בידוד ראפיד ומעודן CD11b מגנטי של Microglia הראשי עם טוהר משופר רבגוני

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד microglia מ גורי עכבר לאחר לידה (יום 1) עבור ניסויים במבחנה. שיטה מאולתרת זו של בידוד מייצר היא גבוהה תשואה וטוהרת, יתרון משמעותי על פני שיטות חלופיות המאפשר התנסות במגוון רחבה לצורך הבהרת ביולוגית microglial.

המטרה הכוללת של בידוד מיקרוגליה מגנטית CD11b היא להשיג תשואה סופית בטוהר גבוה של מיקרוגליה לאחר לידה בפרק זמן קצר יחסית למטרות ניסויים רב-תכליתיים במבחנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון מנגנוני האיתות הרלוונטיים לדלקת עצבית. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני השיטות הקיימות כיום הוא שהבידוד אורך כ-30 דקות, ללא הקרבה של טוהר, יבול או כדאיות.

התחל בהעברת ראשים טריים שנערפו מגורי עכברים בני יום עד יומיים למכסה מנוע זרימת אוויר למינרית. לאחר מכן, השתמש במספריים ישרים בגודל 4.5 אינץ 'כדי לבצע חתך קטן בגולגולת ובקרומי המוח על ידי החדרת הקצוות לפתח שנוצר על ידי עריפת הראש וחיתוך הזנב לשרוול. לאחר ביצוע החתך, מקלפים את אחת מחצי הכדור לצד.

לאחר מכן השתמש בזוג פינצטה מעוקלת או מחוברת כדי להסיר את כל המוח. העבירו את המוח לשפופרת של 50 מיליליטר המכילה שני מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA, ודגרו במשך 15 דקות באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. שטפו את המוח במדיום גידול טרי על ידי הוספה והסרה של המדיום.

לאחר השלמת השטיפות, הוסף שני מיליליטר של מדיום גדילה לכל מוח, והומוגניזציה על ידי טריטורציה של המוח. כאשר רקמת המוח אינה קטנה יותר, עברו לפיפטה עם צמצם קטן יותר. בתום הטריטורציה, כאשר המתלה שקוף ללא גושים גלויים, העבירו את המתלה דרך מסננת תאים של 70 מיקרון כדי ליצור תרבית תאים בודדת.

לאחר מכן פיפטה שמונה עד תשעה מיליליטר של מצע גידול לתוך צלוחיות T75, שתי צלוחיות לכל מוח, והוסיפו מיליליטר של מוח הומוגני לכל בקבוק. לגדל את התאים עד לבידוד ביום השישה עשר. לאחר שישה עשר יום, העבירו את מצע הגידול מהבקבוק לצינור טרי של 50 מיליליטר.

הוסף שלושה מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לכל בקבוק T75. לאחר מכן לנער את הצלוחיות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר על שייקר מסלול. צנטריפוגה את מדיום הגידול ב 0.4 פעמים גרם למשך חמש דקות.

לאחר ניעור של חמש דקות, הוסף מינימום של ארבעה מיליליטר של מדיום התרבית הצנטריפוגה כדי לעצור את תגובת הטריפסין EDTA, וטריטוראט כדי להבטיח שכל התאים נותקו. לאחר מכן העבירו את התאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרו-מולרית כדי ליצור תרבית תאים בודדת. בצע ספירת תאים, ולאחר מכן סובב מטה ב-0.4 פעמים g למשך חמש דקות.

לאחר מכן, קח צינור פוליסטירן של חמישה מיליליטר, הוסף מיליליטר אחד של מדיום מומלץ וסמן את המניסקוס. הוסף מדיום מומלץ עד 2.5 מיליליטר, וסמן גם את המניסקוס הזה. לאחר מכן, הסר את המדיום והשהה מחדש את הגלולה ב-500 מיקרוליטר של מדיום מומלץ.

העבירו את התערובת הזו לצינור פוליסטירן של חמישה מיליליטר, ואז דללו לסימן מיליליטר אחד. לאחר מכן מוסיפים 50 מיקרוליטר סרום חולדה לכל מיליליטר אחד של תאים תלויים, ודוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה מכינים את קוקטייל הבחירה על ידי ערבוב של 25 מיקרוליטר של רכיב A ו-25 מיקרוליטר של רכיב B.לאחר שחלפו חמש הדקות, הוסיפו 50 מיקרוליטר מקוקטייל הבחירה לתאים, ודגרו עוד חמש דקות בטמפרטורת החדר.

מערבולת את המיקרוספירות למשך 45 שניות. לאחר מכן מוסיפים 80 מיקרוליטר מיקרוספירות למיליליטר אחד של דגימה, ודוגרים במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף מדיום מומלץ עד לסימון 2.5 מיליליטר על צינור הפוליסטירן.

הכנס את הצינור למחזיק המגנטי למשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הדגירה, שפכו לאט את המדיום לתוך צינור פוליסטירן בנפח 15 מיליליטר שעדיין במגנט. חזור על ההפרדה המגנטית שלוש פעמים נוספות, בכל פעם הוסף מדיום מומלץ עד לסימון 2.5 מיליליטר.

לאחר ההפרדה המגנטית האחרונה, הוסף שלושה מיליליטר של מצע גידול, וספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים. צלחת את התאים בצלחות מצופות פולי-D-ליזין לטיפולים. צלחו את השבר השלילי מצינור ה-15 מיליליטר, המכיל בעיקר אסטרוציטים, בצלוחיות T75.

לאחר לפחות שש שעות דגירה בחממה של 37 מעלות צלזיוס, החלף את כל מצע הגידול בצלוחיות המכילות את השבר השלילי לפני החזרה לחממה. תמונה זו מציגה אימונוציטוכימיה של תרבית מיקרוגליה מבודדת שנבדקה עבור IBA, סמן של מיקרוגליה בתעלה הירוקה, ו-GFAP, סמן של אסטרוציטים, בתעלה האדומה. צביעת הוכסט חושפת את נוכחותם של גרעיני תאים.

היעדר תאים חיוביים ל-GFAP מדגים שגם למיקרוגליה שבודדה באמצעות ערכת הברירה החיובית CD11b יש טוהר גבוה. חלבונים אלה מתרבית מיקרוגליאלית מבודדת נבדקו עבור GFAP, המופיע כרצועה של כ-51 קילודלטון, ו-IBA1, המופיע כרצועה של כ-15 קילודלטון. בטא-אקטין שימש כבקרת העמסה ומופיע בכ-42 קילודלטון.

בעיה עם ערכת הבידוד הישנה הייתה שניתן היה לצפות בפלואורסצנטיות PE בתעלה האדומה כפי שניתן לראות כאן. ההליך השונה אינו מייצר שום פלואורסצנציה עצמית מהחרוזים המגנטיים, כפי שניתן לראות בערוץ האדום כאן. המיקרוגליה המבודדת באמצעות הליך זה יכולה לשמש למחקרי איתות.

ניתוח כתמים מערביים מראה כי ניתן לזהות Fyn ו-phospho-src טירוזין Y416 ממיקרוגליה שבודדה בשיטה החדשה שלנו. החלק השלילי מהפרדת המיקרוגליה מכיל אסטרוציטים שיכולים לשמש למחקרי איתות. כתמים מערביים מראים שהשבר השלילי מכיל תאים חיוביים ל-GFAP.

ניתוח כתמים מערביים מראה כי ניתן לזהות Fyn ו-phospho-src טירוזין Y416 מהתאים החיוביים ל-GFAP. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב-ערוצית, כתמים מערביים ו-PCR כמותי, כדי לענות על שאלות הנוגעות לביטוי גנים ואיתות חלבונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בטכניקת הבידוד המהיר הזו למטרות ניסויים במיקרוגליה.