Name: פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: למד פרוטוקול לתרבית תאים ראפיד פוסט מורטם של גליומה פונטינית מפוזרת עצמית (DIPG). שיטה זו מאפשרת יצירת תרביות תאים נגזרות מחולים לחקר ביולוגיית הגידול ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים בתודה להכיר תמיכה מקרן מק&#39;קנה קלייר, המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ (NINDS K08NS070926 ו R01NS092597), משרד ההגנה (NF140075), קליפורניה מכון לרפואת הרגנרציה (CIRM RB4-06093 ו RN3-06510), הלימונדה של אלכס סטנד Foundation, The Cure מתחיל עכשיו קרן DIPG שיתופית, Lyla נסולי קרן, לפענח סרטן ילדים, קרן גידול ילדות המוח, מתיו לארסון קרן, קרן V, גודפרי קרן משפחת לזכרו של פיונה פנלופה, קרן DIPG Wayland וילאר, דילן Jewett , קונור ג&#39;ונסון, זואי גאנש, דילן פריק, אביגיל ג&#39;נסן, והקרנות הזיכרון ג&#39;ניפר קרנץ, קרן N8, וירג&#39;יניה ו DK לודוויג קרן לחקר הסרטן, המכון לחקר בריאות הילד בסטנפורד אן ט ורוברט מ בס הפקולטה נתרמו מלגות Pediatric מחלות סרטן הדם.

פרוטוקול זה בוצע באישור ועדת הבדיקה המוסדית שלנו עם זיהוי-דה המתאים של כל הנתונים המטופלים ובהתאם לכל מוסדיים, לאומיים, והכללים בינלאומיים עבור רווחת אדם. השג כל אישור הדירקטוריון סקירה מוסדי מתאים והסכמתם ממשפחת החולה לפני עבודה עם פרוטוקול זה. 1. קבלת דגימות רקמה הערה: רכיב קריטי של פרוטוקול זה דורש טיפול הנאות של תרומת הרקמות החלה מייד בעת הנתיחה. הכדאיות המדגמת תלויה באופן משמעותי על מזעור המרווח פוסט-מורטם (PMI), מייד להעביר את הרקמה לתוך המדיום הקר המתאים בתוספת אנטיביוטיקה / antimycotics, לשמירת הדגימה על קרח רטוב לאורך תחבורה, ושמירת טכניקה סטרילית ברחבי הפרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ההודעהשל תרומה ממשמשת ובאה, להכין ערכת אוסף מדגם. באמצעות תיבת משלוח עם מכל מבודד, שניתן להשתמש בם ישירות לתחבורת חזרת דגימת הרקמה, כוללים את החומרים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוללים חומרים להכנת סטרילי, כולל כפפות סטריליות, וילונות, ניתוחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלול 8 - 10 צינורות חרוטי סטרילי 50 מיליליטר המכילים 30 תקשורת משלוח מיליליטר במכל המבודד עם קרח או חבילות קרות. הערה: למרות כל אמצעי תקשורת תרבית תאים סטנדרטי יכול לעבוד, את כדאיות המדגם הטובה ביותר מתקבלת עם Hibernate-A בתוספת אנטיביוטיקה / antimycotic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפד לכלול את כל דוגמיות נוספות עבור ניתוחים אחרים (למשל, fixatives). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הנתיחה לא תבוצע על אתר החוקר, כולל מסמך קובע בבירור כיצד לאסוף את דגימת הגידול. זה כולל פרטים כגון שמירה על סטריליות, שמירה דוגמיות על קרח רטוב, וכולל דגימות מן המוח התיכון ומדולה כמו tuמור תאים לעתים קרובות לפלוש לאזורים אלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על סטריליות במהלך הנתיחה. קח למשל את המוח סטרילי בתוך הגולגולת, כך להתבונן טכניקה סטרילית (לרבות כפפות שינוי) פעם הגולגולת פתוחה. הימנעות זיהום עם עור ושיער היא קריטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את הגידול מן הצד הגחוני ( &quot;הבטן&quot; של פונס, לראות משלימה איור 1). עם אזמל סטרילי, לחתוך לחתיכות קטנות 1 סנטימטר מן הגידול ומייד להעביר לתוך תקשורת משלוח קרה (ראה הערה בשלב 1.1.2) ולשים על קרח רטוב. מקום 10 מ&quot;ל של רקמה לתוך צינור אחד, וכתוצאה מכך נפח סופי של רקמות התקשורת בצינור אחד של 40 מ&quot;ל. הערה: במקרה של DIPG, הגידול מתפזר מחלחלת פונס ולעתים קרובות שאר המוח. ככזה, לאסוף כמה שיותר מדגם ככל האפשר, בדרך כלל כולל 3 - 4 צינורות (30 - 40 רקמות מ&quot;ל) מ פונס 1 - 2 צינורות (10 - 20 רקמות מ&quot;ל) כל מ המוח התיכון ומדולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף סםPles מן המוח התיכון ומדולה חופף אל פונס, אשר בדרך כלל מכיל תאים סרטניים רבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף דגימה, לשלוח את דגימות O / N על קרח רטוב במיכל מבודד. לא עושה משלוחים המדגמים על קרח יבש, כמו הקפאה תהרוג את התאים. </li></ol> 2. הכנה עבור עיבוד מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת הכנת מדגם, לעקר ברדסים בתרבית רקמה יחד עם סכיני גילוח, hemostats המעוקל, וכל כלי שאינו סטרילי אחר תחת אור UV במשך שעה 1. בצע את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים על מנת למנוע זיהום של תרבויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן ופתרונות סינון סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין 1.8 M תמיסת סוכרוז, לפזר סוכרוז 308.07 גרם 300 מ&quot;ל מים מזוקקים. הוסף 50 מ&quot;ל 10x Hank&#39;s שנאגרו תמיסת מלח (HBSS) ללא סידן או מגנזיום ולהביא הנפח הכולל עד 500 מ&quot;ל באמצעות מים מזוקקים. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין פתרון עיכול אנזימטי, לקחת 50 מ&quot;ל HBSS עם סידן ומגנזיום על כל 10 מ&quot;ל של רקמות טחון ולהוסיף 500 μL 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל deoxyribonuclease אני (מיקרוגרם 50 לריכוז סופי / מ&quot;ל), 500 μL 2.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל collagenase I / II פתרון dispase (הריכוז הסופי 25 מיקרוגרם / מ&quot;ל), ו -500 μL 1 M HEPES חיץ. פתרון העיכול Prewarm באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין התקשורת גזע סרטניים (TSM) בסיס, לערבב 250 מ&quot;ל Neurobasal-A, 250 בינוני הנשר שונה של מ&quot;ל Dulbecco: F12 תערובת מזון (DMEM / F12), 5 אנטיביוטיקה antimycotic 100x מ&quot;ל, 5 מ&quot;ל 200 מ&quot;מ L- alanyl-L- dipeptide גלוטמין (Glutamax-A), 5 חיץ מ&quot;ל HEPES, 5 פירובט נתרן מ&quot;ל 100 מ&quot;מ, ו -5 חומצות אמינו מ&quot;ל 100x MEM שאינם חיוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין מלא TSM עם גורמי גדילה, להוסיף התוספים הבאים לבסיס TSM: 50x B27 מוסף מינוס ויטמין A (1:50), גורם גדילה באפידרמיס אדם (H-EGF, 20 ng / mL), פקטור גדילה אנושי פיברובלסטים (H- FGF, 20 ng / mL), AA גורם הגדילה טסיות הנגזרות האנושי (H-PDGF-AA, 10 ng / mL),טסיות הנגזרות האנושי Growth Factor BB (H-PDGF-BB, 10 ng / mL), והפתרון הפרין (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool בצנטריפוגה מעבדה מצוידת עם הרוטור מתנדנד דלי ל- C ° 4. </li></ol> 3. ניתוק מכני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמה לתוך צלחת תרבית תאים גבוהה מוקפת חומה 100 מ&quot;מ x 20 מ&quot;מ. הסר שאריות מדיה המשלוח ולהחליף עם 10 - 15 מיליליטר תקשורת והתרבות קרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות hemostats מעוקל לתפוס סכין גילוח, לקצץ את הרקמה דקה תוך הסרת כלי או קרומי מוח דם ברורים. הערה: שברי רקמות הסופי צריך להיות קטן מ -1 מ&quot;מ (ראה איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת רקמה לתוך צינור 50 מ&quot;ל חרוטי נקי. שטוף את צלחת תרבית תאים עם תקשורת והתרבות קרה נוספת 5 מיליליטר ולהעביר צינור החרוטים. חזור על שלב זה לשטוף לפי הצורך להעביר רקמה נותרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet 10 מ&quot;ל סרולוגית, triturate בעדינות (4 - 5 פעמים). אפשר Tiss גדולשברי ue כדי ליישב לתחתית של התחתית. במידת הצורך, צנטריפוגות מדגם בקצרה דקות 1 (350 XG, 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את שבריר ניתק מכנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולסנן אותה דרך פילטר 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ&quot;ל שכותרתו &quot;ניתוק מכני.&quot; הפוך את המסנן מעל צינור החרוטים המקורי ולשטוף עם תקשורת והתרבות להתאושש שברי רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה שבר &quot;ניתוק מכני&quot; במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant מן שבר pelleted &quot;הניתוק המכאני&quot; ו resuspend הרקמות בתקשורת התרבות הקרה. אם יש יותר מ 5 מ&quot;ל של רקמת בצינור חרוטי &quot;ניתוק מכני&quot;, לפצל את הרקמה לתוך צינורות חרוטי אחרים 50 מ&quot;ל כך אין צינור יותר מ -5 רקמות מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את השבר המכאני ניתק על קרח עד שלב צנטריפוגה שיפוע סוכרוז (Steעמ &#39;5). לחלופין, את החלק היחסי ניתק מכנית יכול להמשיך לשלב 5 במהלך תקופת הדגירה דיסוציאציה האנזימטית (שלב 4.4). </li></ol> 4. אנזימתי דיסוציאציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש יותר מ 5 מיליליטר של רקמה בצינור המכיל שברי הרקמה הנותרים הגדולים, לפצל את הרקמה לתוך צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל חדשים אחרים כגון שאין לו צינור יותר מ -5 רקמות מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינור חרוטי (ים) המכיל את שברי הרקמה הנותרת במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולהוסיף הפתרון עיכול אנזימטי prewarmed, כך שיש פתרון העיכול מ&quot;ל 5 עבור 1 בכל רקמות מ&quot;ל (למשל, 25 פתרון העיכול מ&quot;ל במשך 5 רקמות מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את עפעפי צינור חרוטים עם סרט מעבדת דגירת התגובה על כתף על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, triturate דגימות בעדינות (ראה תרשים 1C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet 10 מ&quot;ל סרולוגית,pipet למעלה ולמטה מדגם 6 - 8 פעמים. למנוע יצירת בועות אוויר חריגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת טיפ pipet 1,000 μL עד הסוף של pipet ו triturate 6 נוסף - פעמים 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר כל גושים נותרים כדי ליישב לתחתית של התחתית. הסר ולסנן את supernatant עם התאים עדיין מושעה דרך פילטר 100 מיקרומטר לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ&quot;ל שכותרתו &quot;דיסוציאציה אנזימתי&quot; ולאחסן על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם שברי הרקמה משמעותי להישאר, להוסיף תוספת של 10 מ&quot;ל HBSS עם סידן ומגנזיום כדי שברי וחזור על שלבים 3.5.1 ו 3.5.2. סנן הפתרון הסופי הזה דרך פילטר 100 מיקרומטר לתוך הצינור &quot;דיסוציאציה אנזימתי&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור &quot;אנזימתי דיסוציאציה&quot; במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C) ולהמשיך צנטריפוגה שיפוע סוכרוז. </li></ol> 5. סוכרוז Gradient צנטריפוגה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות עדיין מושעים בתמיסה, centrifuGE במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת רקמה supernatant ו resuspend ב 20 מ&quot;ל HBSS קר ללא סידן ומגנזיום. להעלות נפח 25 מ&quot;ל סה&quot;כ עם HBSS קר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף 25 מ&quot;ל 1.8 M פתרון סוכרוז להפוך את הצינור לערבב. התוצאה היא שיפוע סוכרוז 0.9 M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ללא בלם במשך 10 דקות (800 XG, 4 ° C). באמצעות בלם צנטריפוגה ישבש את שיפוע ולהפחית תשואה (ראה איור 1D עבור דוגמה מדגם לפני ואחרי צנטריפוגה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב פסולת המיאלין תמיסת סוכרוז ככל האפשר. לשטוף את המדגם על ידי הוספת 30 מ&quot;ל HBSS קר ללא סידן ומגנזיום ערבוב בעדינות. צנטריפוגה במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C). </li></ol> 6. תמוגה תא ACK אדום דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant לשטוף. הוסף 5 מ&quot;ל חיץ ACK תמוגה בעדינות resuspend התא גלולה, מתערבל הצינור דקות 1 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את lיסיס על ידי הוספת 30 מ&quot;ל HBSS קר ללא סידן ומגנזיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 5 דקות (350 XG, 4 ° C). </li></ol> 7. תחזוקת תרבות ראשונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את כדורי התא האחרונים 10 - 15 מיליליטר החם מלא TSM עם גורמי גדילה ולכמת צפיפות תאי קיימא על hemocytometer באמצעות הרחקת trypan כחולה. הערה: הטווח של תאי קיימא משתנה מאוד בהתאם לנסיבות של תרומת הרקמות, וכימות יכול להיות קשה בשלב זה מוקדם בשל פסולת הסלולר שאריות. בשנת מקרה אידיאלי, שואף להיות ממיליון תאי חיים לדגימה. במקרים בהם פסולת מוגזם נשאר, צלחת בצפיפות נמוכה בבקבוק T175. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את מתלי תא הסופיים בקבוק תרבות T75 חדש. ספייק בגורמי גדילה נוספת כל יומיים כדי לשמור על רמות גורם הצמיחה הכוללת, ולפקח לפיתוח neurospheres תאים סרטניים (ראה איור 1E ואיור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">לחלופין, תהליך ניתק enzymatically תאים לניתוח נוסף, כולל זרימת cytometry ומיון תאים המופעל הקרינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפיתוח של neurospheres (אשר בממוצע לוקח 3 - 4 שבועות, אך נע בין כמה ימים כדי עוד 2 חודשים), הפוך מסננת המדגם באמצעות מסנן רשת ניילון 100 מיקרומטר להפחית את כמות הפסולת. הערה: התסנין צריך להישמר בתרבות במקרה תאים בודדים קיימא או כדורים קטנים נוכחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על טוהר המידות ועל טוהר התרבות על ידי ביצוע DNA טביעת אצבעות תוך passaging, בהשוואת מדגם המטופלים הראשוני. </li></ol>

<ol><li>Fisher, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinicopathologic+reappraisal+of+brain+stem+tumor+classification.+Identification+of+pilocystic+astrocytoma+and+fibrillary+astrocytoma+as+distinct+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">A clinicopathologic reappraisal of brain stem tumor classification. Identification of pilocystic astrocytoma and fibrillary astrocytoma as distinct entities.</a> Cancer. 89 (7), 1569-1576 (2000).</li>
<li>Johung, T. B., Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma%3A+New+Pathophysiological+Insights+and+Emerging+Therapeutic%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Diffuse Intrinsic Pontine Glioma: New Pathophysiological Insights and Emerging Therapeutic.</a> Curr. Neuropharmacol. , (2016).</li>
<li>Cage, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feasibility%2C+safety%2C+and+indications+for+surgical+biopsy+of+intrinsic+brainstem+tumors+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Feasibility, safety, and indications for surgical biopsy of intrinsic brainstem tumors in children.</a> Child Nerv. Syst. 29 (8), 1313-1319 (2013).</li>
<li>Puget, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biopsy+in+a+series+of+130+pediatric+diffuse+intrinsic+Pontine+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Nerv.+Syst%22%5BJournal%5D)">Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic Pontine gliomas.</a> Child Nerv. Syst. 31 (10), 1773-1780 (2015).</li>
<li>Kieran, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+to+rethink+the+unthinkable%3A+Upfront+biopsy+of+children+with+newly+diagnosed+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+%28DIPG%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Blood+Cancer%22%5BJournal%5D)">Time to rethink the unthinkable: Upfront biopsy of children with newly diagnosed diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG).</a> Pediatr. Blood Cancer. 62 (1), 3-4 (2014).</li>
<li>Sturm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paediatric+and+adult+glioblastoma%3A+multiform+%28epi%29genomic+culprits+emerge%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paediatric and adult glioblastoma: multiform (epi)genomic culprits emerge.</a> Nat. Rev. Cancer. 14 (2), 92-107 (2014).</li>
<li>Jones, C., Baker, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+genetic+and+epigenetic+mechanisms+driving+paediatric+diffuse+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Unique genetic and epigenetic mechanisms driving paediatric diffuse high-grade glioma.</a> Nat. Rev. Cancer. , (2014).</li>
<li>Taylor, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+activating+ACVR1+mutations+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent activating ACVR1 mutations in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 457-461 (2014).</li>
<li>Wu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+landscape+of+diffuse+intrinsic+pontine+glioma+and+pediatric+non-brainstem+high-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 444-450 (2014).</li>
<li>Fontebasso, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recurrent+somatic+mutations+in+ACVR1+in+pediatric+midline+high-grade+astrocytoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Recurrent somatic mutations in ACVR1 in pediatric midline high-grade astrocytoma.</a> Nat. Genet. 46 (5), 462-466 (2014).</li>
<li>Buczkowicz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+diffuse+intrinsic+pontine+gliomas+identifies+three+molecular+subgroups+and+recurrent+activating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of diffuse intrinsic pontine gliomas identifies three molecular subgroups and recurrent activating.</a> Nat. Genet. 46 (5), 451-456 (2014).</li>
<li>Monje, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog-responsive+candidate+cell+of+origin+for+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hedgehog-responsive candidate cell of origin for diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 108 (11), 4453-4458 (2011).</li>
<li>Aoki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+xenograft+mouse+model+of+diffuse+pontine+glioma+designed+for+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">An experimental xenograft mouse model of diffuse pontine glioma designed for therapeutic testing.</a> J. Neuro-Oncol. 108 (1), 29-35 (2012).</li>
<li>Grasso, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+defined+therapeutic+targets+in+diffuse+intrinsic+pontine+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Functionally defined therapeutic targets in diffuse intrinsic pontine glioma.</a> Nat. Med. , 1-10 (2015).</li>
<li>Shu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Orthotopic+Transplantation+of+Fresh+Surgical+Specimen+Preserves+CD133+%2BTumor+Cells+in+Clinically+Relevant+Mouse+Models+of+Medulloblastoma+and+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct Orthotopic Transplantation of Fresh Surgical Specimen Preserves CD133 +Tumor Cells in Clinically Relevant Mouse Models of Medulloblastoma and Glioma.</a> Stem Cells. 26 (6), 1414-1424 (2008).</li>
<li>Becher, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+radiation+and+perifosine+in+a+genetically+and+histologically+accurate+model+of+brainstem+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of radiation and perifosine in a genetically and histologically accurate model of brainstem glioma.</a> Cancer Res. 70 (6), 2548-2557 (2010).</li>
<li>Funato, K., Major, T., Lewis, P. W., Allis, C. D., Tabar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+human+embryonic+stem+cells+to+model+pediatric+gliomas+with+H3.3K27M+histone+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Use of human embryonic stem cells to model pediatric gliomas with H3.3K27M histone mutation.</a> Science. 346 (6216), 1529-1533 (2014).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר שיטה לעיבוד מהיר של תרומות רקמת הגידול שלאחר המוות לפתח בתרביות תאים שמקורם בחולה, אשר ניתן להשתמש בהם במגוון במבחנה או בניסויים vivo. בשל אופיו של עבודה עם דגימות הנתיחה, שמירה על כדאיות מדגם מציבה אתגר משמעותי. מספר גורמים תורמים, כולל מרווח שלאחר המוות לבצע נתיחה או את הזמן הנדרש להובלת רקמות, יש לצמצם ככל האפשר, אך לעתים קרובות קשה לשלוט. מניסיוננו, מרווח שלאחר מוות של פחות מ 6 - 8 שעות (מרגע מות הזמן כי רקמת ממוקם משלוח קרים כקרח ומדיה תחבורה) הניב את הסיכוי הטוב ביותר של הקמת תרבית תאים עמידה. עדיף אז לקבל את הרקמות לבדיקה במעבדה תוך 24 שעות, ו לעבד אותו לתרבות מיד עם קבלתן. מאז המיקום של אלה מקרים נדירים משתנה מאוד, ואיכות הצעד יחזור רקמה מאוד משפיעה על סיכויי הצלחה, הלוגיסטיקה של ביצוע הנתיחה יכולה להיות מאתגרת. במקרים רבים, על מנת להשיג את מסגרת זמן 6-8 שעות, זה לא ריאלי לנהל את קציר הרקמות לעבר מרכז אקדמי. במקום זאת, שיש לשירות שחזור רקמות תורן לשחזר את רקמת הגידול בבית ההלוויות תחת פרוטוקול שאושר IRB הוא לעתים קרובות יותר ומועיל להתאוששות רקמות. קבלת הסכמה מדעת מראש מוות מומלצת ומקל על התכנון הלוגיסטי. הכנת ערכות נתיחה עצמאית עם הוראות ברורות ויסודיות ואספקה ​​סטרילית לאחזור רקמות (כפפות, וילאות, אזמלים) מומלץ בחום. בנוסף, הקמת נקודות ברורות של תקשורת בין החוקר, פתולוג, ואת בית הלוויות היא קריטית. לדוגמה, החוקר צריך לדון פרוטוקול עם הפתולוג לפני הנתיחה ולהאיר שגיאות נפוצות. שגיאות אלה כוללים מיקרוביאל זיהום (בדרך כלל שמרים) במהלך אחזור רקמות, אי הספינה באמצעות משלוח לילה / מזורז וכישלון לשלוח את המדגם על הקרח רטוב מספיק במיכל thermoinsulated. לבסוף, אנו ממליצים להשתמש שירות שליחים מדלת לדלת למשלוח של המדגם כדי לצמצם את זמן ההובלה. טיפול צריך גם לקחת במהלך דיסוציאציה רקמות לשמר כדאיות התא. למשל, השימוש במדים שנועד לשמר בריאות רקמה עצבית לתחבורה (Hibernate-A בתוספת אנטיביוטיקה / antimycotic) יגדיל את הסיכוי של יצירת תרבות מוצלחת. כמו כן, חשוב לשמור על המדגם בטמפרטורה קרה לאורך כל הפרוטוקול תמיד על ידי העברת דגימות קרח. איסוף שני שברי הניתוק מכאניים ו האנזימטית יחד עם מזעור טחינה דק יכול לשפר את הצלחת פרוטוקול, כמו שני השלבים הללו טראומתיים לתאים. מניסיוננו, בעוד תרבויות המצליחים ביותר לצמוח מתוך שני שברים, היו לנו מקרים שבם רק אחד משתי ההכנות הוקם תרבות עמידה, פוטנציאל המשקף את האופי העדין של דגימות אלה. עוד צעד טראומטי בפרוטוקול הוא טחינה דקה; אסטרטגיה אחת שיכול לצמצם את מידת הטחינה הדקה צורך היא להבטיח את הדגימות טחונות ביסודיות ממש בהתחלה של התכשיר. דוגמאות נוספות של היבטים של הפרוטוקול שנועד לשפר את הכדאיות המדגמת כוללות מאגרי הוספה (למשל, HEPES) ברחבי הפרוטוקול, אשר הוא קריטי במיוחד במהלך דיסוציאציה האנזימטית. שינוי אפשרי של פרוטוקול זה להגדיל כדאיויות תא נוסף הוא הסר של הצעד ימס כדוריות הדם אדום ACK. עם זאת, במקרה זה, הוא לעתים קרובות אז יש צורך לבצע צעד תמוגה ACK במהלך השבוע הראשוני בתרבות להסיר תאי דם אדומים. היבט נוסף של פרוטוקול זה שעשוי להיות שונה הוא חיסול המיאלין ופסולת הסלולר באמצעות densit סוכרוזשיפוע y. באופן ספציפי, אסטרטגיות אחרות דווחו לשפר כדאיויות תא של תאי microglial גם אפשריות בשלב זה, כגון שיפוע צפיפות רציף Percoll 18 או חרוזי הסרת המיאלין מגנטיים. לבסוף, המשך בין דיסוציאציה רקמות הראשונית והופעת neurospheres משתנה בין דגימות יכול לקחת בין שבוע לחודש או יותר. מאז התרבויות הראשוניות בדרך כלל מכילות מידה משמעותית של תאים מתים ופסולת הסלולר, זה יכול להיות מאתגר לקבוע אם תאי קיימא להישאר; התרבות צריכה להישמר במשך לפחות 4 - שבועות 8 (איור 2). אסטרטגיה אחת לבידוד תאי גדלים מן ההריסות שנותרו מוצגת כאן (כלומר להפוך סינון צבירי תאים מחדש ציפוי בתקשורת טריה). ההחלטה אם להמשיך לשמור על תרבות היא בסופו של דבר החלטה כל מקרה לגופו בהסתמך על גורמים סביב הדואר נתיחה (למשל, מרווח שלאחר מוות ממושך, בעיות במהלך הובלת רקמות), ניתוק הרקמות (למשל, דם מוגזם או פסולת), ואיך המדגם מופיע בתרבות. ברגע תרבות מוקמת, הזהות צריכה להיות מאומתת על ידי טביעת אצבע DNA באמצעות ניתוח חוזר טנדם קצר או שיטה דומה, השוואת התרבות למדגם של הגידול המקורי נשמר למטרה זו. אנו ממליצים אימות תרבויות באופן שיגרתי על ידי DNA טביעת אצבעות, כדי לוודא ששום זיהום על ידי תרבויות אחרות התרחש, למשל כל 3 - 6 חודשים. הדור של תרבויות DIPG חולה הנגזרת הללו מייצג צעד חשוב בפיתוח המוצלח של טיפולים יעילים. הרחבת תרבויות DIPG נגזר המטופל הזמין ומודלי xenograft תהיה קריטית בזיהוי האסטרטגיות הטיפוליות היעילות ביותר, ובסופו של דבר להתגבר על המחלה הרסנית הזאת.

DIPG הוא ממאירות במערכת עצבים מרכזיות אגרסיביות שעולות פונס הגחון, בדרך כלל במהלך אמצע ילדות 1, 2. למרות עשרות שנים של ניסויים קליניים, הטיפול הנוכחי מוגבל רדיותרפיה, המספקת שיפור זמני או ייצוב של סימפטומים ורק מרחיב הישרדות החציוני בשיעור ממוצע של 3 חודשים. אפילו עם הקרנות, חציון הישרדות כוללת היא רק 9 חודשים עם 90% מהילדים מתים מהמחלה בתוך 2 שנתי אבחנה ראשונית. בגלל אופי infiltrative של גידול ואת הפונקציות הקריטיות של גזע המוח, כריתה כירורגית אינה אפשרית. יתר על כן, בארצות הברית, קבלת ביופסיות כירורגיות עבור DIPG יש היסטוריה לא בוצע 3, כמו ניתוח histopathological אין תפקיד נוכחי המנחה טיפול ואבחון קליניים יכול בדרך כלל להתבצע על ידי הדמייה לבד. לפיכך, על זמינותו של f רקמת הגידולאו מחקר מוגבל, הגבלת מאמצים לערוך מחקר על מולקולות תרופה מועמדות לבין ביולוגית גידול הבסיסית. יש לציין, שיפורי טכניקות הדמייה ו stereotactic אפשרו לפיתוח ביופסיות בטוחות של DIPG בשנים האחרונות 4, אשר, בשילוב עם התקדמות בביולוגיה מולקולרית, שינו את הבנתנו של המחלה. נכון לעכשיו, ניסויים קליניים מרובים באמצעות ביופסית upfront ו פרופיל מולקולרי של DIPG עבור individualizing תוכניות טיפול נמשך (NCT01182350, NCT02274987) 5. DIPG ו גליומות בדרגה גבוהה ילדים אחרות מייצגים מחלות נפרדות מעמיתיהם גליובלסטומה בוגרי 6, 7, ובכך הדגמים ניסיוניים נאמנים של DIPG נחוצים כדי להבין פתופיזיולוגיה ייחודי ולגלות אסטרטגיות טיפוליות יעילות. בשנים האחרונות, התמקד מאמצים להשיג גידול DIPG tנושא למחקר בעת הנתיחה או, פחות נפוץ, ביופסיה חוללה מהפכה בהבנתנו ויכולת ללמוד DIPG. הגנום כולו רצף המאמצים גילה מוטציה חוזר בענפי היסטון H3, 3A המשפחה (H3F3A) ו היסטון אשכול 1, H3b (HIST1H3B), המייצג את הדוגמה הראשונה של מחלות אנושיות נגרמת על ידי מוטציות היסטון קידוד חלבונים 8, 9, 10, 11 . יתר על כן, קבוצת משנה של DIPGs מבטא מוטציות בגן ACVR1, אשר לא דווחו בעבר בסרטן אך זהים מוטציות נמצא ossificans fibrodysplasia הפרעה התפתחותית מולדת הילדות progressiva 8, 9, 10, 11. כמו כן, בתרביות תאי DIPG חולת הנגזרות הראשונות מו xenograft orthotopicdels החברה הוקמו 1, 2, 12, 13, 14, וכן מודלים עכבר הוקמה באמצעות השתלה שלא מבן-מינו ישירה של תאים סרטניים לעכברים immunodeficient כדי ליצור xenografts סדרתי 3, 14, 15. מאמצי הקרנת סמים ראשוניים שהתקבלו בעזרת מודלים חולים נגזר אלו זיהו סוכני רומן מבטיחים לתרגום קליני 4, 14 ו הניחו את היסודות לפחות ניסוי קליני אחד (NCT02717455). הצעדים הראשונים אלה אל הקדמה הם רק ההתחלה, דגימות רקמות מטופל נגזרות רבות ומודלי התרבות תהיינה צורך להגדיר תת סוגים של המחלה ולפתח את האסטרטגיות טיפוליות היעילות ביותר. מנוע גנטימודלי עכבר ered של DIPG יהיו גם להקל מחקרים שמטרתם לקדם את ההבנה הבסיסית שלנו של המחלה. מאמצים שנעשו כדי ליצור מודלים גנטיים DIPG יסתייעו המחקרים גנומי היסוד שנדונו לעיל, אך כיום מספר מצומצם של אפשרויות זמינים. אחד כזה מודל, אשר מייצר גליומות בגזע המוח בדרגה גבוהה דומה היסטולוגית, משתמשת RCAS / tv-נגיפי מערכת לנהוג ביטוי יתר PDGF-B ואובדן Ink4a-ARF בתאים חיובית-nestin ב השקע האחורי של עכברים בילוד 5, 16. גישה נוספת כרוכה משחזרת מוטציות DIPG הקשורים מרכזיים (מוטציה K27M H3.3 היסטון, אובדן p53 ו PDGFRA ההפעלה) בתאים עצביים מבשר שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים, וזה מספיק כדי להבהיר תאים אלה 6 tumorigenic, 7, 17. השילוב של שיטות גנטיות וסבלני-derivמודלי ed ייאפשרו בניסויים פרה-קליניים ולקדם את הפיתוח של טיפולים יעילים. כדי לענות על האתגרים למחקר DIPG שפורט לעיל, פרוטוקול נתיחה מהיר זו פותח כדי ליצור תרביות תאים שמקורם בחולה לחקירה 8, 9, 10, 11, 12, 14. הפרוטוקול נועד להגן על הכדאיות של הרקמות למקסם את הסיכוי של יצירת תרבויות עמידות למרות האתגרים הקשורים במרווחים וזמן תחבורה מורחבים שלאחר מוות. כאשר נוצרו בהצלחה, תרבויות DIPG אלה יכולים לשמש מניפולציות הבאות במבחנה ובניסויי xenograft vivo, המאפשרות הערכה של מולקולות טיפוליות פוטנציאל על תאים שמקורם בחולה.

<table><tbody><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS עם סידן/מגנזיום</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH (קולגנאז/דיספאז)</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה/אנטי-פטריית</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>תוסף B27 מינוס ויטמין A</td><td>גיבקו</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM חומצות אמינו לא חיוניות (100x)</td> <td>גיבקו</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA אנושי</td><td>שננדואה ביוטכנולוגיה</td><td>100-16</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB אנושי</td><td>שננדואה ביוטכנולוגיה</td><td>100-18</td><td></td></tr><tr><td>EGF אנושי</td><td>שננדואה ביוטכנולוגיה</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>אנושי FGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-146</td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל סטריליים</td><td>Bard Paker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>המוסטטים מעוקלים</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>סכיני גילוח</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 מ"מ צלחת תרבית תאים</td><td>קורנינג</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים סטריליים</td><td>TWD Tradewinds</td><td>DF8988-5</td><td></td></tr><tr><td>וילונות סטריליים</td><td>3M</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>כפפות סטריליות</td><td>קימברלי קלארק</td><td>1182307</td><td></td></tr><tr><td>ACK מאגר ליזה</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>מסנן רשת 100 מיקרון</td><td>פישר</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי 50 מ"ל</td><td>פישר</td><td>1495949A</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של glioma pontine המפוזר העצמותי (dipg)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

מפוזר עצמותית Pontine Glioma (DIPG) הוא גידול בגזע המוח בילדות שנושאת פרוגנוזה קטלנית אוניברסלית. בגלל כריתה כירורגית אינה אסטרטגית טיפול קיימא הביופסיה אינה נעשית באופן שיגרתי, את הזמינות של דגימות חולות למחקר מוגבלת. כתוצאה מכך, מאמצים ללמוד את המחלה הזאת כבר לערער על ידי מיעוט של מודלי מחלה נאמנים. כדי לתת מענה לצורך זה, אנו מתארים כאן פרוטוקול לעיבוד המהיר של דגימות רקמת נתיחה שלאחר מוות על מנת ליצור מודלי תרבית תאי חולה נגזרת עמידים שיכול לשמש מבחני חוץ גופייה או in vivo ניסויי xenograft orthotopic. מודלים אלה יכולים לשמש מסך עבור מטרות תרופה פוטנציאל ללמוד תהליכי pathobiological מהותיים בתוך DIPG. פרוטוקול זה ניתן להאריך עוד יותר לנתח לבודד תאים סרטניים microenvironmental באמצעות Cell מופעל קרינת מיון (FACS), המאפשר ניתוח בדיעבד של אקס גןpression, ביטוי חלבון, או שינויים אפיגנטיים של הדנ&quot;א בתא בתפזורת או ברמת תא בודד. לבסוף, פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם כדי ליצור תרבויות נגזרות מטופלות עבור גידולים במערכת עצבים מרכזיים.

הפרוטוקול המתואר הוא לסכם עבודה בן חמישה שלבים עם תמונות של הרקמות בשלבים שונים של עיבוד באיור 1. הדגימה נלקחת ראשונה באמצעות נתיחה סטרילי מהירה. במהלך ניתוק מכני, הרקמה טחון תוך הסרת כלי דם בקרום המוח מן המדגם, ולסנן דרך פילטר רשת ניילון 100 מיקרומטר. שברי הרקמה הנותרים ניתק enzymatically בתנור ההתחממות. לאחר מכן, פסולת מופחת תוך צנטריפוגה שיפוע סוכרוז, לבודד שכבה מובחנת של המיאלין מן המדגם. בנוסף, תמוגה ACK בעליל מקטינה את כמות תאי דם אדומים נוכחיים במדגם. לבסוף, התאים הם מצופים סרום ללא מדיה בתוספת גורמי גדילה. משלימה איור 1 הוא דוגמה של הגידול על הנתיחה. הגידול גדל כמו חדירה מפוזרת של פונסד האזורים הסמוכים של גזע המוח. במהלך ההכנות מדגם, קטן ~ 1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ נתחי יש לחתוך והניח מיד לתוך התקשורת משלוח קר על הקרח. תרשים 2 מציג דוגמאות שונות של איך הדגימות יכולות להופיע החל מהשלבים המוקדמים של culturing לתרבות עמידה. בתחילה מצופה ותרבויות מוקדם (A, B) לעתים קרובות אינו מופיע להכיל תאים ששרדו רבים. יתר על כן, צבירי תאים מוקדם (C, D) לעתים קרובות אינם מציגים את המידה בניגוד הקשורות בדרך כלל neurospheres. יש לציין, כי משך הזמן בתרבות לפני הופעתו של צבירי תאים יכול לקחת שבועות עד כמה חודשים. עם זאת, את המעבר הראשוני של צבירי תאים אלה, בשילוב עם סינון הפוך של צבירי תאים, יכול לבודד תאים סרטניים בריאים כי הם מסוגלים ליצור כדורים (F). התסנין (E) בדרך כלל מכיל פסולת שאריות; עם זאת, אנו ממליצים ציפוי ושמירת התסנין וניטור עבור<html> התפתחות צבירי תאים. חולה הנגזרת אלה דגימות אז יכולות להישמר בתרבות קטעים מרובים (G, H). איור 3 מדגים את היכולת של תאים אלה להיות xenografted לעכברים. בכל אחד מהמקרים הללו, התאים DIPG היו transfected עם כתבת ה- GFP-בלוציפראז לעקוב אחר ההתפתחות של גידולים באמצעות פליטת אור (א). הגידולים יכולים גם להיבחן היסטולוגית, למשל להתבונן engraftment הגידול (ב) או ביטוי של סמנים ספציפיים (C). במודלים vivo אלה, בשילוב עם מבחני חוץ גופית ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשפעות של תרופות שונות או מניפולציות הגן (למשל, 8, 9, 10, 11, 14). les / ftp_upload / 55,360 / 55360fig1.jpg &quot;/&gt; דגימות רקמה באיור 1. בשלבים שונים של עיבוד. (א) תשיג מדגם דרך בנתיחת גופות סטרילי ומשלוח לילה על קרח רטוב. (ב) משמאל לימין: (שורה 1) צינורות המכילים רקמת הגידול במדיה המשלוח; רקמה טרי בצלחת תרבית תאים 100 מ&quot;מ x 20 מ&quot;מ; מתייפייף ראשוני של רקמות; (שורה 2) רקמת טחון חלקית; הסרת קרומי המוח וכלי דם; גודל סופי של פיסות רקמה טחונות. (C) משמאל לימין: (שורה 1) רקמת מודגרות על שולחן סובב בתנור 37 מעלות צלזיוס; (שורה 2) טחינה דקה של רקמה באמצעות טיפ pipet μL 1000 המצורפת pipet 10 מ&quot;ל; סינון של רקמות ניתקות דרך פילטר רשת ניילון 100 מיקרומטר. (ד) משמאל לימין: ניתק מושעה רקמות בתמיסה 0.9 M סוכרוז לפני צנטריפוגה; רקמה ניתקת מופרדת על פני שיפוע סוכרוז לאחר צנטריפוגה; על o שכבה גלויהפסולת המיאלין f על גבי שיפוע סוכרוז; גלולת תא סופית לאחר תמוגה לשטוף ACK. (E) המדגם הסופי יכול להיות ממוקם בתוך תרבות או להשתמש בניתוחים במורד אחרים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig2.jpg" /> איור 2. תמונות של תרבויות עיקריות תאים מעבר מוקדם. (א - ב) תרבויות מצופות מייד לאחר הניתוק (SU-DIPG-XXX, א), או כי לא גדל neurospheres עדיין (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) הופעה מוקדמת של neurospheres בתרבויות העיקרי של SU-DIPG-XXVIII (C) SU-DIPG-XXIX (D). (EF) קטע הראשון של התרבות העיקרית מ D באמצעות מסנן ניילון 100 מיקרומטר, עם filtrate (E) ו תסנין הפוך (F) מצופה. (G - H) neurospheres בוגרות מן הקטע הראשון של SU-DIPG-כז (G) ואת המעבר השלישי של SU-DIPG-XXV (H) גדל בתרבות. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig3.jpg" /> איור 3. תא תרבויות נגזר מטופל יכולות נקלטות וצורת גידולים בעכברים. (א) תמונות פליטת אור של ארבע בתרביות תאים שונות נגזרות חולות טרנספקציה עם כתבת ה- GFP-בלוציפראז. (ב) סעיף sagittal מתוך xenograft העכבר, מראה תאים סרטניים engrafted ב פונס העכבר. גרין: GFP, אדום: חלבון המיאלין הבסיסי. סרגל קנה מידה = 1 מ&quot;מ. (C) immunofluores דוגמהתמונה דעך מראה תאים סרטניים GFP engrafted במוח העכבר. כחול: DAPI, גרין: GFP, אדום: IGF2R. בר סולם = 40 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> משלימה איור 1. לדוגמא הנתיחה של גידול Pontine. המראה שלאחר מוות מיידי של גליומה pontine המהותית מפוזרת. הגידול מופיע כגוש גדול ועתיר המיאלין על פני שטח הגחון של פונס. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את התמונה.</a>

פרוטוקול זה מתאר שיטה לעיבוד המהיר של דגימות גליומה pontine מהותיות מפוזרות שלאחר מוות להקמת מודלי תרבית תאים שמקורם בחולה או אפיון ישיר של תאים סרטניים microenvironmental.

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה לתרבית תאים מהירה לאחר המוות היא ליצור תרביות תאים עמידות של גליומה פונטינית אינטרינזית דיפוזית (DIPG) המופקות מחולים, כדי להקל על הניסויים הדרושים להבנה ולפיתוח סופי של טיפולים יעילים עבור DIPG. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח לגבי הביולוגיה הבסיסית ואסטרטגיות טיפוליות עבור גליומה פונטינית אינטרינזית דיפוזית, כגון האם תרופות מסוימות פועלות על פני תרביות שונות המופקות מחולים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מחקר ישיר של הביולוגיה של תאים המופקים מחולים.להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הטיפול ב-DIPG, מכיוון שהיא מאפשרת לבחון אסטרטגיות טיפוליות שונות על פני תתי-סוגים גנטיים שונים של המחלה. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי DIPG, ניתן להחיל אותה גם על מחלות אחרות, כגון גליומה בדרגה גבוהה אחרת בילדים, גליובלסטומות במבוגרים או גידולים אחרים של מערכת העצבים המרכזית. באופן כללי, אנשים שאינם מיומנים בטכניקה זו יתקלו בקשיים, שכן קשה להשיג דגימות נתיחה ולעבד אותן במהירות ובאופן יעיל.לפני הכנת הדגימה, עקרו את מapay-hood של תרביות רקמה, יחד עם להבי תער, תפסני המוסטט מעוקלים וכלים לא סטריליים אחרים תחת אור UV למשך שעה אחת, ובצעו את כל השלבים הבאים בתנאים סטריליים. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לתוך צלחת תרבית תאים בעלת דפנות גבוהים במידות של 100 מילימטר על 20 מילימטר. הסירו את המצע שנותר מהמשלוח, והחליפו אותו ב-10 עד 15 מיליליטר של מצע תרבית קר.לאחר מכן, בעזרת פינצטות עקומות (hemostats) לאחיזת להב תער, קצצו את הרקמה לדוגמאות קטנות תוך הסרת כלי דם או קרומי המוח (meninges). חלקי הרקמה הסופיים צריכים להיות קטנים מ-1 millimeter. לאחר מכן, העבירו את הרקמה לשפופרת קונית נקייה של 50 milliliter.שטפו את צלחת תרבית התאים עם חמישה מיליליטרים נוספים של מצע תרבית קר והעבירו את הדגימה לפסולה קונית. חזרו על שלב שטיפה זה לפי הצורך כדי להעביר את שארית הרקמה. בעזרת פפיט סרולוגית של 10 מיליליטר, בצעו טריטורציה עדינה לדגימה ארבע עד חמש פעמים.המתינו עד ששברי רקמה גדולים יותר ישקעו לתחתית המבחנה. במידת הצורך, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך דקה אחת. כדי לאסוף את הפракציה המפוצלת, הסירו את הנוזל העליון (supernatant) וסננו אותו דרך מסנן של 100 מיקרון לתוך מבחנה קונית חדשה של 50 מיליליטר המסומנת כ-Mechanical Dissociation.הפוך את המסנן מעל הפרוכת הקונית המקורית ושטוף אותו במדיום תרבית כדי להחזיר את שברי הרקמה. לאחר מכן, סבב בצנטריפוגה את פראקציית הדיסוציאציה המכנית למשך חמש דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט מפראקציית הדיסוציאציה המכנית שהשקיעה, והשהה מחדש את הרקמה במדיום תרבית קר.אם ישנם יותר מחמישה מיליליטרים של רקמה במבחנה הקונית לפירוק מכני, חלק את הרקמה למבחנות קוניות אחרות של 50 מיליליטר, כך שבשום מבחנה לא יהיו יותר מחמישה מיליליטרים של רקמה. לאחר מכן, שמור את הפракציה שעברה פירוק מכני על קרח עד לשלב הסנטריפוגציה במדרג סוכרוז. בהליך זה, סנטריפוג את המבחנה הקונית המכילה את שאריות הרקמה למשך חמש דקות.לאחר מכן, הסר את העליון והוסף את תמיסת העיכול האנזימטי שחוממה מראש, כך שיהיו 5 ml של תמיסת עיכול עבור כל 1 ml של רקמה. לאחר מכן, אטום את מכסה הפפשרוקית באמצעות סרט הדבקה למעבדה והדגר את התגובה על רוטטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. לאחר ההדגרה, בצע טריטורציה עדינה לדגימות.באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר, בצעו שאיבה והוצאה (pipette up and down) של הדגימה שש עד שמונה פעמים, והימנעו מיצירת בועות אוויר מרובות. לאחר מכן, התקינו טיפ של פיפטה של 1,000 מיקרוליטר בקצה הפיפטה ובצעו טריטורציה (trituration) לדגימה שש עד שמונה פעמים נוספות. המתינו עד שכל הגושים שנותרו ישקעו לתחתית המבחנה.לאחר מכן, הסירו וסננו את supernatant עם התאים עדיין בתהליך השהיה דרך מסנן של 100 מיקרון אל תוך מבחנה קונית חדשה בנפח 50 מיליליטר המסומנת כ-Enzymatic Dissociation ושמרו אותה על קרח. לאחר מכן, סבבו במערך צנטריפוגה את מבחנת ה-enzymatic dissociation למשך חמש דקות, והמשיכו לסבוב במערך צנטריפוגה במדרג סוכרוז (sucrose gradient centrifugation). אם הדגימה עדיין מושחית בתמיסה, סבבו אותה במערך צנטריפוגה למשך חמש דקות.בשלב הבא, הסירו את הנוזל העליון ושחזרו את הרקמה ב-20 milliliters של HBSS קר ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, השלימו את הנפח ל-25 milliliters באמצעות HBSS קר. הוסיפו לאט 25 milliliters של תמיסת סוכרוז 1.8 molar, והפכו את המבחנה כדי לערבב.פעולה זו יוצרת מדרג סוכרוז בריכוז של 0.9 מולרי. לאחר מכן, סבב את הדגימה בצנטריפוגה ללא בלימה למשך 10 דקות. שאב בזהירות את ששאירי המיאלין במידת wherever שניתן עם תמיסת סוכרוז.לאחר מכן, שטפו את הדגימה על ידי הוספה של 30 milliliters של HBSS קר ללא סידן ומגנזיום, וערבוב עדין. לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך חמש דקות. במהלך הליך זה, הסירו את עליון השטיפה.הוסיפו חמישה מיליליטרים של ACK lysis buffer, ותלו את משקע התאים בעדינות על ידי סיבוב של המבחנה במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, עצרו את הליזיס על ידי הוספת 30 מיליליטרים של HBSS קר ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך חמש דקות.שחזר את משקע התאים הסופי ב-10 עד 15 milliliters של TSM מלא חם עם גורמי גדילה, וכמת את צפיפות התאים החיים באמצעות המוציאטור (hemocytometer), תוך שימוש בשיטת הדרה של Trypan blue. לאחר מכן, העבר את תגלהי התאים הסופיים לבקבוקר תרבית T75 חדש. הוסף גורמי גדילה נוספים מדי יומיים כדי לשמור על רמות גורמי הגדילה הכלליות, ועקוב אחר התפתחותן של נוירוספירות של תאי גידול.להלן דוגמאות שונות למראה הדגימות משלבים מוקדמים של תרבית ועד לתרבית עמידה. בתחילה, תרביות מוקדמות ודגימות שנזרעו על צלחות לעיתים קרובות אינן נראות כמכילות תאים שורדים רבים. יתרה מכך, צבירי תאים מוקדמים לרוב אינם מראים את רמת הניגודיות המזוהה בדרך כלל עם נוירוספירות (neurospheres).עם זאת, מעבר ראשוני של מקבצי תאים אלו, בשילוב עם סינון הפוך של מקבצי התאים, יכול לבודד תאי גידול בריאים המסוגלים ליצור ספירות. התסנין מכיל בדרך כלל שאריות של פסולת תאית. ניתן להחזיק דגימות אלו, שנגזרו מחולים, בתרבית למספר מעברים.ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בשלוש עד ארבע שעות במידה שהיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להבטיח שהדגימה תישמר בטמפרטורה קרה לאורך כל השלבים, למעט שלב הדיסוציאציה האנזימטית, ולמזער טיפול טראומטי בדגימה. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע מחקרים נוספים, כגון סריקת תרופות in vitro או השתלת קסנוגראפט אורתוטופית, כדי לענות על שאלות עוקבות בנוגע לפתופיזיולוגיה של DIPG.לאחר פיתוחה, סללה טכניקת תרבית זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירו-אונקולוגיה של ילדים לבחון נתיבים טיפוליים חדשים עבור ילדים עם DIPG. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן ביצוע פרוטוקולים מהירים של תרבית תאים לאחר המוות מדגימות של גידולי מוח. זכרו כי עבודה עם רקמה אנושית עלולה להיות מסוכנת, ויש להשתמש תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי וטכניקה סטרילית.

a-protocol-for-rapid-post-mortem-cell-culture-diffuse-intrinsic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

סרטון זה מדגים את תהליך הבידוד והטיפוח של תאי אב גליה מגליומה פונטין פנימית מפוזרת, או רקמת גזע המוח המושפעת מ- DIPG. תאי גליה שבודדו מרקמת הגידול באמצעות עיכול אנזימטי מתורבתים בתווך נוירובזאלי, המקדם את גדילתם ואת התפתחותן של נוירוספרות צפות בחופשיות.

בידוד וטיפוח תאים מגליומה פונטינה פנימית מפוזרת

גליומות ממאירות מהוות קבוצה הטרוגנית של ניאופלסמות גליה מסתננות מאוד עם תכונות קליניות ומולקולריות מובהקות. קסנוגרפטים אורתוטופיים ראשוניים מסכמים מחדש את התכונות ההיסטופתולוגיות והמולקולריות של תת-סוגים ממאירים של גליומה במודלים פרה-קוליניים של בעלי חיים.

גליומה אורתוטופית ראשונית קסנוגרפטים recapitulate צמיחה הסתננות איזוציטראט דהידרוגנאז אני מוטציה

פרוטוקול להפצה של דגימות כירורגיות גליומה בדרגה גבוהה מנותקות במדיום נוירוספרה ללא סרום כדי לבחור עבור תאים עם פנוטיפ תא גזע סרטני. עבור דגימות שלא מצליחות לגדול כמו נוירוספרות, פרוטוקול חלופי מוצע. טכניקת הטמעת פרפין לשמירה על הארכיטקטורה הנוירוספרית התלת מימדית לאימונוציטוכימיה מתוארת.

אופטימיזציה של תרבית תאי גליומה בדרגה גבוהה מדגימות כירורגיות לשימוש במודלים קליניים רלוונטיים לבעלי חיים ואימונוכימיה תלת-ממדית

הקמנו מודל גליובלסטומה orthotopic קליפת המוח בעכברים לשני הפוטונים במיקרוסקופ intravital שמשחזר אילוצי biophysical בדרך כלל במשחק במהלך הצמיחה של הגידול. חלון זכוכית כרוני החלפת הגולגולת מעל לגידול מאפשר המעקב של התקדמות הגידול לאורך זמן על ידי שני פוטונים במיקרוסקופ.

Glioblastoma עכבר דגם orthotopic שמירה על אילוצי המוח של רקמת ריאה, פיסיים ומתאים לשני פוטונים במיקרוסקופ Intravital

מוצג כאן היא שיטה פשוטה לניתוח cytometric הבידוד וזרימה של תאי דם היקפי mononuclear הסתננות-גליומה שמניב נתונים כמותיים זמן תלוי במעמד המספר והפעלת תאים חיסוניים הנכנסים למייקרו-סביבת גידול במוח מוקדם.

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

כאן אנו מציגים מערכת התרבות הvivo לשעבר מעורב מעורבת לחקר התא glioma האדם (hGC) הגירה בזמן אמת. מודל זה מספק את היכולת להתבונן באינטראקציות בין השמאל לבין האקטונים המייאלואידית והלא-מיאלואידית בתוך תא מחולק.

ניטור בזמן אמת של הגירה של תא האדם Glioma על גבי גנגליון שורש-אוליגודנדרוציטים שיתוף תרבויות

עבודה זו מתארת את הפיתוח של אלקטרודות בין-ספרתיות גמישות ליישום במודלים תלת-ממדיים של גידולי מוח, כלומר בתרבית חוץ גופית , במודל ovo ובמודל in vivo murine. השיטה המוצעת יכולה לשמש להערכת ההשפעות של פולסים חשמליים על גידולים ברמות שונות של מורכבות.

מכשירים אלקטרוניים אורגניים גמישים לטיפול בשדה חשמלי פועם של גליובלסטומה

מחקר זה מציג שיטה אוטומטית ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים מסוג גליובלסטומה שמקורם במטופל באמצעות מסוק רקמות. השיטה מספקת גישה מתאימה ויעילה להשגת אורגנואידים כאלה לבדיקה טיפולית.

טיפוח אורגנואידים מסוג גליומה שמקורם במטופל Ex Vivo באמצעות מסוק רקמות

אנו מציגים גישה חדשנית למיקרוסקופ דו-פוטוני של העברת הגידול של ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל עם תווית פלואורסצנטית לגליובלסטומה במודל עכבר.

מיקרוסקופיה תוך-חיונית דו-פוטונית של גליובלסטומה במודל מורין

גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1 הן גידולים נדירים שקשה לתרבת. אנו מציגים שיטה פשוטה ולא אנזימטית המשמרת ביטוי חלבון מוטנטי IDH1 ומקיימת תרביות במשך חודשים. חשוב לציין, טכניקה זו עובדת עם גידולים שמורים בהקפאה, ומציעה משאב רב ערך לחקר גליומה.

פרוטוקול לתרביות אקספלנט של גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה עם מוטציה IDH1

למד פרוטוקול לתרבית תאים ראפיד פוסט מורטם של גליומה פונטינית מפוזרת עצמית (DIPG). שיטה זו מאפשרת יצירת תרביות תאים נגזרות מחולים לחקר ביולוגיית הגידול ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

פרוטוקול תרבית תאי ראפיד פוסט מורטם של Glioma Pontine המפוזר העצמותי (DIPG)

גלה סרטונים נוספים