רקומביננטי α-β - ו γ-Synucleins להמריץ את פעילות החלבון פוספטאז 2A קטליטי יחידת משנה של מבחני חינם תא
13 באוגוסט 2017
פרסום זה מציג פרוטוקול מציג כיצד למדוד את פעילותו של חלבון רקומביננטי פוספטאז 2A קטליטי יחידה משנית (PP2Ac) בתגובה רקומביננטי α-synuclein, β-synuclein או שימוש assay ערכי צבע מוחלטים פשוטה של חלבונים וγ-synuclein. אנו מראים הממצאים לגבי ירידה לפרטים α-synuclein לכיוון PP2Ac במוח העכבר.
אלפא, בטא וגמא סינוקלאאינים רקומביננטיים מעוררים את פעילות תת-היחידה הקטליטית של โปรטאין פוספטאז 2A בבדיקות ללא תאים. שלום, שמי סוואנאראק לק. אני סטודנט לרפואה במרכז המדעי של אוניברסiteten טקסס טק, אל פאסו, בית הספר לרפואה ע"ש פול ל. פוסטר.
בסרטון זה, אדגים בדיקה קולורימטרית דו-כיוונית לפוספטאז של חלבונים באמצעות חלבוני סינוקלאין רקומביננטיים. הכנת תמיסות בופר וריאגנטים. הכנת בופר p-Nitrophenol Phosphate.
להכנת 50 mils של בופר pNPP, המיסו Trizma base ב-25 mils של מים דה-יוניים אולטרה-טהורים בתוך כלי כימי. הוסיפו מגנט ערבוב נקי והניחו על מערבל מגנטי. לאחר התמוססות ה-Trizma, הוסיפו calcium chloride תוך כדי ערבוב רציף.
כוון את ה-pH ל-7.0. העבר את התמיסה למשורה. השלם את הנפח הסופי ל-50 mils באמצעות מים דה-יוניים אולטרה-טהורים.
הכנת תמיסת מאלאכיט גרין (Malachite green). תמיסת מאלאכיט גרין דורשת שלושה תמיסות, חלקים A, B ו-C. תמיסה A היא חומצה הידרוכלורית בריכוז 4 M. תמיסה B היא שילוב של אמוןיום מוליבדאט פלוס תמיסה A. תמיסה C היא מלח מאלאכיט גרין אוקסלט בריכוז 0.045%.
להכנת תמיסה D, ערבבו חלק אחד מ-B עם שלושה חלקים מ-C, ביחס של 1:3. ערבבו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לבסוף, סננו את תמיסה D דרך ממברנה של 22 µm ואחסנו בטמפרטורה של 4 °C.
יש להגן מאור. הכנת המפעיל. המפעיל הוא תמיסת Tween 20 בריכוז 1%.
העבירו בפיפט 10 µL של Tween 20 לתוך 990 µL של מים דה-יוניים טהורים במיוחד. ערבבו במכשיר vortex עד להמסה מלאה של ה-Tween 20. הכנת תמיסת עבודה של malachite green עם Tween 20.
הוסיפו מפעיל לתמיסה D ביחס של 1 ל-100. הכנת פוספופפטיד של תרנין. להכנת תמיסת מלאי של pT בריכוז 2 mM, הוסיפו 550 microliters של מים דה-יוניים ברמת ultrapure ל-1 milligram של pT.
ערבבו במכשיר וורטקס עד להמסה מלאה של הפוספופפטיד. הניחו על קרח לשימוש מיידי. שמרו מנות נוספות של pT בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.
הכנת סינוקלאין. השהו מיליגרם אחד של סינוקלאין במי ultrapure דה-יוניים בריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר. ערבבו בעדינות במכשיר vortex להמסה.
יש להשתמש באופן מיידי ולאחסן מנות שלא נעשה בהן שימוש במינוס 80 מעלות צלזיוס. הכנת סטנדרטים של פוספט. שלב ראשון להכנת סטנדרטים של פוספט.
להכנת תמיסת סטוק של פוספט בריכוז 1 mM, המסיחו פוטסיום פוספט במים דה-יוניים אולטרה-טהורים בתוך כוס כימית עם מוט ערבוב. העבירו למשורה והביאו את הנפח הסופי ל-100 mils. זוהי תמיסה בריכוז 10 mM.
סננו את הפתרון כולו דרך מסנן של 22 µm באמצעות מזרק גדול. דללו תמיסה זו ביחס של 1 ל-100 כדי להכין תמיסת פוספט בריכוז 1 mM לשימוש כסטנדרטים לבדיקה. שלב שני לסטנדרטים של פוספט.
הוסיפו את הכמות המתאימה של פוספט בתוספת מים דה-יוניים רב-מזוקקים למבחנות של 1.5 מיליליטר בהתאם לטבלה. פעולה זו תניב מבחנות של 150, 300, 600, 1,200 ו-2,400 pmol פוספט. אחסנו את המנות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.
בדיקת פעילות PP2A. יש להכין את בדיקת ה-PP2A באנבובי 1.5 מ"ל על קרח. יש להוסיף 43 µL מתוסף pNPP.
הוסיפו מיקרוליטר אחד של PP2Ac רקומביננטי אנושי. הוסיפו synuclein והדגירו את ה-PP2A יחד עם ה-synuclein למשך 30 דקות ב-Nutator בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו 16 מיקרוליטר של pT בריכוז 2mM.
דגרו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius באמבט מים. בלוחיות 96-well בעלות תחתית שטוחה, הוסיפו 25 µL מכל אחד מהתמיסות הסטנדרטיות של הפוספט, בשניפליקאט, מהריכוז הנמוך לגבוה. העבירו בפיפט 24 µL מכל בדיקת PP2A, בשניפליקאט, לאותה לוחיות 96 well שבה נמצאים הסטנדרטים.
העבירו בפיפט 75 µL של תמיסה D המכילה Tween 20 לכל דגימה ולסטנדרט. עם הוספת MGT, ייראה שינוי בצבע בבארים כאשר נוכחים פוספטים חופשיים. ניתוח פוטומטרי.
בצע ניתוח בספקטרופוטומטר המכוון ל-630 nanometers. תוצאות מייצגות. כאן מוצג ביצוע מייצג של בדיקת PP2A והגרף המדגים את עקומת הסטנדרט.
משמאל נמצאים סטנדרטים של פוספט. ככל שמרחקי הבארים מכילים יותר פוספט, כך גוון הירוק יהיה כהה יותר. מימין נמצא PP2A שדגרו עם alpha, beta או gamma synucleins בריכוזים מולריים שונים.
ריכוזים גבוהים יותר היו יעילים יותר בגירוי פעילות תת-היחידה הקטליטית של PP2A. כאן אנו רואים את הייצוג הגרפי של פעילות PP2A בתגובה לריכוזים משתנים של אלפא-סינוקלאין, בטא-סינוקלאין וגמא-סינוקלאין. אלפא-סינוקלאין, בטא-סינוקלאין וגמא-סינוקלאין היו כולם מעוררים משמעותיים של פעילות PP2A בריכוז של 1 עד 2 µM.
רק alpha synuclein ו-beta synuclein היו מעוררים משמעותיים של פעילות PP2A בריכוז של 0.5 micromolar. איור 3 מציג את האינטראקציה של PP2Ac עם סינוקלאינים אנדוגניים במוח של עכבר. בחלק A, alpha, beta ו-gamma synucleins רקומביננטיים מוצגים כביקורות חיוביות.
ב-B, בוצע שיקוע חיסוני משותף (co-immunoprecipitation) באמצעות הנוגדן 1D6 הספציפי ל-PP2Ac, אשר שיקע את PP2Ac וכן שיקע כמות ניכרת של alpha synuclein המקיף אותו, אך כמעט לא שיקע beta synuclein. לא שקע gamma synuclein יחד עם PP2Ac בשיקוע החיסוני המשותף. נתונים אלו משיקוע חיסוני משותף מצביעים על כך ש-alpha synuclein הוא המודולטור האנדוגני של PP2Ac in vivo.
אנו רוצים להודות לכל מי שסייע לנו בהכנת סרטון זה. לסיכום, כאן רות פרז. סונאווראק לק.
חביאר ורגאס. מאחל לכם הצלחה רבה. להתראות ובהצלחה.
סקירה כללית
פרסום זה מציג פרוטוקול למדידת הפעילות של תת-היחידה הקטליטית של הפסופטאז החלבוני רקומביננטי 2A (PP2Ac) בתגובה לחלבונים רקומביננטיים מסוג α-synuclein, β-synuclein או γ-synuclein באמצעות בדיקה קולורימטרית. הממצאים מצביעים על הספציפיות של α-synuclein כלפי PP2Ac במוח של עכבר.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- פרוטאין פוספטאז 2A (PP2A) הוא אנזים קריטי המעורב בתהליכים תאיים שונים.
- סינוקלאינים הם משפחה של חלבונים המעורבים במחלות נוירודגנרטיביות.
- הבנת האינטראקציה בין סינוקלאינים ל-PP2A יכולה לספק תובנות לגבי תפקידם בתפקוד הנוירונלי.
- בדיקות קולורימטריות יעילות למדידת פעילות אנזימטית in vitro.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול להערכת פעילות PP2Ac בנוכחות סינוקלאינים.
- הערכת הספציפיות של α-synuclein כלפי PP2Ac.
- אספקת מתודולוגיה מפורטת עבור חוקרים בתחום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של בופרים וריאגנטים עבור הבדיקה הצבעונית (colorimetric assay).
- אינקובציה של PP2Ac עם ריכוזים משתנים של synucleins.
- מדידת פעילות אנזימטית באמצעות ספקטרופוטומטר.
- קו-אימונופרסיפיטציה (Co-immunoprecipitation) להערכת אינטראקציות בדגימות של מוח עכבר.
תוצאות עיקריות
- כל שלושת הסינוקליינים (α, β, γ) עשרו את פעילות ה-PP2Ac בריכוזים ספציפיים.
- α-synuclein הראה את הספציפיות והאינטראקציה הגבוהות ביותר עם PP2Ac.
- קו-אימונופרסיפיטציה (Co-immunoprecipitation) הצביעה על α-synuclein כמודולטור האנדוגני העיקרי של PP2Ac.
- שינויים קולורימטריים נמצאו במתאם עם רמות הפוספט בבדיקה.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח יעיל לבדיקת פעילות PP2Ac.
- α-synuclein הוא מודולטור משמעותי של PP2Ac in vivo.
- מחקר זה מעמיק את ההבנה של אינטראקציות של סינוקלאין בנוירוביולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
מחקר זה מבסס בדיקה נטולת תאים (cell-free assay) להערכת הוויסות של פעילות PP2Ac המתווך על ידי סינוקלאין, ובכך מספק כלי מכניסטי לתיקוף מטרות במחקר של מחלות נוירודגנרטיביות. על ידי הדגמה ששלוש איזופורמות הסינוקלאין יכולות לעורר את PP2Ac in vitro, השיטה תומכת בבדיקת היפותזות בנוגע להומולוגיה תפקודית שמורה והשלכותיה על הפחתת סיכונים במסלול (pathway de-risking). נתוני ה-co-immunoprecipitation מזקקים עוד יותר את סגוליות המטרה, ומדגישים את $\alpha$-synuclein כווסת האנדוגני in vivo, דבר המסייע בתעדוף היפותזות טיפוליות aוצמצום העמימות המכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הנוגעות לאינטראקציות בין synuclein ל-PP2Ac בניוון עצבי.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי הבהרה האם ההשפעות שנצפו נובעות מויסות ישיר של האנזים או ממסלולים עקיפים.
- ערך מדעי: מסייע בהערכת הביטחון במטרה על ידי השוואת פעילות ספציפית לאיזופורמה במערכת מבוקרת וניתנת לשחזור.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק קריאה כמותית וסטנדרטית (שחרור פוספט באמצעות בדיקת malachite green) להערכת השפעות של תרכובים על פעילות PP2Ac.
- ערך תפעולי: משתמש בחלבונים רקומביננטיים ובבופרים מוגדרים כדי להבטיח הדירות של הבדיקה בין מעבדות ובמסעות סריקה.
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה של כלים ביולוגיים מתוקפים (למשל, עקומות תגובה למינון) לצורך הערכת תרכובים בהמשך ואישור פגיעות (hit confirmation).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין ממצאים in vitro לאינטראקציות אנדוגניות שנצפו במוח של עכבר, ובכך תומך ברציפות תרגומנית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
- ערך מדעי: מסייע בהפחתת סיכונים באסטרטגיות מעורבות המטרה (target engagement) על ידי הבחנה בין פעילות פרומיסקואית in vitro לבין מודולציה סלקטיבית in vivo.
- ערך תפעולי: מסייע בבחירת מודל פרה-קליני על ידי ציון אילו איזופורמים של synuclein צפויים להגיב עם PP2Ac בהקשרים פיזיולוגיים.
שילוב זרימת עבודה וצנרת עיבוד
הבדיקה משתלבת ברצף השלבים המוקדמים של הגילוי, ותומכת בתיקוף המטרה ובזיהוי מובילים (leads) על ידי אספקת תוצאות כמותיות מבוססות-מכניזם, המנחות החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) לפני השקעה משמעותית באופטימיזציה של התרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות למדידה תלוית-מינון של הפעלת PP2Ac על ידי איזופורמים של סינוקלאין.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של ריאגנטים ופלט קולורימטרי התואם לפורמטים מבוססי פלטה.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות פוספט כמותיות המאפשרות השוואה של עוצמת המודולטור ויעילותו בתנאים ניסויים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי תיקוף העובדה שהשפעות שנצפו in vitro תואמות לאינטראקציות אנדוגניות ברקמת מוח.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת השפעות של מודולטורים על PP2Ac, הישימה מעבר לסינוקלאינים גם לחלבונים רגולטוריים אחרים או למולקולות קטנות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בטענות לגבי מודולציה של מטרה על ידי אספקת נתונים כמותיים וישירים של פעילות אנזימטית.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה והדירות באמצעות הכנה מפורטת של ריאגנטים ותנאי אינקובציה מוגדרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את היעילות של קבלת החלטות לגבי המשך התקדמות (go/no-go) על ידי הפחתת ההסתמכות על סממנים ביולוגיים עקיפים או קורלטיביים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם סיכון, בהתבסס על ראיות מכניסטיות למעורבות של נתיב.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביוכימיה של חלבונים ובטכניקות של בדיקות אנזימטיות, כולל טיפול בחלבונים רקומביננטיים וזיהוי פוספורילציה.
- תלוי בגישה לציוד ספקטרופוטומטרי המסוגל לבצע קריאות בליעה ב-630 nm ומערכות דגירה בבקרה טמפרטורית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת ריאגנטים (למשל, תמיסת malachite green, בופר pNPP) כדי להבטיח עקביות של הבדיקה.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבת הבדיקה למערכות מודל לא-נוירונליות או למקורות חלופיים של PP2Ac.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בסובסטרטים של פוספופפטיד טריים ובקרת טמפרטורה קפדנית במהלך שלבי הדגירה.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:33
Preparation of Buffers and Reagents
0:38
Preparing p-Nitrophenol Phosphate (pNPP) Buffer
1:21
Preparing Malachite Green Solution
2:21
Preparation of Activator
2:42
Preparing Malachite Green + Tween 20 (MGT) Working Solution
2:58
Preparing Threonine Phosphopeptide (pT)
3:31
Synuclein Preparation
3:59
Preparing Phosphate Standards
4:45
Phosphate Standards Step 2
5:17
PP2A Activity Assay
6:42
Photometric Analysis
6:53
Representative Results
9:01
Conclusion
