פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

המטרה הכוללת של פרוטוקול תרבית תאים מהיר זה לאחר המוות היא ליצור תרביות תאים עמידות שמקורן בחולה של גליומה פונטינית פנימית מפוזרת כדי להקל על הניסויים הדרושים להבנה ובסופו של דבר לפיתוח טיפולים יעילים ל-DIPG. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי הביולוגיה הבסיסית והאסטרטגיות הטיפוליות לגליומה פונטינית פנימית מפוזרת, כגון האם תרופות מסוימות פועלות על פני תרביות שונות שמקורן במטופלים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לימוד ישיר של הביולוגיה של תאים שמקורם בחולה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול ב-DIPG, מכיוון שהיא מאפשרת בדיקה של אסטרטגיות טיפוליות שונות על פני תת-סוגים גנטיים שונים של המחלה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי DIPG, ניתן ליישם אותה גם על מחלות אחרות, כגון גליומות אחרות בדרגה גבוהה בילדים, גליובלסטומה במבוגרים או גידולים אחרים של מערכת העצבים המרכזית. בדרך כלל, אנשים חדשים בטכניקה זו יתקשו, מכיוון שקשה להשיג ולעבד במהירות דגימות נתיחה שלאחר המוות בצורה יעילה.

לפני הכנת הדגימה, יש לעקר את מכסה המנוע של תרבית הרקמה, יחד עם סכיני גילוח, המוסטטים מעוקלים וכלים לא סטריליים אחרים תחת אור ה-UV למשך שעה, ולבצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לתבנית תרבית תאים בעלת קירות גבוהים בגודל 100 מילימטר על 20 מילימטר. הסר את המדיה שנותרה מהמשלוח והחלף אותה ב-10 עד 15 מיליליטר של מדיה בתרבית קרה.

לאחר מכן, בעזרת ההמוסטטים המעוקלים כדי לתפוס סכין גילוח, טחנו את הרקמה דק תוך הסרת כלי הדם או קרומי המוח. שברי הרקמה הסופיים צריכים להיות קטנים ממילימטר אחד. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לצינור חרוטי נקי של 50 מיליליטר.

שוטפים את צלחת תרבית התאים עם חמישה מיליליטר נוספים של אמצעי תרבית קרה ומעבירים את הדגימה לצינור החרוטי. חזור על שלב כביסה זה לפי הצורך כדי להעביר את הרקמה שנותרה. בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, יש לשלש את הדגימה בעדינות במשך ארבע עד חמש פעמים.

אפשר לשברי רקמות גדולים יותר להתיישב בתחתית הצינור. במידת הצורך, צנטריפוגה קצרה את הדגימה למשך דקה אחת. כדי לאסוף את השבר המנותק, הסר את הסופרנטנט וסינן דרך מסנן של 100 מיקרון לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר שכותרתו דיסוציאציה מכנית.

הפוך את המסנן מעל הצינור החרוטי המקורי ושטוף אותו במצע תרבית כדי לשחזר את שברי הרקמה. לאחר מכן, צנטריפוגה את שבר הדיסוציאציה המכני למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט משבר הדיסוציאציה המכני הגלולי והשהה מחדש את הרקמה במצע תרבית קרה.

אם יש יותר מחמישה מיליליטר של רקמה בצינור החרוטי של הדיסוציאציה המכנית, פצל את הרקמה לצינורות חרוטיים אחרים של 50 מיליליטר כך שלאף צינור אין יותר מחמישה מיליליטר רקמה. לאחר מכן, אחסן את השבר המנותק מכנית על קרח עד לשלב הצנטריפוגה של שיפוע סוכרוז. בהליך זה, צנטריפוגה את הצינור החרוטי המכיל את שברי הרקמה הנותרים למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והוסף את תמיסת העיכול האנזימטית המחוממת מראש, כך שיש חמישה מיליליטר תמיסת עיכול לכל מיליליטר רקמה. לאחר מכן, אטמו את מכסה הצינור החרוטי בסרט מעבדה ודגרו את התגובה על מסובב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, יש לשלש את הדגימות בעדינות.

בעזרת פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, פיפטה למעלה ולמטה במשך שש עד שמונה פעמים, והימנע מיצירת בועות אוויר מוגזמות. לאחר מכן, הוסיפו קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר לקצה הפיפטה וטריטו את הדגימה במשך שש עד שמונה פעמים נוספות. אפשר לכל הנתחים שנותרו להתיישב בתחתית הצינור.

לאחר מכן, הסר וסנן את הסופרנטנט כשהתאים עדיין תלויים דרך מסנן של 100 מיקרון לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר שכותרתו Enzymatic Dissociation ואחסן אותו על קרח. לאחר מכן, צנטריפוגה את צינור הדיסוציאציה האנזימטית למשך חמש דקות, והמשך לצנטריפוגה בשיפוע סוכרוז. אם הדגימה עדיין תלויה בתמיסה, צנטריפוגה אותה למשך חמש דקות.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הרקמה ב -20 מיליליטר HBSS קר ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, העלו את הנפח ל -25 מיליליטר עם HBSS קר. מוסיפים לאט לאט 25 מיליליטר של תמיסת סוכרוז מולרית 1.8, והופכים את הצינור לערבוב.

התוצאה היא שיפוע סוכרוז מולארי של 0.9. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ללא הפסקה למשך 10 דקות. שאפו בזהירות את שאריות המיאלין בתמיסת סוכרוז כמה שיותר.

לאחר מכן, שטפו את הדגימה על ידי הוספת 30 מיליליטר HBSS קר ללא סידן ומגנזיום, וערבוב עדין. לאחר מכן, צנטריפוגה למשך חמש דקות. בהליך זה, הסר את חומר הכביסה.

הוסף חמישה מיליליטר של מאגר ליזה ACK, והשהה מחדש בעדינות את גלולת התא, וסובב את הצינור למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הרוו את הליזיס על ידי הוספת 30 מיליליטר HBSS קר ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, צנטריפוגה אותו למשך חמש דקות.

השעו מחדש את כדור התא הסופי ב-10 עד 15 מיליליטר של TSM שלם חם עם גורמי גדילה, וכמתו את צפיפות התאים הקיימא על המוציטומטר, באמצעות אי הכללה כחולה של טריפאן. לאחר מכן, העבר את תרחיף התאים הסופי לבקבוק תרבית T75 חדש. הוסף גורמי גדילה נוספים כל יומיים כדי לשמור על רמות גורמי הגדילה הכוללות, ולעקוב אחר התפתחות נוירוספרות של תאי גידול.

להלן דוגמאות שונות לאופן שבו הדגימות יכולות להופיע מהשלבים המוקדמים של התרבות לתרבית עמידה. בתחילה, נראה כי תרביות מצופות ומוקדמות לרוב אינן מכילות תאים רבים ששרדו. יתר על כן, אשכולות תאים מוקדמים לרוב אינם מציגים את מידת הניגודיות הקשורה בדרך כלל לנוירוספרות.

עם זאת, המעבר הראשוני של אשכולות תאים אלה, בשילוב עם סינון הפוך של אשכולות תאים, יכול לבודד תאי גידול בריאים המסוגלים ליצור כדורים. המסנן מכיל בדרך כלל שאריות פסולת. לאחר מכן ניתן לשמור דגימות אלה שמקורן במטופל בתרבית למספר מעברים.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש עד ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לוודא שהדגימה נשמרת בטמפרטורה קרה בכל שלב מלבד הדיסוציאציה האנזימטית, ולמזער את הטיפול הטראומטי בדגימה. לאחר הליך זה, ניתן לבצע מחקרים נוספים, כגון בדיקת תרופות במבחנה, או קסנוגרפטינג אורתוטופי, כדי לענות על שאלות עוקבות על פתוביולוגיה של DIPG.

לאחר פיתוחה, טכניקת תרבית זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הנוירו-אונקולוגיה של ילדים לחקור אפיקים טיפוליים חדשים לילדים עם DIPG. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד לבצע פרוטוקולים מהירים של תרבית תאים לאחר המוות על דגימות גידול במוח. אל תשכח שעבודה עם רקמות אנושיות עלולה להיות מסוכנת, ותמיד יש להשתמש באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי וטכניקה סטרילית.