בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

המטרה הכוללת של בידוד מיקרוגליה מגנטי באמצעות CD11b היא השגת תנובה סופית בטוהר גבוה של מיקרוגליה פוסטנאטלית בפרק זמן קצר יחסית, לצורכי ניסויים רב-גוניים in vitro. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מדעי העצבים, כגון מנגנוני השליחויות הרלוונטיים לדלקת עצבית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות הזמינות כיום הוא שהבידוד נמשך כ-30 דקות, ללא פגיעה בטוהר, בתנובה או בחיוניות התאים.

יש להתחיל בהעברה של ראשים שנעתקו זה עתה מגורי עכברים בני יום עד יומיים למנדף עם זרימה למינרית. לאחר מכן, השתמש במספרי מיקרו-דיסקציה ישרים באורך 4.5 אינץ' כדי לבצע חתך קטן בגולגולת ובקרומי המוח, על ידי החדרת הקצוות לפתח שנוצר בעקבות העקירה וחיתוך מכיוון caudal לכיוון rostral. לאחר ביצוע החתך, קלף את אחת ההמיספרות הצידה.

לאחר מכן, השתמשו בזוג פינצטות מעוקלות או עם וו כדי להוציא את המוח כולו. העבירו את המוח למבחנה של 50-milliliter המכילה שני מיליליטר של 0.25%trypsin EDTA, ודגרו למשך 15 דקות באמבט מים של 37-degree Celsius. שטפו את המוח עם מצע גידול טרי על ידי הוספה והסרה של המצע.

לאחר השלמת השטיפות, יש להוסיף שני מיליליטר של מצע גידול לכל מוח, ולהומוגנז על ידי טריטורציה של המוח. כאשר רקמת המוח אינה קטנה יותר, יש לעבור לפיפט עם פיה קטנה יותר. בסיום הטריטורציה, כאשר התרחיף צלול וללא גושים נראים לעין, יש להעביר את התרחיף דרך מסנן תאים של 70 מיקרון כדי ליצור תרבית של תאים בודדים.

לאחר מכן, טפטפו שמונה עד תשעה מיליליטר של מצע גידול לבקבוקי T75, שני בקבוקים לכל מוח, והוסיפו מיליליטר אחד של הומוגנאט מוח לכל בקבוק. גדלו את התאים עד לבידוד ביום השש-עשרי. לאחר שישה-עשר ימים, העבירו את מצע הגידול מהבקבוק לשפופרת 50-מיליליטר נקייה.

הוסיפו שלושה מיליליטרים של 0.25% trypsin EDTA לכל בקבוק T75. לאחר מכן, נערו את הבקבוקים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי. צנטריפוגו את מצע הגידול ב-0.4 times g למשך חמש דקות.

לאחר ניעור למשך חמש דקות, הוסף לפחות 4 mL של מצע תרבית צנטריפוגלי כדי להפסיק את תגובת ה-trypsin EDTA, ובצע טריטורציה (trituration) כדי להבטיח שכל התאים השתחררו. לאחר מכן, העבר את התאים דרך מסננת תאים של 70 µm כדי ליצור תרבית של תאים בודדים. בצע ספירת תאים, ולאחר מכן סבב בצנטריפוגה במהירות של 0.4 ×g למשך חמש דקות.

בשלב הבא, קחו מבחנת פוליסטירן של 5 מיליליטר, הוסיפו 1 מיליליטר מהמדיום המומלץ, וסמנו את התפריס. הוסיפו מדיום מומלץ עד לנפח של 2.5 מיליליטר, וסמנו גם תפריס זה. לאחר מכן, הסירו את המדיום, והשעו שוב את המשקע ב-500 מיקרוליטר של מדיום מומלץ.

העבירו תערובת זו לשפופרת פוליסטירן של 5 ml, ולאחר מכן דללו עד לסימון של 1 ml. לאחר מכן, הוסיפו 50 µl של סרום חולדה לכל 1 ml של תאי תמיחה, והדגרימו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. במהלך ההדגמה, הכינו את תערובת הברירה על ידי ערבוב של 25 µl מרכיב A ו-25 µl מרכיב B. לאחר שחלפו חמש דקות, הוסיפו 50 µl מתערובת הברירה לתאים, והדגרימו למשך חמש דקות נוספות בטמפרטורת החדר.

ערבבו את המיקרוספירות במיקסר וורטקס למשך 45 שניות. לאחר מכן, הוסיפו 80 µL של מיקרוספירות לכל 1 mL של דגימה, והדגירו למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו את המצע המומלץ עד לסימון של 2.5 mL בשפופרת הפוליסטירן.

הנח את המבחנה במחזיק המגנטי למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר האינקובציה, שפוך באיטיות את המצע למבחנת פוליסטירן של 15 מיליליטר שעדיין נמצאת במגנט. חזור על ההפרדה המגנטית שלוש פעמים נוספות, ובכל פעם הוסף את המצע המומלץ עד לסימון של 2.5 מיליליטר.

לאחר ההפרדה המגנטית האחרונה, הוסיפו שלושה מיליליטרים של מצע גידול, וספרו את מספר התאים באמצעות סופר תאים. פזרו את התאים בצלחות מצופות poly-D-lysine לצורך טיפולים. פזרו את הפракציה השלילית מהמבחנה בנפח 15 מיליליטר, המכילה בעיקר אסטרוציטים, בבקבוקי T75.

לאחר דגירה של לפחות שש שעות באינקובטור בטמפרטורה של 37-degree Celsius, החליפו את כל מצע הגידול בבקבוקים המכילים את הפракציה השלילית לפני ההחזרה לאינקובטור. תמונה זו מציגה אימונוציטוכימיה של תרבית מיקרוגליה מבודדת שנבדקה עבור IBA, סמן של מיקרוגליה בערוץ הירוק, ו-GFAP, סמן של אסטרוציטים, בערוץ האדום. צביעת Hoechst חושפת את נוכחותם של גרעיני התאים.

היעדרם של תאים חיוביים ל-GFAP מדגים כי גם מיקרוגליה שבודדה באמצעות ערכה לבחירה חיובית של CD11b היא בעלת טוהר גבוה. חלבונים אלו, שהועברו ל-immunoblot מתרבית מיקרוגליה מבודדת, נסרקו עבור GFAP, המופיע כפס של כ-51-kilodalton, ועבור IBA1, המופיע כפס של כ-15-kilodalton. Beta-actin שימש כביקורת טעינה ומופיע בכ-42-kilodaltons.

בעיה עם ערכת הבידוד הישנה הייתה שניתן היה להבחין בפלורסצנציית PE בערוץ האדום, כפי שניתן לראות כאן. הפרוצדורה המשופרת אינה גורמת לאוטו-פלורסצנציה מהחרו지를 המגנטיים, כפי שניתן לראות בערוץ האדום כאן. ניתן להשתמש במיקרוגליה שבודדו באמצעות פרוצדורה זו למחקרי סיגנלינג.

ניתוח Western blot מראה שניתן לזהות Fyn ו-phospho-src tyrosine Y416 ממיקרוגליה שבודדה באמצעות השיטה המשופרת שלנו. הפראקציה השלילית מההפרדה של המיקרוגליה מכילה אסטרוציטים שניתן להשתמש בהם למחקרי סיגנלינג. Western blotting מראה כי הפראקציה השלילית מכילה תאים חיוביים ל-GFAP.

ניתוח Western blot מראה שניתן לזהות את Fyn ו-phospho-src tyrosine Y416 מהתאים החיוביים ל-GFAP. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מיקרוסקופיית פלואורסצנציה רב-ערוצית, western blotting ו-quantitative PCR, כדי לענות על שאלות הנוגעות לביטוי גנים ואיתות חלבונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו עם הבנה טובה של אופן השימוש בטכניקת בידוד מהירה זו למטרות של ניסויים במיקרוגליה.