הדור של Organoids Human Brain iPSC הנגזרות למודל הפרעה נוירו-התפתחותית מוקדמת

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה ליצירת אורגנואידים של מוח אנושי המופקים מ-iPSC היא לדגמן הפרעות נוירו-התפתחותיות מוקדמות בבני אדם. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום התפתחות המוח האנושי, כגון תפקידם של סינתסומים וריסונים בנוירוגנזה חדשה ובמיקרוצפליה ראשונית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה מודל חסון ומהיר לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור מאורגנואידים של מוח המופקים מ-iPSC של מטופלים.

את הפרוצדורה תדגים Elke Gabriel, פוסט-דוקטורטורנט מהמעבדה שלי במרכז לרפואה מולקולרית, קלון. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, אספו את הנוספירות (neurospheres) באמצעות מיקרופיפטה של 200 µL עם טיפ של 2 mm שנגזר מראש בעזרת מספריים סטריליים. לאחר מכן, הניחו את הנוספירות במרחק של כ-5 mL אחת מהשנייה על סרט פאראפין בתוך צלחת של 100 mL.

הסר בזהירות כמה שיותר מהמדיום שנותר. לאחר מכן, הוסף טיפה של מטריצת EHS על כל נוירוספירה בודדת. הדגר את טיפות מטריצת ה-EHS יחד עם הנוירוספירות למשך 15 דקות ב-37 degrees celsius.

לאחר מכן, שטפו בזהירות את הנוירוספרים (neurospheres) מסרט הפרפין על ידי שטיפתם במדיום לנוירוספרים. לאחר מכן, דגרו את הנוירוספרים במשך ארבעת הימים הבאים והוסיפו שני מיליליטרים של מדיום רענן לנוירוספרים ביום השני. בהליך זה, הוסיפו 100 מיליליטרים של מדיום לאורגנואידים של המוח לכל בקבוק ספינר (spinner flask) דרך זרועות הצד שלו.

יש לחמם מראש את המצע באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך 20 דקות לפחות. לאחר מכן, יש לוודא שכל הנוירוספירות מופרדות זו מזו. במידה ושתיים או יותר מחוברות באמצעות מטריצת EHS, יש להפריד ביניהן על ידי חיתוך המטריצה המקשרת באמצעות סכין מנתחים.

הגדירו תוכנית ערבוב במהירות של 25 RPM. העבירו בזהירות את הנוירוספירות המוטמעות במטריצת EHS לבקבוקי ספינר (spinner flasks) המכילים 100 milliliters של מצע אורגנואידים. לאחר מכן, סדרו את בקבוקי הספינר על פלטפורמת ערבוב מגנטית באינקובטור למשך 14 ימים בטמפרטורה של 37 degrees celsius.

זהו היום אפס של תרבית האורגנואידים. יש להחליף את המצע פעם בשבוע על ידי הסרת מחצית מהמצע והוספה של כמות זהה של מצע טרי. בשלב זה, אסוף את האורגנואידים מתרבית בקבוק הספינר (spinner flask) ביום 14 באמצעות מיקרו-פיפט של 1 ml חתוך מראש.

העבירו את כולם לצלוחית של 60 מילימטר ושטפו אותם פעם אחת עם 5 מיליליטר של DMEM F12 חמים למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הכינו מבחנה של 1.5 מיליליטר עם 500 מיקרוליטר של 4% PFA חם. מקמו כל אורגנואיד בנפרד בכל מבחנה וקבעו אותם למשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, השתמש בלולאת הזרקה כדי להוציא את האורגנואידים. לאחר מכן, הסר את ה-PFA ושטוף את האורגנואידים המקובעים פעמיים למשך 10 דקות בכל פעם עם 1 ml של PBS. לאחר מכן, אחסן את האורגנואידים ב-1 ml של PBS בטמפרטורה של 4 °C למשך עד 7 ימים לשימוש עתידי.

כדי להטמיע את האורגנואידים לצורך חיתוך קריוגני (cryosectioning), הסיר את ה-PBS והוסף 1 milliliter של תמיסת sucrose בריכוז 30% לכל מבחנה כדי לייבש את האורגנואידים לפני הקפאתם. לאחר הוספת תמיסת ה-sucrose, האורגנואידים צריכים לצוף על פני השטח. אחסן את האורגנואידים למשך לילה בתמיסת ה-sucrose בטמפרטורה של ארבע degrees celsius.

עד למחרת, האורגנואידים אמורים לשקוע לתחתית המבחנה. לאחר מכן, מלאו תבנית דגימה מויניל ב-400 milliliters של תרכובת OCT. השתמשו בלולאת הזרקה כדי להניח אורגנואיד במרכז התבנית.

סמנו את שולי התבנית בשם הדגימה. לאחר מכן, הקפיאו את התבנית המכילה את האורגנואיד בטמפרטורה של 80- °C עד לביצוע החיתוך הקריוסטטי (cryosectioning). לאחר מכן, טפלו את זכוכית של נשאי הקריו-חתכים (cryoslides) ב-0.1% PLL ו-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הניחו לשקופיות להתייבש במשך שלוש שעות. אחסנו את השקופיות בטמפרטורה של 4 °C וחממו אותן לטמפרטורת החדר לפני השימוש. לאחר מכן, בצעו חיתוך של האורגנואידים שהוקפאו בשיטת cryo-freezing לפרוסות בעובי 20 עד 50 µm על גבי שקופיות קריו מזכוכית מצופות PLL.

הניחו לחתכים להתייבש במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ואחסנו את החתכים ב-80°C- עד לעיבוד נוסף. דימוי אימונופלואורסצנטי של אורגנואידים שנחתכו בשיטת קריו-סקציונינג המציגים VZ טיפוסי ואת הלוח הקורטקלי ראשוני (primitive cortical plate). ה-VZ משתרע מהצד האפיקלי לצד הבסיל.

שימו לב כי התאים בתוך ה-VZ מציגים גרעינים דמויי גדר (palisade-like), מה שמעיד על כך שהם תאי גליאל רדיאליים. הפאנל הימני מציג צביעה אימונופלורסצנטית של NPCs חיוביים בתוך ה-VZ ושל נוירונים חיוביים ל-TUJ1 בלוח הקורטקלי הראשוני (primitive cortical plate). מוצגות כאן שתי דוגמאות של VZs שנצבעו עם PVIM ו-ARL 13B.

האזורים המסומנים בריבועים לבנים הם מוגדלים. תאי גליאל רדיאליים אפקליים המתחלקים בצד האפקלי של ה-VZ הם חיוביים ל-PVIM. מישור החלוקה של תא באנפזה הוא אופקי לקו פני השטח של הלומן, המסומן על ידי צביעת ARL 13B.

ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך 23 ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע בדיקות איכות תקופתיות ובדיקות מיקרו-פלזמה על התרביות. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום ההתפתחות בנוירוביולוגיה לחקור את מנגנוני ההתפתחות העצבית באורגנואידים של מוח אנושי.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק אורגנואידים של מוח אנושי מקווי תאי iPSC שונים, כולל קווי תאים של מטופלים עם תפקודים תאיים פגומים.