עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי
2 באוקטובר 2017
הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.
המטרה הכוללת של הליך מיצוי מלח רציף היא לאפיין פרופילי קשירת חלבון לכרומטין בתפזורת ולהעריך כיצד הקישור משתנה כאשר החלבון, או סביבתו, עוברים מניפולציה. שיטה זו מודדת את הזיקה היחסית של מווסתים אפיגנטיים לכרומטין, וניתן להשתמש בה כדי להעריך כיצד אינטראקציות אלה משתנות על ידי מניפולציה גנטית, כימית וסביבתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזו דרך מהירה וזולה להעריך את פרופילי הכריכה של חלבונים קושרי כרומטין.
אנשים חדשים בתחום הכרומטין נאבקים לעתים קרובות עם כרומטין אימונו-משקעים, או ChIP. מיצוי מלח רציף הוא טכניקה ישנה שאפילו מדענים חסרי ניסיון יכולים להשתמש בה כדי לענות על רבות מאותן שאלות. כדי להתחיל בהליך, קצור 8,000,000 תאים מכל קו תאים מעניין.
שטפו כל דגימת תא עם חמישה מיליליטר PBS קר כקרח פעמיים. השעו מחדש כל דגימה ומיליליטר אחד של מאגר היפוטוני עם מעכבי פרוטאז. העבירו את מתלי התאים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.
סובב את המתלים, מלמעלה מעל למטה, למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחר מכן צנטריפוגה את המתלה למשך חמש דקות באותה טמפרטורה ב-6,000 גרם. השליכו את הסופרנטנט. הצטיידו במיקרו פיפטה בקצה מיליליטר אחד.
הוסף לגלולה 200 מיקרוליטר של מאגר ריפה שונה ללא מלח עם מעכבי פרוטאז. הקש על קצה הפיפטה כנגד החלק התחתון של צינור המיקרו-צנטריפוגה כדי למשוך את הכדור לתוך הקצה. פיפטה את הכדור למעלה ולמטה 15 פעמים.
הדגימה צריכה להיות סמיכה ודביקה ככל שהגלולה מתפרקת. הומוגניזציה של כל דגימה בדרך זו ודגירת הדגימות על הקרח למשך שלוש דקות. לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימות ב-6500 G בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.
העבירו את הסופרנטנטים לניקוי צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לכל גלולה, הוסף 200 מיליליטר של מאגר ריפה שונה עם 100 מילי-מולרי נתרן כלורי ועם מעכבי פרוטאז. פיפטה את הכדור למעלה ולמטה 15 פעמים.
אם בתחילה קשה למשוך את הגלולה לקצה הפיפטה, הקש על הקצה בתחתית הצינור. חזור על תהליך זה עבור כל דגימה ודגר את הדגימות על קרח למשך שלוש דקות. צנטריפוגה את הדגימות ב-6500 G בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.
העבירו את הסופרנטנטים לצינורות מיקרו-צנטריפוגות חדשים של 1.5 מיליליטר. המשך לחלץ דגימות לתמיסות חיץ ריפה מותאמות עם הגדלת ריכוזי הנתרן הכלורי. כאשר הגלולה כבר לא נשארת בתחתית הצינור, הנח את הגלולה במכסה צינור הצנטריפוגה לפני סילוק הסופרנטנט.
לאחר מיצוי המלח הסדרתי, עבור כל דגימה, הוסף 70 מיליליטר של צבע טעון חלבון פי ארבעה לכל אחד מחמשת השברים העליונים. טען 30 מיקרוליטר מכל שבר על ג'ל אקרילאמיד SDS. בצע כתם מערבי סטנדרטי על ידי העברת החלבונים לממברנה וצביעה בנוגדנים ראשוניים מתאימים.
דגרו את הכתם בנוגדנים משניים המסומנים בצבע אינפרא אדום ודמו את הכתם. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לחשב את עוצמת הלהקה של כל ריכוז מלח. שרטט את עוצמת הרצועה כנגד ריכוז המלח כדי לקבוע את דפוס הפליטה של החלבון המעניין.
מיצוי מלח רציף של החלבונים ARID1a ו-Polybromo 1 הראה פליטה עקבית עם ריכוזי מלח של 200 ו-300 מילי-מולר, בהתאמה. מיצוי מלח לא רציף של אותם חלבונים הראה תוצאות פחות עקביות. יש לייעל את זמן הדגירה עבור כל חלבון הנבדק.
לפיכך, נעשה שימוש ב-SSE לבחינת פרופילי פליטה לאחר אורכי דגירה משתנים. מפעיל שעתוק, Polybromo 1, הראה פרופילי פליטה דומים כאשר הודגר במשך שלוש דקות ו-10 דקות. מדכא השעתוק, Polycomb Repressive Complex 1, המסומן על ידי BMI1, נזקק ליותר משלוש דקות כדי להשתחרר מהכרומטין.
אינטראקציות חלבון-חלבון נחקרו על ידי בחינת השינוי בפרופילי הפליטה. בנוכחות מעכב, ברומודומיין המכיל חלבון ארבע רמז על ריכוזי מלח נמוכים יותר מאשר ללא המעכב. הבדלים בדפוסי ההיסטון נצפו כאשר תאים טופלו במעכב היסטון דאצטילאז, מה ששינה את נוף הכרומטין.
שינויים בקשירת החלבון כאשר תאים חוו לחץ גנומי באו לידי ביטוי גם בפרופילי הפליטה. כאן, העלייה בריכוז המלח הדרושה לפליטה, הצביעה על כך שפוליברומו 1 נקשר חזק יותר לכרומטין בעקבות נזק ל-DNA עם דוקסורוביצין. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים-שלוש אם היא מבוצעת כראוי.
בעת ניסיון הליך זה, זכור להיות עקבי ככל האפשר עם הטיפול שלך בכל דגימה. ניתן להשתמש בהליך זה בשלבים הראשונים של מחקר כדי להבהיר את המנגנון והוויסות של חלבון קושר כרומטין. זה חוסך זמן וכסף על מחקרים מיותרים ברחבי הגנום.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
תהליך מיצוי המלח הרצפי (Sequential Salt Extraction) נועד לאפיין פרופילי קישור של חלבונים לכרומטין גס ולהעריך כיצד קישורים אלו משתנים על ידי מניפולציות שונות. שיטה זו מועילה במיוחד להערכת זיקתם של רגולטורים אפיגנטיים לכרומטין.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- ביולוגיה של כרומטין
- אינטראקציות בין חלבונים
- אפיגנטיקה
רקע
- ס extracción מלחים רצופית (Sequential Salt Extraction) היא טכניקה לחקר חלבונים נקשרי-כרומטין.
- היא מציעה חלופה מהירה וחסכונית לשיטת שיקוע חיסוני של כרומטין (ChIP).
- שיטה זו נגישה אפילו עבור מדענים חסרי ניסיון.
- הדבר מאפשר להעריך כיצד אינטראקציות בין חלבונים משתנות בעקבות גורמים גנטיים, כימיים וסביבתיים.
מטרת המחקר
- לאפיין את פרופילי הקישור של חלבונים נקשרי-כרומטין.
- להעריך את ההשפעות של מניפולציות שונות על קישור חלבונים.
- לספק שיטה פשוטה לחוקרים בתחום הכרומטין.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- קציר של 8,000,000 תאים מכל אחת משורות התאים הרלוונטיות.
- מיצוי מלחים סדרתי לבידוד חלבונים הקשורים לכרומטין.
- הערכת זיקת הקשירה של חלבונים לכרומטין.
- בחינה של שינויים בפרופילי הקשירה תחת תנאים שונים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפיינת ביעילות פרופילי קישור של חלבונים.
- היא מדגימה כיצד זיקה של קישור עשויה להשתנות על ידי גורמים סביבתיים.
- התוצאות מעידות על יעילותה של טכניקה זו עבור חוקרים מנוסים ומתחילים כאחד.
- מספקת תובנות לגבי האינטראקציות של וסתים אפיגנטיים עם כרומטין.
מסקנות
- מיצוי מלחים רצפי (Sequential Salt Extraction) הוא כלי בעל ערך לחקר אינטראקציות של כרומטין.
- השיטה יעילה ונגישה עבור יישומים מחקריים שונים.
- היא משפרת את ההבנה של דינמיקת קישור של חלבונים בביולוגיה של הכרומטין.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיצוי מלח רצופי (Sequential Salt Extraction - SSE) מספק שיטה מהירה ומשתלמת להערכת זיקתם של חלבונים נקשרי-כרומטין, המאפשרת תיקוף מטרות בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות הממוקדות באפיגנטיקה. באמצעות כימות האופן שבו הפרעות גנטיות, כימיות או סביבתיות משנות אינטראקציות בין חלבונים לכרומטין, SSE תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של קומפלקסים משני-כרומטין לפני מעבר לבדיקות הדורשות משאבים רבים. גישה זו משפרת את הביטחון החזוי בזיהוי מובילים (leads) על ידי הבחנה בין השפעות של קישור ישיר לבין תגובות תאיות עקיפות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מודד שינויים באפיניות קישור יחסית כאשר תת-יחידות של קומפלקס הולכות לאיבוד או דומיינים מושבתים, ובכך מבהיר את התרומה התפקודית של חלבונים בודדים להיקשרות לכרומטין.
- ערך מדעי: מאפיין דפוסי אלוציה תחת ריכוזי מלח עולים כדי להבדיל בין קישור ספציפי לכרומטין לבין קשרי אי-ספציפיות, ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות באימות המטרה.
- ערך תפעולי: מאפשר לאנשים שאינם מומחים להפיק נתוני קישור כמותיים ללא מומחיות ייעודית ב-ChIP, ובכך מאיץ את בדיקת ההשערות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר פרופילי אלוציה הניתנים לשחזור המשמשים כקריאות כמותיות לסריקת השפעות של תרכובות על שינויים בנוף הכרומטין.
- ערך תפעולי: משתמש בתשתית סטנדרטית של western blot ובניתוח תמונות, מה שמקל על סטנדרטיזציה של הבדיקה בין מעבדות ומפחית שונות טכנית.
- ערך תפעולי: דורש רק ציוד בסיסי לצנטריפוגציה ואלקטרופורזה, ובכך מוריד את חסמי האימוץ במערכי סריקה של מודיולטורים אפיגנטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר שינויים בסביבת הכרומטין (למשל, באמצעות מעכבי HDAC) לשינויים בקישור חלבונים, ובכך תומך במחקרים מכניסטיים המותאמים לסמנים ביולוגיים במערכות רלוונטיות למחלה.
- ערך מדעי: מעריך הסטות בקישור תחת עקה גנומית (למשל, נזק ל-DNA המושרה על ידי doxorubicin), ובכך מספק מידע למודלים ניבויים של מעורבות מטרה תחת תנאים פתופיזיולוגיים.
- ערך תפעולי: משלים בדיקות תאיות וביוכימיות על ידי אספקת תיקוף אורתוגונלי של רציפות אינטראקציית הכרומטין משלב הגילוי ועד לשלבים הפרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
SSE משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), ומספק גשר מכניסטי בין בדיקות קישור ביוכימיות לבין תוצאות פנוטיפיות תאיות בתוכניות אפיגנטיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות באמצעות כימות מידת ההשפעה של שינויים מורכבים על קישור הכרומטין, מה שמאפשר הבהרה של מסלולים והפחתת סיכון ביולוגי של מטרות אפיגנטיות.
- סריקה: מספק פרופילי אלוציה תלויי-מלח כפלטים כמותיים להשוואת שינויים במצב הכרומטין המושרים על ידי תרכובות לאורך קמפיינים של סריקה.
- אנליטיקה: מייצר נתוני עוצמת פס המעודדים מול ריכוז מלח, ומספק שינויים חישוביים בזיקה לקישור המשמשים לדיונים על קשר מבנה-פעילות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שינויי קישור in vitro לשינויים בנוף הכרומטין התאי, ובכך תומך בהתאמה של סממנים ביולוגיים תרגומיים כאשר הוא משולב עם מדדים פונקציונליים.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצג יכולת סטנדרטית בעלות נמוכה שניתן להחיל על מספר מטרות כרומטין, ובכך מקדם שימוש חוזר בפלטפורמה בתוך תהליכי גילוי תרופות אפיגנטיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הבחנה בין קישור כרומטין ישיר לבין השפעות תאיות עקיפות באמצעות אלוציה מבוקרת של מלחים.
- ערך תפעולי: מספק פרופילים כמותיים וניתנים לשחזור של קישור, תוך שימוש בציוד מעבדה נפוץ, ובכך משפר את הסטנדרטיזציה בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מפחית את ההסתמכות על ChIP בעל תפוקה נמוכה להערכות קישור ראשוניות, ובכך משפר את יעילות ההון בפרויקטים מוקדמים של אפיגנטיקה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעודוף של מטרות של קומפלקסים המשנים כרומטין בהתאמה לסיכון, בהתבסס על עמידות קישור כמותית להפרעות סביבתיות.
שיקולים ביישום
- נדרשת מומחיות בביוכימיה של כרומטין ובכימות של Western blot כדי להבטיח פרשנות מדויקת של פרופיל האלוציה.
- תלוי בגישה לצנטריפוגות מקוררות, למבחנות מיקרוצנטריפוגה ולציוד סטנדרטי ל-SDS-PAGE/western blot.
- דורש פרוטוקולי קציר תאים וליזיס סטנדרטיים כדי למזער שונות בין דגימות ולהבטיח תוצאות חילוץ מלחים ניתנות להשוואה.
- כולל אופטימיזציה של זמני האינקובציה עבור כל חלבון מטרה, שכן קינטיקת השחרור של הקישור משתנה בין קומפלקסים שונים של שינוי כרומטין.
- מוגבל להשוואות זיקה יחסיות; קבועי קישור מוחלטים דורשים שיטות ביופיזיקליות אורתוגונליות לצורך תיקוף.
