהערכת הפוטנציאל neuroprotective של חומרים חדשניים או ההתנהגות הביולוגית של תאים סרטניים.
הכנה וחיתוך באמצעות ויברטום (vibratome). נדרשים שלושה בלוקים של אגר כדי לייצב את המוח במהלך הליך החיתוך. כדי למנוע זיהום, השתמשו בסט מכשירים שעברו עיקור באוטוקלאב.
הסיר את האגר. יש לייבש את הדגימה על נייר סנן לפני הדבקתה לפלטת המתכת באמצעות דבק ציאנואקרילט (Cyanoacrylate) רפואי. בעזרת שפכטל, הסר את המוח והנח אותו בזהירות בתוך צלחת פטרי מלאה בתמיסת הכנה.
בשלב הבא, ייבשו קלות את המוח על נייר סנן. כסו את לוח המתכת בדבק Cyanoacrylate רפואי. השתמשו בפינצטה ובשפכטל כדי למקם את המוח על תומך הדגימות.
השתמשו בשתי חתיכות האגר שהוכנו קודם לכן כדי להבטיח יציבות מכנית משני הצדדים. בשלב זה, יש להניח את המוח לצד בלוק האגר ולקבע אותו עם שני בלוקים נוספים כדי למנוע נזק במהלך הפריסה. מקמו את לוח המתכת בויברטום וכסו את הרקמה בתמיסת הכנה קרה.
לאחר מכן, בצעו דיסקציה של הרקמה באופן אופקי בעובי של 350 micrometers ב-OHSC באמצעות וייברטום (vibratome) עם להב מחליק. העבירו את הפרוסות לצלחמת פטרי, תוך שימוש בחלק האחורי של פיפטת פסטור שבורה לאיסוף הפרוסות. שמרו את פרוסות המוח בתמיסת הכנה קרה.
הערך את הפרוסות באופן אופטי באמצעות מיקרוסקופ בינוקולרי. הפר את אזור ההיפוקמפוס והחדר אל תוך קליפת המוח הפנימית באמצעות סכילה עם להב עגול בגודל 15. חשוב לבחור רק את אותן פרוסות בעלות ארכיטקטורה תאית תקינה שבודדו מהחלק המרכזי של ההיפוקמפוס, בין ההיפוקמפוס הדורסלי לוונטרלי.
יש להשליך מיד OHSCs באיכות נמוכה. העבירו שתיים עד שלוש מהפרוסות שהתקבלו לתוך תבנית תרבית תאים (cell culture insert) בעלת גודל נקבים של 0.4 micrometer. שאבו את מצע ההכנה מהחלק העליון של תבנית תרבית התאים באמצעות פיפטת פסטור.
הניחו את ה-insert בצלחת תרבית בעלת שישה בארות המכילה 1 millimeter של תרבית ביעוז לכל באר. דגרו את הצלחות בעלות ששת הבארות בטמפרטורה של 35 degrees Celsius באטמוספירה בלחות מלאה עם 5%CO2, והחליפו את תרבית התאים מדי יומיים. לאחר שישה ימי תרבית עבור רקמת חולדה (rat), או 14 ימים עבור רקמת עכבר (murine), התגובות הדלקתיות הקשורות להליך הפריסה עצמו נעלמות.
כעת ניתן לבצע את הניסויים. תוצאות מייצגות למחקרי נוירופרוטקציה (הגנה עצבית). חלק א' של התמונה מציג פרוסות OHSC ללא נגע, שנשמרו במצע תרבית למשך תשעה ימים in vitro ללא טיפול כלשהו, המשמשות כפרוסות ביקורת.
כפי שאושר באמצעות מיקרוסקופיית סריקה בלייזר קונפוקאלית, קבוצת הביקורת של OHSC הראתה שימור עצבי טוב. תאי מיקרוגליה חיוביים ל-Isolectin B4 היו ממוקמים בעיקר בשכבות המולקולרית והפלקסיפורמית והפגינו פנוטיפ מסועף. בשכבת התאים הגרנולריים של הגיירוס הדנטט (dentate gyrus), נמצאו רק תאי מיקרוגליה בודדים חיוביים ל-Isolectin B4 וכמעט ולא נמצאו גרעינים חיוביים ל-Propidium Iodide.
סט נוסף של OHSC, המוצג בחלק B של התמונה, הוחזק במצע תרבית למשך שישה ימים, עבר פגיעה (lesion) באמצעות 50 µM NMDA למשך ארבע שעות, והוחזק שוב במצע תרבית למשך שלושה ימים נוספים. לאחר הפגיעה ב-NMDA, נצפתה הצטברות מאסיבית של תאי מיקרוגליה מופעלים חיוביים ל-Isolectin B4 שנדבקו לאתר הפגיעה הנורונלית, בכל שכבות ה-dentate gyrus.
ניתוח כמותי גילה כי בשכבה הגרנולרית של הגיירוס הדנטאט, מספר תאי המיקרוגליה החיוביים ל-Isolectin B4 היה גבוה יותר ב-OHSC פגוע בהשוואה לתנאי הביקורת. באופן דומה, מספר הנוירונים הניווניים החיוביים ל-Propidium Iodide היה מוגבר משמעותית בשכבה הגרנולרית של פרוסות פגועות ב-NMDA. תוצאות לדגימה עבור מחקרי פלישת גידולים.
כל התמונות מציגות תוצאות של פלישת גידול SS באמצעות OHSC שצולמו במיקרוסקופ סריקה לייזר קונפוקאלי. צבע אדום מסמן את הציטו-ארכיטקטורה של ה-OHSC ותאי גידול מסומנים בירוק. תמונה A מראה דפוס פלישה טיפוסי של תאי גליובלסטומה U138 שהושארו לפלוש במשך ארבעה ימים.
ניתן להבחין בגידולים כדוריים, ברורים ומובחנים, ומבנה ה-OHSC נראה שלם עם dentate gyrus ו-Cornu Ammonis הנראים בבירור. תמונה B מראה דפוס פלישה שונה, שנוצר על ידי תאי גליובלסטומה LN229 לאחר ארבעה ימים. במקרה זה, לא ניתן להבחין בבירור בגידולים בודדים בשל הרשת שנוצרה המכסה את רוב ה-OHSC, אף על פי שהציטו-ארכיטקטורה נותרת שלמה עם dentate gyrus ו-Cornu Ammonis שאינם מעוותים.
יתרה מכך, ניתן להסיק שתאי LN229 פולשניים יותר מתאי U138. תמונות C ו-D מציגות את אותה תוצאת פלישת גידול עבור תאי LN229 לאחר ארבעה ימי פלישה. בצד שמאל ניתן להבחין כי מסת הגידול מכסה כמעט את כל שדה הראייה.
תמונה D מציגה את צביעת ה-Propidium Iodide התואמת. בפריסה זו, הארכיטקטורה התאית אינה שלמה יותר, שכן ה-Cornu Ammonis אינו נראה יותר וה-dentate gyrus מעוות גם הוא. סיבה אפשרית לתוצאה כזו עשויה להיות OHSC שלא היה שלם לחלוטין בתחילת הניסוי, מספר גבוה מדי של תאי גידול שהוחדרו, או זמן פלישה ארוך מדי שהוביל לאובדן המבנה שנצפה.
לפיכך, תוצאות פלישה מסוג זה צריכות להיפסול. תרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות מהוות מודל in vitro מצוין המשקף את פיזיולוגיית המוח עם קשרים עצביים שלמים. כמודל אחד, ניתן להפיק מספר תרביות של פרוסות, מה שמאפשר לבחון תנאים מרובים ברקמה מבעל חיים אחד, והתוצאות הן בעלות שחזוריות גבוהה.
בשל רמת הנגישות הגבוהה, תרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות מתאימות באופן מצוין למגוון רחב של סוגי ניסויים. אלו כוללים מחקרים אלקטרופיזיולוגיים ומחקרי נוירוגנזה, אך גם ניסויים בנוירופרוטקציה, פלישת גידולים ואינטראקציות של תאי גידול עם רקמת מוח בריאה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
תרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות (OHSC) הן מודל in vitro יעיל המדמה באופן הדוק תנאי in vivo. מאמר זה מפרט פרוטוקול המבוסס על שימוש בויברטום להפקת פרוסות באיכות גבוהה, שניתן להשתמש בהן להערכת השפעות נוירו-פרוטקטיביות של תרכובות חדשות או להתבוננות בהתנהגות של תאי גידול.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- פרמקולוגיה
רקע
- תרביות אורגנוטיפיות מספקות מודל רלוונטי לחקר רקמת מוח.
- הכנה איכותית של פרוסות היא קריטית לדיוק ניסיוני.
- חיתוך באמצעות ויברטום מאפשר קבלת חתכי רקמה מדויקים ועקביים.
- ניתן להשתמש בפרוסות אלו להערכת תופעות ביולוגיות שונות.
מטרת המחקר
- לשכלול טכניקת החיתוך לצורך שיפור איכות הרקמה.
- להקל על מחקרים בנושאי נוירופרוטקציה וביולוגיה של גידולים.
- לספק שיטה מהימנה להשגת פרוסות אורגנוטיפיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת בלוקי אגאר לייצוב המוח.
- שימוש במכשירים שעברו עיקור באוטוקלאב למניעת זיהום.
- הוצאה זהירה של המוח והנחתו בתווך הכנה.
- שימוש בדבק ציאנואקרילט (Cyanoacrylate) רפואי לקיבוע הפרוסות.
תוצאות עיקריות
- טכניקת פריסה משופרת מניבה פרוסות אורגנוטיפיות באיכות גבוהה.
- הפרוטוקול ממזער את סיכוני הזיהום במהלך ההכנה.
- מסייע בהערכה של חומרים נוירו-פרוטקטיביים.
- משפר את ההבנה של התנהגות תאי גידול ברקמת מוח.
מסקנות
- הפרוטוקול המבוסס על ויברטום יעיל להכנת פרוסות.
- ניתן להשתמש ב-OHSC באופן מהימן עבור יישומים ניסויים שונים.
- מחקרים עתידיים יכולים להסתמך על שיטה זו כדי לחקור נוירופרוטקציה וביולוגיה של גידולים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למקבלי החלטות
תרביות של פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות (OHSC) מספקות מודל in vitro רלוונטי פיזיולוגית להערכת תרכובות נוירופרוטקטיביות ופולשנות של תאי גידול, תוך שימור המבנה המקורי של ההיפוקמפוס והקישוריות העצבית. מודל זה מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית עבור מועמדים טיפוליים על ידי מתן אפשרות לתצפית ישירה על השפעות התרופה על אינטראקציות נוירון-גליה ועל דינמיקה של רקמת מוח-גידול תחת תנאים מבוקרים. היכולת להפיק מספר פרוסות מבעל חיים בודד תומכת בסריקה הדירה (reproducible) תחת תנאים מרובים, המסייעת בקבלת החלטות מוקדמות של המשכה או הפסקתו של הפיתוח (go/no-go) בנתיבי גילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ניטור נוירופרוטקציה ופלישת גידולים ברשתות עצביות שלמות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מדדים כמותיים, כגון אקטיבציה של מיקרוגליה וסמנים של דגנרציה עצבית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לסריקת תרכובות בהמשך, תוך שימור הציטו-ארכיטקטורה והפעילות האלקטרופיזיולוגית.
- ערך תפעולי: שיפור הסטנדרטיזציה והשחזוריות של הבדיקה באמצעות עובי פרוסות ותנאי תרבית עקביים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על מיקרו-מבנה של ההיפוקמפוס הרלוונטי למחלה לצורך מידול פתופיזיולוגיה של מערכת העצבים המרכזית ותגובה טיפולית.
- ערך תפעולי: מקדם המשכיות תרגומית על ידי מתן אפשרות לניטור אורך של השפעות נוירו-פרוטקטיביות ואנטי-אינוואזיביות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
OHSC מגשרים בין שלבי הגילוי המוקדמים להערכה הפרה-קלינית על ידי אספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה להערכת יעילות נוירופרוטקטיבית ותכונות אנטי-אינוואזיביות של סוכנים המכוונים לגידולים, לפני ביצוע מחקרים in vivo.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): תומך בבדיקת השערות לגבי מנגנונים נוירופרוטקטיביים ואנטי-גידוליים במערכת בעלת הקשר פיזיולוגי.
- סריקה (Screening): מספק תוצרי קריאה כמותיים מבוססי דימוי להשוואת תרכובות תחת תנאי ניסוי מרובים.
- אנליטיקה (Analytics): מאפשר ניתוח סטטיסטי של הפעלת מיקרוגליה, הישרדות נוירונלית ודפוסי חדירות גידולים כדי להסיק על קשרי מבנה-פעילות (SAR).
- מחקר תרגומי (Translational Research): עולה בקנה אחד עם תיקוף פרה-קליני באמצעות מידול של אינטראקציות ברקמות מוח רלוונטיות לבני אדם ושל שלמות המחסום.
- שימוש חוזר ארגוני (Enterprise Reuse): משמש כפלטפורמה רב-פעמית לבדיקה איטרטיבית של מודליות טיפוליות מגוונות לאורך קמפיינים של גילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במחקרי נוירופרוטקציה ופלישת גידולים.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה והיכולת להרחבה (scalability) באמצעות פרוטוקולים שחזירים להפקת פרוסות ולתרבית.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לבדיקת מספר תנאים לכל בעל חיים והפחתת ההסתמכות על מודלים in vivo.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של מועמדים לתרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS) ולאונקולוגיה, בהתבסס על מעורבות המטרה ותוצאות פנוטיפיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהכנת רקמות, חיתוך באמצעות ויברטום (vibratome) וטכניקות תרביות סטריליות.
- תלוי בגישה לוויברטום, לכלים סטריליים ולסביבות דגירה מבוקרות (35°C, 5% CO2).
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הערכת איכות הפרוסות ושל פרוטוקולי הדימוג לצורך פרשנות עקבית של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום המודל על מינים שונים (חולדה לעומת עכבר) או על שורות תאי גידול בעלות רמות פלישה שונות.
- מוגבל בשל היעדר מרכיבים כליים וחיסוניים, דבר העשוי להשפיע על מידול של תהליכים נוירו-דלקתיים התלויים בגיוס תאי מערכת חיסון פריפריים.
