Name: עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: למדו את שיטת עקירות המלח הרציפות לניתוח פרופילי קישור חלבונים לכרומטין ולהערכת השינויים בקישוריות בעקבות מניפולציות גנטיות, כימיות וסביבתיות. שיטה זו מספקת חלופה מהירה וזולה ל-ChIP לחקר אפיגנטיקה ודינמיקת כרומטין.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמך על ידי פרס מלומד V (V2014-004) מלומד V בתוספת פרס (D2016-030) מטעם קרן V לחקר הסרטן, וגרנט אמריקאי סרטן החברה מוסדי מחקר (ACS IRG גרנט 58-006-53) למרכז האוניברסיטאי Purdue לסרטן מחקר. א ז. עמ' נתמכה על ידי פרס הקרן לתואר שני Borch כימיה המרפא של אוניברסיטת פרדו, המחלקה לפרמקולוגיה מולקולרית.

1. ההכנות <ol><li>להכין 100 מ"ל של פתרון היפוטוניק מאגר ת 0.3 M סוכרוז, 60 מ מ אשלגן כלורי, 60 מ מ טריס pH 8.0, 2 מ מ EDTA, ו- 0.5% NP-40. החנות 4 ºC. 
	הערה: כמה שורות תאים, כגון HEK293T, לדרוש תנאים מחמירים פחות lysing. אם גרעינים lyse בקלות, השתמש שונה מאגר ת 25 מ מ HEPES pH 7.6, 25 מ מ של אשלגן כלורי, 5 מ מ MgCl 2, מ מ 0.05 EDTA, גליצרול NP-40, ו- 10% 0.1%-</li>
	<li>להכין פתרון מניות 250 מ של פתרון x mRIPA 2: 100 מ מ טריס pH 8.0, 2% NP-40 0.5% נתרן deoxycholate.</li>
	<li>להכין פתרון מניות 100 מ של 5 M NaCl.</li>
	<li>שימוש x mRIPA 2 ו- 5 מ' NaCl פתרונות, להכין 50 מ של 1 x mRIPA פתרון עבור כל אחד ריכוזי מלח 6: 0 מ מ 100 מ מ, מ מ 200, 300 מ מ, 400 מ, 500 מ מ NaCl. לפני תחילת הניסוי, מגניב כל הפתרונות על קרח</li>
	<li>לגדול תא קווים בתנאים הרצויים. 
	הערה: בעת החלטה על ההשפעות של הורסים חלבון, SSE עבור שורת תמונות ציפורים יש להשוות לתאים wildtype. אלה SSE יש לבצע על הצד. לקבלת דוגמאות בעזרת מעכבי כימי או גירויים, פנה לסעיפים 3-5-</li>
</ol> 2. הפקת מלח רציפים בסיסי <ol><li>הקציר 8 מיליון תאים של כל תנאי ולשטוף פעמיים עם 5 מ של PBS קר קרח. 
	הערה: זה חשוב וקריטי. שיהיה מספר שווה של תאים יש ריכוז החלבון המקביל. המספר המדויק של תאים, ייתכן שתצטרך להיות אופטימיזציה עבור שורות תאים בודדים או חלבונים מסוימים. זה חשוב שלא יהיו רבים מדי, כמו עליית ריכוז חלבון תמנע התצפית של העקומה • תנאי, אשר תלויה מחייב שיווי משקל. עם זאת, עם תאים מעט מדי אולי לא יהיה מספיק חלבונים כדי לזהות את העקומה, בגדר כרומטין קשה לבודד, עלול ללכת לאיבוד בין שברים.</li>
	<li>מושהה מחדש תאים 1 מ"ל של מאגר A + מעכבי פרוטאז, להעביר לתוך צינורות צנטריפוגה מיקרו 1.5 mL, ו- top סיבוב מעל תחתית ב 4 ºC במשך 10 דקות</li>
	<li>לבודד הגרעינים על ידי צנטריפוגה ב 6000 x g למשך 5 דקות ב- 4 ºC. 
	הערה: לאחר שלב זה מעטפת הגרעין עדיין אמורים להישאר שלמים. אם המעטפה גרעיני שלם, בגדר מחדש נשעה באופן מלא; עם זאת, כאשר המעטפה הוא lysed כרומטין הוא שוחרר, בגדר לא מחדש נשעה. אם המעטפה גרעיני אינו שלם לאחר דגירה מאגר A, השתמש שונה מאגר א</li>
	מעכבי <li>להוסיף 200 µL mRIPA 0 מ"מ NaCl + פרוטאז כדי כל גלולה גרעינים לפני מחדש השעיית גלולה. Homogenize כל דגימה על-ידי pipetting 15 פעמים עם פיפטה 1 מ"ל. בגדר מחדש צריכים להשעות בקלות, לעומת זאת, הגרעינים lyse זה הוא pipetted, המדגם יהפוך סמיך, דביק וקשה פיפטה.
	<ol><li>על מנת להכין את צניפה לתוך הקצה, הקש על הסוף של קצה פיפטה בתחתית הצינורית צנטריפוגה. בגדר לא יימס לחלוטין ברגע ה-DNA הוא שוחרר מן האטומים, אך pipetting ישבור למעלה</li>
	</ol></li> <li>כאשר כל הדגימות יש כבר הומוגני, דגירה כל הדגימות על קרח דק 3 
	הערה: זמן הדגירה ייתכן שיהיה צורך ניתן למטב בהתאם החלבון עניין.</li>
	<li>צנפה כרומטין ולבודד על ידי צריך שתוציאו את הדגימות למשך 3 דקות ב 6500 g x-4 ºC.</li>
	צינור <li>תגובת שיקוע העברה כדי צנטריפוגה mL 1.5 נקי. זה יהיה השבר 0 מ מ. הפתרון mRIPA 0 מ מ יכול לשמש צעד שטיפת פירוק הגרעינים ולהסיר כל החלבונים רופף לא משויך כרומטין.</li>
	מעכבי <li>להוסיף 200 µL mRIPA 100 מ מ NaCl + פרוטאז כדי כל גלולה כרומטין לפני מחדש השעיית גלולה. להיפרד בגדר כרומטין מאת pipetting בגדר לאורך 15 פעמים. 
	הערה: זה קריטי להיות עקבי עם מספר פעמים בגדר ב pipetted.</li>
	<li>Incubate על קרח למשך 3 דקות. שלב הדגירה זה מאפשר כל דוגמאות להגיע למצב של שיווי משקל, אשר חשוב במיוחד, כאשר ישנם מספר דגימות.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 6500 x g עבור מינימום 3-4 ºC, העברת supernatant צינור נקי 1.5 mL-</li>
	<li>חזור על 2.6-2.10 ריכוז מלח שנותרו. 
	הערה: לאחר 400 מ NaCl, mRIPA בגדר צריך להיות ברור, ואילו, לא יישאר בתחתית הצינורית. ניתן למקם את צניפה במכסה של הצינור צנטריפוגה בזמן תגובת שיקוע מבודד.</li>
	<li>70 להוסיף µL של 4 x חלבון הטעינה לצבוע את כל השבר ולטעון 30 µL של כל שבר על ג'ל אקרילאמיד מרחביות לניתוח תספיג. 
	הערה: כדי לקבוע את פרופיל איגוד של החלבון, זה קריטי כדי לטעון כרכים המקבילה של חלבון שווה lysate, במקום טעינת ריכוזים.</li>
	<li>לבצע תספיג רגיל על ידי העברת על גבי קרום ולהשתמש נוגדנים העיקרי חלבונים עניין.</li>
	<li>כדי quantitate החלבון eluted מ כרומטין, דגירה את האבן החשופה של זריחה אינפרא-אדום IRDye נוגדנים משניים, חשופה תמונה עם imager. אמנם ניתן להשתמש בשיטות אחרות של פיתוח, אנו ממליצים זריחה או הדמיית אינפרה-אדום, כפי שהוא יותר כמותיים בטבע.</li>
	<li>שימוש ImageJ או תוכנה דומה כדי לחשב את העוצמה של החלבון eluted-כל ריכוז המלחים. על ידי יצירת גרפים עוצמת הלהקה נגד ריכוזי המלח, התבנית • תנאי את החלבון עניין יכול להיקבע.</li>
</ol> 3. הפקת מלח רציפים רכוש &#34; קורא &#34; מעכב <ol><li>הקציר שתי קבוצות של תאים (4 מיליון) ובידוד הגרעינים כמו SSE רגיל.</li>
	<li>מחדש להשעות שתי קבוצות ב- 200 µL של mRIPA 0 מ"מ NaCl, תקופת דגירה של 3 דקות. זה יאפשר להסרת כל חלבון ללא הגרעינים.</li>
	<li>MRIPA µL להוסיף 200 0 מ"מ NaCl עד כל גלולה. להוסיף את המדכא (2 µL של 1 מ מ (+) JQ1) אחד מדגם של דימתיל סולפוקסיד לקבוצת הבקרה.</li>
	<li>על ידי pipetting 15 פעמים ואז וולדהיין חזר בגדר דגירה על קרח במשך 5 דק.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 6500 x g עבור מינימום 3-4 ºC, העברת supernatant צינור נקי 1.5 mL-</li>
	<li>חזור על 3.3-4 עבור כל ריכוז מלח ולבצע תספיג סטנדרטי של.</li>
</ol> 4. הפקת מלח רציפים רכוש &#34; סופר &#34; מעכב <ol><li>יטפל בתאים עם החומר המדכא (10 מיקרומטר סאהה) או דימתיל סולפוקסיד עבור ה 3</li>
	<li>הקציר 4 מיליון תאים עבור כל טיפול.</li>
	<li>לבצע SSE סטנדרטי של הדגימות עם החומר המדכא נוספו כל המאגרים.</li>
</ol> 5. רציפים מלח החילוץ הבאים נזק לדנ א <ol><li>יטפל בתאים עם דוקסורוביצין 1 מיקרומטר עבור ה 1</li>
	<li>לשנות את התקשורת על התאים ולאפשר להם להתאושש במשך ה 3</li>
	<li>הקציר 8 מיליון תאים ולבצע בסיסית דר.</li>
</ol> 6. הפקת מלח שאינם רציפים <ol><li>הקציר 12 מיליון תאים ולשטוף עם PBS.</li>
	<li>חלוקת תאים כך שיהיו 2 מיליון תאים למחזור צנטריפוגה מיקרו-</li>
	<li>להשעות מחדש ב- 500 µL מאגר A ואת תקופת דגירה של 10 דקות</li>
	<li>לבודד הגרעינים על ידי צנטריפוגה-6000 x ג</li>
	<li>מחדש להשעות. גללים ב µL 200 של כל מאגרי mRIPA + NaCl.</li>
	<li>Homogenize כל דגימה על-ידי pipetting 15 פעמים עם טיפ פיפטה 1 מ"ל.</li>
	<li>Incubate על קרח דק 3</li>
	<li>לבודד את כרומטין על ידי צנטריפוגה ב 6500 x g ולהעביר את תגובת שיקוע לנקות צינורות. להוסיף µL 70 של טעינת לצבוע ולהפעיל 30 µL ג'ל מרחביות-דף לניתוח תספיג.</li>
</ol>

<ol><li>Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+structure+and+the+organization+of+the+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Histone structure and the organization of the nucleosome.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26, 83-112 (1997).</li>
<li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rese%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Rese. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Musselman, C. A., Lalonde, M. -E., Côté, J., Kutateladze, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perceiving+the+epigenetic+landscape+through+histone+readers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Perceiving the epigenetic landscape through histone readers.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Wu, S. Y., Lee, A. Y., Lai, H. T., Zhang, H., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho+switch+triggers+brd4+chromatin+binding+and+activator+recruitment+for+gene-specific+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Phospho switch triggers brd4 chromatin binding and activator recruitment for gene-specific targeting.</a> Mol Cell. 49 (5), 843-857 (2013).</li>
<li>Porter, E. G., Dykhuizen, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+bromodomains+of+Polybromo-1+contribute+to+chromatin+association+and+tumor+suppression+in+clear+cell+renal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Individual bromodomains of Polybromo-1 contribute to chromatin association and tumor suppression in clear cell renal carcinoma.</a> J Biol Chem. 292 (7), 2601-2610 (2017).</li>
<li>Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycomb+group+complexes--many+combinations%2C+many+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+cell+biol%22%5BJournal%5D)">Polycomb group complexes--many combinations, many functions.</a> Trends cell biol. 19 (12), 692-704 (2009).</li>
<li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+inhibition+of+BET+bromodomains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Selective inhibition of BET bromodomains.</a> Nature. 468 (7327), 1067-1073 (2010).</li>
<li>Filippakopoulos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+recognition+and+large-scale+structural+analysis+of+the+human+bromodomain+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Histone recognition and large-scale structural analysis of the human bromodomain family.</a> Cell. 149 (1), 214-231 (2012).</li>
<li>Sanchez, R., Zhou, M. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+human+bromodomains+in+chromatin+biology+and+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+opin+drug+disc+dev%22%5BJournal%5D)">The role of human bromodomains in chromatin biology and gene transcription.</a> Curr opin drug disc dev. 12 (5), 659-665 (2009).</li>
<li>Yang, F., Teves, S. S., Kemp, C. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxorubicin%2C+DNA+torsion%2C+and+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+-+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Doxorubicin, DNA torsion, and chromatin dynamics.</a> Biochim. Biophys. Acta - Rev Cancer. 1845 (1), 84-89 (2014).</li>
<li>Kakarougkas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+PBAF+in+Transcriptional+Repression+and+Repair+at+DNA+Breaks+in+Actively+Transcribed+Regions+of+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Requirement for PBAF in Transcriptional Repression and Repair at DNA Breaks in Actively Transcribed Regions of Chromatin.</a> Mol Cell. 55 (5), 723-732 (2014).</li>
<li>Lee, S. Y., Park, J. -H., Kim, S., Park, E. -J., Yun, Y., Kwon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proteomics+approach+for+the+identification+of+nucleophosmin+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoprotein+C1%2FC2+as+chromatin-binding+proteins+in+response+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A proteomics approach for the identification of nucleophosmin and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C1/C2 as chromatin-binding proteins in response to DNA double-strand breaks.</a> Biochem J. 388 (Pt 1), (2005).</li>
<li>Donaldson, M. M., Boner, W., Morgan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopBP1+Regulates+Human+Papillomavirus+Type+16+E2+Interaction+with+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">TopBP1 Regulates Human Papillomavirus Type 16 E2 Interaction with Chromatin.</a> J Virol. 81 (8), 4338-4342 (2007).</li>
</ol>

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

אפיון של אינטראקציות חלבון וכרומטין באמצעות עקירות מלח היא שיטה נפוצה זה כבר מועסקים במשך עשרות שנים14,15; עם זאת, זה לא באופן שיטתי מוטבה לפני כדי לחשוף את השירות המלא שלה. נדגים כיצד רציפים בשיטה זו מספק דרך מהירה וזולה כדי להבחין בין שינויים באיגוד כרומטין כאשר החלבון או הסביבה היא שונה. SSE ממוטב וניתנת להתאמה במיוחד, חשוב, היא טכנית פשוטה, דורש אין ציוד מיוחד. היבטים מרכזיים שצריך להיות מותאם לפני הפעלת הם: החל מספר הטלפון הנייד, מאגר היפוטוניק תנאים, זמן הד...

תקנה DNA תאי האיקריוטים היא מערכת מורכב ומתוחכם מפוקחת על ידי מגוון של חלבונים לתאם תגובות לגירויים תאיים, חוץ-תאית. הדנ א הוא כרוך סביב היסטון octamers כדי נוקליאוזומים טופס, שניתן באופן רופף מפוזרים לאורך הדנ א או נדחס לתוך סלילי חזק1. ההסדר המבני הזה של ה-DNA, שינויים היסטוניים המכונה כרומטין, אשר מווסת על ידי רשת של חלבונים לקרוא, לכתוב או למחוק שינויים translational פוסט (PTM) על שינויים היסטוניים2. כמה היסטון PTMs, כגון acetylation, לשנות את המטען של חומצת אמינו ביותר הם מופקדים על, שינוי אינטראקציות בין שינויים היסטוניים דנ א2. היסטון PTMs משמשים גם כדי לגייס הרגולטורים תעתיק, remodelers כרומטין, DNA נזק תיקון מכונות, מכונות שכפול ה-DNA אזורים ספציפיים של גנום3.
רוב שיטות לימוד אינטראקציות כרומטין או בדיקה אינטראקציות בקנה מידה קטן או לערב גדול ניתוחים הגנום כולו. במבחנה מחייב לימודי לנצל לעתים קרובות תחומים רקומביננטי בודדים עם פפטידים היסטון. או דנ א במבחני כגון מבחני shift ניידות אלקטרופורזה (EMSA), calorimetry איזותרמי טיטור, קרינה פלואורסצנטית קיטוב פפטיד pulldowns. כי אלה מבחני להתמקד בדרך כלל תחום חלבונים בודדים, הם להקל על ההבנה של חתיכה קטנה של הפאזל, אך אינם מאפשרים לנו להבין את טבעם קואופרטיב של תחום מרובת חלבונים, שלא לדבר על התפקיד שלהם חלבון רב מתחמי. שכבה נוספת של במאוד נוסף של הקומפוזיציה הטרוגנית של מתחמי שינוי כרומטין יונקים ביותר. הטרוגניות חלבון זה, בשילוב עם אופי הדינמי של הנוף כרומטין, הופך אותו מאתגר כדי לסכם את ויוו איגוד אינטראקציות של חלבונים כרומטין כרומטין בתוך חוץ גופית.
שיטות in vivo עשו התקדמות משמעותית; עם זאת, לעתים קרובות הם יקרים, זמן רב, ומאתגר טכנית. Immunoprecipitation כרומטין ואחריו רצף (צ'יפ-seq) הוא מאוד שימושי לקביעת הלוקליזציה של חלבונים ושינויים היסטון ברחבי הגנום, אולם זה דורש אופטימיזציה ניכר4. חלבונים הם לעיתים קרובות תפור כדי כרומטין כדי לשמר את האינטראקציות; עם זאת, זה יכול לייצר אינטראקציות מלאכותי, עלול לגרום epitope מיסוך5. יתר על כן, immunoprecipitations (IP) דורשים נוגדנים ספציפיים מאוד, ואופטימיזציה נרחב של ה-DNA הטיה ומצבים IP על ידי שבב-qPCR שימוש באתר איגוד ידוע, אשר לעתים קרובות אינם זמינים א-פריורי. לאחר אופטימיזציה של שבב תנאים, עיבוד הדגימות יקר ודורש מספר שבועות עד חודשים רצף ולנתח. על פי שיטה זו היא שלא יסולא בפז לזיהוי הלוקליזציה של כרומטין מאוגד חלבונים ברחבי הגנום, העלות ושזה זמן מחויבות אסורה לשימוש בשיטה זו ליצירת היפותזות על מה שינויים קטנים עלול להשפיע על מאפייני האיגוד העולמי .
בנייר זה, אנו מתארים איך וזמינותו הפקת מלח רציפים (SSE) יכול לשמש כדי לבחון פרופילים האיגוד העולמי של חלבוני כרומטין מכורך ולהבחין איך שינויים בפרופיל חלבון, מורכבים, או גלובלי PTM יכול לשנות אינטראקציות. למרות עקירות מלח הם טכניקה בשימוש נפוץ, בהרחבה, נדגים כיצד רציפים בשיטה זו הוא מאוד תכליתי הדירים. SSE מאפשר לנו לאפיין כמה יחידת משנה יחיד של מתחם או אפילו מחשבים בודדת תורמת אהדה גורפת כרומטין הכולל של המתחם. SSE יכול לשמש גם כדי לקבוע אם הכריכה של חלבון מושפע משינויים בנוף כרומטין, מתן השערות מעניין עבור מיקוד מארק היסטון זה יכול להיות מאושרות באמצעות שבב-seq ומחקרים רחב נוספים הגנום.
במקור התאמנו בשיטה זו מ וו ואח ', לבחון את הפונקציה של Polybromo1 (PBRM1) באיגוד של6,7פורטל כרומטין PBAF. בעזרת טכניקה זו, אנחנו נקבע את התפקיד של PBRM1 עבור איגוד כרומטין בתוך כרומטין PBAF שיפוץ מורכב, ואז קבעו את התרומה היחסית של שישה bromodomains בודדים זו פונקציה7.
כאן נתאר כיצד לייעל בשיטה זו כדי לחקור את איגוד כרומטין סוגי תאים שונים, כדי להעריך את זיקה מחייבת היחסי של כרומטין דומה שינוי מכלולי כדי לבחון העקירה של חלבון מכרומטין על ידי מעכב כימי, ו כדי לקבוע את ההשפעות של כרומטין מחייב לאחר שינויים לנוף כרומטין.

<table><tbody><tr><td>סודיום כלוריד, קריסטל 2.5 ק"ג AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>7581-06</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז, קריסטל 500 גרם AR&uml; (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>8360-04</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי, גרגירי 500 גרם AR&uml; (ACS)</td><td>בסיס Avantor/Macron</td><td>6858-04</td><td></td></tr><tr><td>Trizma(R), תקן ראשוני וחוצץ, >=99.9% (טיטרציה),</td> חומצה טטראצטית <td>גבישית Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, מלח דיסודיום, דיהידראט 125 גרם AR (ACS)</td><td>Avantor/Macron</td><td>4931-02</td><td></td></tr><tr><td>NONIDET P-40 מצע, 100 מ"ל UN3082</td><td>Amresco</td><td>E109-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer תמיסה (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד, 6-הידרט, קריסטל 500 גרם AR&uml; (ACS)</td><td>אוונטור/מקרון</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול, 1 ליטר</td><td>אמרסקו</td><td>0854-1 ליטר</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן חומצה דאוקסיקולית, 100 גרם</td><td>אמרסקו</td><td>0613-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף מחקר פלוס פיפטה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-690-032</td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף 5424 R מיקרוצנטריפוגה מקוררת</td><td>אפנדורף</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>עכבר משני IgG HRP מקושר</td><td>איתות תאים</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>ארנב משני IgG HRP מקושר</td><td>איתות תאים</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>BMI-1 נוגדן</td><td>Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBRM1 נוגדן</td><td>Bethyl</td><td>A301-591A</td><td></td></tr><tr><td>ARID1a נוגדן</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-32761</td><td></td></tr><tr><td>BRD4 נוגדן</td><td>Bethyl</td><td>A301-9852a</td><td></td></tr><tr><td>(+) JQ1</td><td>חברת קיימן כימיקלים</td><td>11187</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>חברת קיימן כימיקלים</td><td>10009929</td><td></td></tr><tr><td>דוקסורוביצין</td><td>AK Scientific</td><td>25316-40-9</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>מקרון</td><td>4948-02</td><td></td></tr><tr><td>מיני תא טרנס-כתם</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>מיני מיכל ג'ל</td><td>ThermoFisher</td><td>A25977</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין, בקר (BSA)</td> <td>אמרסקו</td><td>0332-100 גרם</td><td>משמש כפתרון של 5% ב- PBS-T כפתרון חוסם לכתמים מערביים</td></tr><tr><td>Bolt MOPS SDS מאגר ריצה (20x)</td> <td>Life Technologies</td><td>B0001</td><td></td></tr><tr><td>Bolt LDS מאגר דגימה (4x)</td> <td>Life Technologies</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler Plus סולם חלבון מוכתם מראש, 10 עד 250 kDa</td><td>ThermoFisher</td><td>26619</td><td></td></tr><tr><td>מתיל אלכוהול,</td><td>מקרון</td> נטול מים <td>3041-10</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין kEDTA, 1X</td><td>Cellgro</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אזיד, 250 גרם UN1687</td><td>אמרסקו</td><td>0639-250 גרם</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS) 500 גרם UN1325</td><td>אמרסקו</td><td>0227-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>גליצין, לאלקטרופורזה, > = 99%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8898-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>BigTop צינורות מיקרוצנטריפוגה, פוליפרופילן</td><td>VWR</td><td>20170-333</td><td></td></tr><tr><td>1000 ומיקרו; L טיפים לפיפט</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris ג'לים טרומיים 4-12%</td> <td>Invitrogen</td><td>NW04125BOX</td><td></td></tr><tr><td>לופפטין המיסולפט, 5 מ"ג</td><td>מוצרי מחקר RPI</td><td>22035-0.005</td><td>המשמשים לתמיסת מעכב פרוטאז.</td></tr><tr><td>אפרוטינין, 10 מ"ג</td><td>מוצרי מחקר RPI</td><td>20550-0.01</td><td>משמש לתמיסת מעכב פרוטאז.</td></tr><tr><td>פפסטאטין A, 5 מ"ג</td><td>מוצרי מחקר RPI</td><td>30100-0.005</td><td>משמש לתמיסת מעכב פרוטאז.</td></tr><tr><td>OVCA429 תאים</td><td>מתנה מקארן קאודן דאל. Ph.D.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>תאי HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>McCoy's 5A מדיה</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>מדיום חיוני מינימלי (MEM), אבקת</td><td>קורנינג Mediatech</td><td>50-011-PC</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (100X) חומצת אמינו לא חיונית</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>FB-11: סרום בקר עוברי, מקור ארה</td>"ב <td>Omega Scientific</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin Solution</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>Life Technologies</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>VWR Power מקור:</td><td>VWR</td><td>13-690-032</td><td></td></tr></tbody></table>

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

הבהרה של מאפייני האיגוד של פילוח כרומטין חלבונים יכולה להיות מאוד מאתגרת בשל האופי המורכב של כרומטין ואת הטבע הטרוגנית של מתחמי שינוי כרומטין יונקים ביותר. על מנת להתגבר על המכשולים הללו, אנחנו הסתגלו assay הפקת מלח רציפים (SSE) להערכת את הזיקות איגוד היחסי של מתחמי מאוגד-כרומטין. זה קל ופשוט assay יכול לשמש על ידי שאינם מומחים כדי להעריך את ההפרש היחסי מחייבים זיקה של שני מתחמי קשורים, השינויים זיקה קומפלקס יחידת משנה אובד או תחום הפרט הוא מומת בשינוי זיקה מחייבת לאחר שינויים לנוף כרומטין. על ידי ברצף מחדש השעיית בצובר כרומטין להגדיל את כמויות מלח, אנחנו יכולים לעשות פרופיל • את תנאי של חלבון מסוים של כרומטין. באמצעות פרופילים אלה, אנו מסוגלים לקבוע כמה שינויים במתחם שינוי כרומטין או שינויים לסביבה כרומטין להשפיע על אינטראקציות מחייב. צימוד SSE עם אחרים מבחני חוץ גופית בתוך וויוו , אנו יכולים לקבוע את התפקידים של תחומים נפרדים, חלבונים על הפונקציונליות של תסביך במגוון סביבות כרומטין.

בנייר זה, נדגים את היתרונות והיישומים של השיטה הנפוצה הפקת מלח רציפים (SSE) יש שינינו ספרות6. איור 1, נוכל להשוות את הפארמצבטית של SSE חילוץ חלבונים שאינם ברצף על ידי גילוי דפוסי • תנאי ARID1a ו- PBRM1. אנו מבחינים באופן עקבי כי ARID1a, יחידת משנה BAF, elutes בעיקר ב-200 מ"מ NaCl ו- PBRM1, יחידת משנה בלעדי PBAF, elutes בעיקר ב 300 מ"מ NaCl. איור 1a מציג משכפל עצמאית שלושה של SSE עם 8 מיליון תאים OVCA429. <...

הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

המטרה הכללית של הליך מיצוי המלחים הרצפי (Sequential Salt Extraction) היא לאפיין פרופילי קישור של חלבונים לכרומטין במסה (bulk chromatin) ולהעריך כיצד הקישור משתנה כאשר החלבון, או סביבתו, עוברים מניפולציה. שיטה זו מודדת את הזיקה היחסית של ווסתים אפיגנטיים לכרומטין, וניתן להשתמש בה כדי להעריך כיצד אינטראקציות אלו משתנות בעקבות מניפולציה גנטית, כימית או סביבתית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה דרך מהירה וזולה להערכת פרופילי הקישור של חלבונים נקשרי-כרומטין.חוקרים המגיעים לראשונה לתחום הכרומטין מתקשים לעיתים קרובות בביצוע שיקוע חיסוני של כרומטין, או ChIP. מיצוי מלחים רצפי (Sequential Salt Extraction) הוא טכניקה ותיקה שגם מדענים חסרי ניסיון יכולים להשתמש בה כדי לענות על רבות מאותן שאלות. כדי להתחיל בפרוטוקול, אספו 8,000,000 תאים מכל אחת מקווי התאים הרלוונטיים.שטפו כל דגימת תאים פעמיים בחמישה מיליליטר של PBS קר מאוד. השהו מחדש כל דגימה במיליליטר אחד של חוצץ היפוטוני עם מעכבי פרוטאז. העבירו את תלוליות התאים לאنبובות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.סובב את התרחיפים, מלמעלה למטה, למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4°C, ולאחר מכן סנטריפוג את התרחיף למשך חמש דקות באותה טמפרטורה ב-6,000 G. השלף את הנוזל העליון (supernatant). צייד מיקרופיפט בקצה של 1 mL.הוסף למשקע 200 µL של modified ripa buffer נטול מלח עם מעכבי פרוטאז. הקש את קצה הפיפטה בתחתית מבחנת המיקרוצנטריפוגה כדי לשאוב את המשקע לתוך הקצה. בצע פיפוט של המשקע למעלה ולמטה 15 פעמים.הדגימה אמורה להפוך לסמיכה ודביקה ככל שהמשקע מתפרק. הומוגניזו כל דגימה באופן זה והדגרירו את הדגימות על קרח למשך שלוש דקות. לאחר מכן, סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-6500 G's בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות.העבירו את העל-נוזלים (supernatants) למבחנות מיקרו-צנטריפוגה נקיות של 1.5 milliliter. לכל משקע, הוסיפו 200 milliliters של modified ripa buffer עם 100 millimolar sodium chloride ומעכבי פרוטאז (protease inhibitors). שאבו את המשקע בעזרת פיפטה למעלה ולמטה 15 פעמים.אם קשה בתחילה לשאוב את המשקע לתוך טיפ הפפיטה, הקש עם הטיפ על תחתית המבחנה. חזור על תהליך זה עבור כל דגימה והדגר את הדגימות על קרח למשך שלוש דקות. סבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-6500 G's בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס (4°C) למשך שלוש דקות.העבירו את העל-נוזלים למבחנות מיקרו-צנטריפוגה חדשות בנפח 1.5 מיליליטר. המשיכו במיצוי הדגימות לתוך תמיסות modified ripa buffer עם ריכוזים עולים של sodium chloride. כאשר המשקע אינו נשאר עוד בתחתית המבחנה, הניחו את המשקע במכסה של מבחנת הצנטריפוגה לפני שפיכת העל-נוזל.לאחר המיצוי הסדרתי במלח, יש להוסיף לכל דגימה 70 מיליליטר של צבע טעינה לחלבונים בריכוז פי ארבעה לכל אחת מחמש פראקציית העלייה. טען 30 מיקרוליטר מכל פראקציה על ג'ל SDS acrylamide. בצע western blot סטנדרטי על ידי העברת החלבונים לממברנה וצביעה עם הנוגדנים הראשוניים המתאימים.דגרו את הבלוט בנוכחות נוגדנים משניים המסומנים בצבע אינפרא-אדום ודגמו את הבלוט. השתמשו בתוכנה לניתוח תמונות כדי לחשב את עוצמת הפס עבור כל ריכוז מלח. שרטטו את עוצמת הפס כפונקציה של ריכוז המלח כדי לקבוע את תבנית האלוציה של החלבון הנחקר.מיצוי מלח רצפי של החלבונים ARID1a ו-Polybromo 1 הראה אלוציה עקבית בריכוזי מלח של 200 ו-300 millimolar, בהתאמה. מיצוי מלח לא-רצפי של אותם חלבונים הראה תוצאות פחות עקביות. יש לבצע אופטימיזציה של זמן האינקובציה עבור כל חלבון הנבדק.לפיכך, SSE שימש לבחינת פרופילי אלוציה לאחר זמני דגירה משתנים. מפעיל שעתוק, Polybromo 1, הראה פרופילי אלוציה דומים כאשר דגרו אותו למשך שלוש דקות ו-10 דקות. מדכא השעתוק, Polycomb Repressive Complex 1, המזוהה על ידי BMI1, נזקק ליותר משלוש דקות כדי להשתחרר מהכרומטין.אינטראקציות בין חלבונים נחקרו על ידי בחינת השינוי בפרופילי האלוציה. בנוכחות מעכב, חלבון bromodomain containing protein four אלואה בריכוזי מלח נמוכים יותר מאשר ללא המעכב. הבדלים בדפוסי ההיסטונים נצפו כאשר תאים טופלו במעכב היסטון דה-אצטילאז, דבר ששינה את נוף הכרומטין.שינויים בקישור חלבונים כאשר תאים חווו עקה גנומית באו לידי ביטוי גם בפרופילי הליציה. כאן, העלייה בריכוז המלח הדרוש לליציה העידה על כך ש-Polybromo 1 נקשר בצורה הדוקה יותר לכרומטין בעקבות נזק ל-DNA שנגרם על ידי Doxorubicin. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בשלוש עד שעתיים אם היא מבוצעת כראוי.בעת ביצוע פרוצדורה זו, זכרו להיות עקביים ככל האפשר בטיפול בכל דגימה. ניתן להשתמש בפרוצדורה זו בשלבים הראשוניים של מחקר שנועד להבהיר את המנגנון והבקרה של חלבון נקשר-כרומטין. דבר זה חוסך זמן וכסף על מחקרים מיותרים בהיקף גנומי רחב.

sequential-salt-extractions-for-analysis-bulk-chromatin-binding

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא...

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

התקדמות בספקטרומטריית מסות אפשרה ניתוח התפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ושינוי בשורה של רקמות. בשילוב עם חלוקת subcellular ומודלי מחלות, מסה כמותית ספקטרומטריית וביואינפורמטיקה יכולות לחשוף נכסים חדשים במערכות ביולוגיות. השיטה המתוארת כאן מנתחת חלבוני הכרומטין הקשורים בהגדרה של מחלות לב, והוא בקלות ישימה...

ניתוח הכמות של Proteomes הכרומטין במחלות

אנו מתארים שיטה חזקה לimmunoprecipitation הכרומטין באמצעות תאי T ראשוניים. השיטה מבוססת על גישות סטנדרטיות, אך משתמשת בקבוצה מסוימת של תנאים וריאגנטים המשפרים את היעילות למוגבלים בכמויות של תאים. חשוב מכך, תיאור מפורט של שלב ניתוח הנתונים מוצג.

הכרומטין immunoprecipitation יעיל באמצעות כמויות מגבילות של ביומסה

שילוב של immunoprecipitation הכרומטין ורצף אולטרה תפוקה גבוהה (שבב ואילך) יכול לזהות ולמפות DNA חלבונים אינטראקציות בקו רקמה או תא נתון. התווה הוא איך ליצור תבנית באיכות גבוהה עבור סידור שבב שלאחר מכן, תוך שימוש בניסיון עם TCF7L2 גורם השעתוק לדוגמא ירושלים.

דור של תבנית הכרומטין immunoprecipitation איכות גבוהה עבור ה-DNA רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך)

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

זיהוי המטרות הישירות של מולקולות מיקוד הגנום עדיין מהווה אתגר גדול. כדי להבין כיצד מולקולות ה- DNA מחייבת לעסוק הגנום, פיתחנו שיטה המסתמכת על crosslinking של מולקולות קטנות לבודד את הכרומטין (קוסמי).

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

MyoD הוא גורם שעתוק מיוגני בעל יכולת חזקה לגרום לטרנסדיפרנציאציה מיוגנית של קווי תאים רבים שאינם שריר מובחנים לחלוטין. המנגנונים האפיגנטיים המעורבים בטרנסדיפרנציאציה זו אינם ידועים ברובם. כאן אנו מתארים שיטת טיהור זיקה כפולה ואחריה ספקטרומטריית מסה כדי לאפיין באופן ממצה שותפי MyoD.

זיהוי של Myod Interactome שימוש טיהור טנדם זיקה מצמידים ספקטרומטריית מסה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת רזולוציה קרובה לזוג הבסיס של אינטראקציות חלבון-DNA. זה מתקבל על ידי טיפול אקסונוקלאז בשברי DNA המועשרים באופן סלקטיבי על ידי משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP-exo) ואחריו ריצוף תפוקה גבוה.

שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ&quot;א עם Precision סמוך לבסיס זוג

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

פרוטוקול זה מציג שיטת בידוד כרומטין ספציפית ללוקוס המבוססת על רקומבינציה ספציפית לאתר כדי לטהר מוקד גן בעל עניין של עותק יחיד בהקשר הכרומטין הטבעי שלו משמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae.

עותק יחיד של גן לוקוס כרומטין טיהור ב Saccharomyces cerevisiae

העשרה וריצוף של DNA מתהום המקושר לחלבון (eSPAN) פותחה כדי לזהות את השפע היחסי של חלבון הקשור לכרומטין על שני גדילי DNA משכפלים, ובכך לחשוף תובנות מולקולריות לגבי שכפול הכרומטין ותהליכיו המקושרים. פרוטוקול זה מתאר פרוצדורות eSPAN בתאי גזע עובריים (ES) של שמרים ועכברים.

ניתוח ייחודי לגדיל של חלבונים בשכפול גדילי DNA באמצעות העשרה וריצוף של שיטת DNA מתהווים הקשור לחלבונים

למדו את שיטת עקירות המלח הרציפות לניתוח פרופילי קישור חלבונים לכרומטין ולהערכת השינויים בקישוריות בעקבות מניפולציות גנטיות, כימיות וסביבתיות. שיטה זו מספקת חלופה מהירה וזולה ל-ChIP לחקר אפיגנטיקה ודינמיקת כרומטין.

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

גלה סרטונים נוספים