התבגרות של האדם גזע גזע נגזר Cardiomyocytes ב ביאוירס באמצעות גירוי חשמלי
6 במאי 2017
הפלטפורמה biowire הלב היא שיטה חוץ גופית המשמשת להבשיל עובריים אנושיים cardiomyocytes הנגזרות תאי גזע מושרים (hPSC-CM) על ידי שילוב טיפוח התא תלת ממדי עם גירוי חשמלי. כתב יד זה מציג את ההגדרה המפורטת של פלטפורמת biowire לב.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בשיטות גידול תאים תלת מימדיות מבוקרות בגירוי חשמלי כדי לקדם את ההבשלה של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע עובריים אנושיים ופלוריפוטנטיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנדסת רקמות הלב, כולל כיצד פרמטרים שונים של גירוי חשמלי או משך זמן משפיעים על תפקוד תאי הלב ומצב ההתבגרות. התוצאות הסופיות הן רקמות לב אנושיות מהונדסות בבגרות משופרת.
ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על יישומי אבחון כגון בדיקת הבטיחות והיעילות של תרופות חדשות מכיוון שקרדיומיוציטים עם מאפיינים בוגרים כמו התקדמות חשמלית עשויים לשמש כמודלים מדויקים יותר של תאי לב אנושיים במחקרי סינון תרופות. שלב את מונומר ה-PDMS וחומר הריפוי ביחס של 10:1 וערבב היטב. תן לזה להתייצב במשך חמש דקות להסרת גז.
לאחר מכן טען צלחת פטרי המכילה את תבנית המאסטר עבור ה-biowire עם תערובת ה-PDMS. נסה למזער את היווצרות בועות האוויר. לאחר מכן רפא את ה-PDMS ב-70 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
לאחר מכן שחזר את התבנית המוצקה על ידי שימוש תחילה בלהב חד סביב הקצוות ולאחר מכן קילוף שלה. לאחר מכן חתוך את עודפי ה- PDMS ואסוף את כל התבניות בשקית עיקור. קיטור אוטומטי מחבר את התבניות ב-121 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
ולאחר מכן טען כל תבנית לצלחת פטרי סטרילית מתחת לאוורור של ארון בטיחות ביולוגית. כעת עבור כל תבנית השתמש בפינצטה כדי להרכיב חתיכת תפר משי סטרילי 6.0 לתוך החריץ המשתרע על פני כל הערוץ. לאחר מכן התבניות מוכנות לזריעת תאים.
התפר ישמש כתבנית ליצירת מבנים תלת מימדיים המתיישרים לאורך ציר התפר ומחקים את צורת סיבי הלב. עבור כל תא, הכינו זוג חתיכות פוליקרבונט מלבניות שישמשו כמסגרת לתא הגירוי החשמלי. לאורך קו המרכז של כל חתיכה, קדחו שני חורים ברוחב שלושה מילימטרים, במרחק של שני סנטימטרים זה מזה.
לכל תא הכינו שני מוטות פחמן באורך 1.5 סנטימטר. כ -3 מילימטרים מקצה כל מוט קדחו חור ברוחב מילימטר אחד. לאחר מכן השחילו כל חור בחוט פלטינה ועטפו קצה אחד של החוט סביב המוט.
לאחר מכן, לכל תא הכנס שני מוטות בין שני חלקי פוליקרבונט ליצירת מסגרת. לאחר מכן שופכים כשני מיליליטר PDMS לבאר של צלחת שש בארות ומניחים את המסגרת לבאר עם PDMS, וטובלים את תחתית המסגרות. רפאו את ה-PDMS ב-70 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי שה-PDMS יאבטח את המסגרת.
לאחר מכן הסר את החדר שהושלם מהצלחת כשה-PDMS מחובר. כדי לבדוק את תפקודו של תא מורכב, חבר את חוטי הפלטינה לסוללה והשתמש במד מתח כדי לבדוק שהחשמל מועבר דרך המוטות. כעת העבירו את התאים הפונקציונליים לתוך נרתיק עיקור והשתמשו ב -20 דקות של עיקור קיטור ב -121 מעלות צלזיוס כדי להכין אותם לתרבית תאים.
להכנת הג'ל, יש לקרר מראש את כל מרכיבי הג'ל על קרח לפני ערבובם בצינור סטרילי. הקפד להוסיף את הקולגן והמטריצה התאית הנוספת אחרונה ולערבב את הרכיבים באמצעות פיפטינג. שכן לתאים יש קרדיומיוציטים מובחנים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.
אוספים את התאים ולכל מפעל להכנת חוטים ביולוגיים מכינים 3.5 מיקרוליטר ג'ל קולגן המכיל חצי מיליון תאים. כעת השתמש בקצה פיפטה P10 כדי להעמיס כארבעה מיליליטר תרחיף לתבנית התעלה באורך 0.5 ס"מ בכל מנה. התאם את מיקום התפר באמצעות מלקחיים סטריליים לפי הצורך כך שהוא יימתח במלואו.
לאחר זריעת התאים, הקפידו תמיד להשהות מחדש את תערובת תאי הג'ל לפני נטילת החיטוי על מנת לקבל תוצאות עקביות. לאחר העמסת התעלות, מכסים את תחתית המנה ב- PBS סטרילי ומקפידים לא לגעת בג'ל. זה יבטיח שהחוטים הביולוגיים לא יתייבשו במהלך הפילמור.
לאחר הדגירה של החוטים הביולוגיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, החלף את ה-PBS במדיום תרבית מספיק כדי לכסות את התאים. 12 מיליליטר מספיקים בדרך כלל. לאחר מכן תרבית את המנה למשך שבוע, והחלפת המדיום כל יומיים.
בארון בטיחות ביולוגי הוסף שני מיליליטר PBS לכל באר של צלחת שש בארות שתכיל תא ממריץ חשמלי. לאחר מכן השתמש בפינצטה סטרילית כדי להכניס בעדינות את מכשירי החיטוי לבארות. לאחר המיקום, השליכו את ה-PBS והחליפו אותו בחמישה מיליליטר של מדיום חם שאמור לכסות לחלוטין את מוטות הפחמן.
לפני תרבית התאים למשך 24 שעות, התבונן בהתכווצות הקרדיומיוציטים בתגובה לגירוי חשמלי כדי לוודא שהתאים לוכדים את הגירוי החשמלי ומגיבים בהתכווצויות. לאחר מכן, הנח את החוטים הביולוגיים בתא הממריץ החשמלי וכוון את התעלות בניצב למוטות הפחמן. הרחיקו את חוטי הפלטינה מהצלחת ואז כסו את הצלחות.
חבר את החוטים לממריץ חשמלי. הגדר את הממריץ לספק פולסים דו-פאזיים של אלפית שנייה אחת בהרץ אחד ובשלושה וולט לסנטימטר. לאחר מכן העבירו את התכשירים בממריץ החשמלי לחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
הגדל את קצב הגירוי באופן הדרגתי כל 24 שעות מהרץ אחד ביום האפס לשישה הרץ ביום השישי. במהלך שבוע התרבות הזה, החליפו את המדיום כל יומיים. והתבוננו בהתכווצות הקרדיומיוציטים על בסיס יומי.
לאחר שבעה ימים של תרבית מוקדמת בביו-חוט, התאים עיצבו מחדש את הג'ל סביב התפר. התאים מורכבים לאורך ציר התפר ליצירת רקמת לב מיושרת. התאים ביטאו חלבונים מתכווצים לבביים הראו רצועות סרקומריות במנגנון ההתכווצות והמיופיברילים שלהם היו מיושרים לאורך ציר התפר.
תאים בחוט הביולוגי הראו שיעורי התפשטות נמוכים יותר מאשר תאים בגופים עובריים. הטיפול בסידן השתפר משמעותית בקרדיומיוציטים שגודלו בחוטים ביולוגיים. הטיפול בקפאין גרם לשחרור פתאומי של סידן מהרטיקולום הסקרופלזמי.
ארעיים כאלה נמצאו רק בתאים מגורים. היו גם תדירות גירוי גבוהה משמעותית בהתאם למשרעות שחרור הסידן. בנוסף, קרדיומיוציטים שגודלו בחוטים ביולוגיים הראו שיפור בצפיפות זרם hERG ומיישר פנימה בהשוואה לגידול בגופים עובריים אשר שופר עוד יותר על ידי גירוי חשמלי.
זרם המיישר המשופר פנימה היה עקבי עם ביטוי מוגבר של ג'ינס תעלת האשלגן המיישר פנימה, KCN J2. אוטומטיות היכולת לפעום באופן ספונטני הייתה גבוהה משמעותית בקרדיומיוציטים שמקורם בגוף העוברי בהשוואה לביו-חוטים מבוקרים. הבקרה הראתה אוטומטיות דומה להכנת חוט ביולוגי הנתון למשטר של שישה הרץ. לאחר השליטה בהגדרת החוטים הביולוגיים ניתן לבצע תוך חצי יום.
הגדרת הגירוי החשמלי תארך מספר שעות וניתן להגיע לתוצאות הסופיות תוך שבועיים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי קרדיומיוציטים המובחנים מקווי תאים שונים או על ידי פרוטוקולים שונים יכולים להשתנות מעט בבשלותם ובטוהרם. לכן ייתכן שתידרש אופטימיזציה של הפרמטרים הניסיוניים כגון קצב הגירוי לתאים שלך.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע אופטימיזציה של מצבים אחרים כולל וריאציה של הרכב התא וניצול קרדיומיוציטים מוטנטיים כדי לענות על שלל שאלות נוספות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פלטפורמת ה-biowire לבב היא שיטה חדשנית in vitro שנועדה להבשיל תאי שריר לב (hPSC-CM) המופקים מתאי גזע עובריים אנושיים ומתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים. על ידי שילוב של גידול תאים בתלת-ממד עם גרייה חשמלית, טכניקה זו שואפת להגביר את הבגרות התפקודית של רקמות לבביות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסת רקמות לב
- ביולוגיה של תאי גזע
- טכניקות להבשלת תאים
רקע
- תאי גזע פלוריפוטנטיים עובריים ומושריים של בני אדם יכולים להתמיין לתאי שריר לב (cardiomyocytes).
- ידוע כי גרייה חשמלית משפיעה על הבשלה ותפקוד של תאים.
- בשלות משופרת של תאי שריר לב היא קריטית לבדיקת תרופות מדויקת.
- פלטפורמת ה-cardiac biowire משלבת תרבית תלת-ממדית (3D) עם רמזים חשמליים.
מטרת המחקר
- קידום הבשלת hPSC-CM באמצעות גידול וגירוי מבוקרים.
- חקירת ההשפעות של פרמטרי גירוי חשמלי שונים על תפקוד תאי לב.
- פיתוח רקמות לב אנושיות מהונדסות בעלות בשלות משופרת עבור יישומים מחקריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שילוב של מונומר PDMS וחומר מעבדה (curing agent) ביחס של 10:1.
- ניקוי בועות אוויר (Degassing) מהתערובת למשך חמש דקות לפני השימוש.
- טכניקות לגידול תאים בתלת-ממד.
- החלת גירוי חשמלי לעידוד הבשלה.
תוצאות עיקריות
- רקמות לב הנדסיות הראו מאפייני בשלות משופרים.
- פרמטרים של גירוי חשמלי השפיעו באופן משמעותי על מצב הבשלות של התאים.
- מודלים משופרים של קרדיומיוציטים מייצגים טוב יותר את התהליכים לצורך סריקת תרופות.
- יישומים פוטנציאליים בבדיקת הבטיחות והיעילות של תרופות חדשות.
מסקנות
- פלטפורמת הביו-חוט (biowire) ללב היא כלי מבטיח להנדסת רקמת לב.
- סטימולציה חשמלית מבוקרת יכולה להגביר ביעילות את הבשלת התאים השריריים של הלב (cardiomyocytes).
- שיטה זו עשויה להוביל למודלים טובים יותר לבדיקת תרופות ולמחקר לבבי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמיעים
בשלות של קרדיומיוציטים המופקים מתאי גבעול אנושיים נותרת אתגר קריטי בגילוי תרופות למחלות לב ובמידול מחלות, שכן תאים שאינם בשלים מגבילים את הדיוק הניבוי. פלטפורמת ה-biowire נותנת מענה לכך על ידי שילוב של תרבית תלת-ממדית עם גרייה חשמלית פרוגרסיבית כדי להגביר את הבשלות המבנית והאלקטרופיזיולוגית, ובכך לשפר את הרלוונטיות התרגומית. דבר זה מאפשר הערכה מהימנה יותר של בטיחות ויעילות של תרכובות בסינון פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מודלים של קרדיומיוציטים בוגרים, המשקפים טוב יותר את הפיזיולוגיה של הלב האנושי.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת מערכת לאישור מטרות בהקשר רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית.
- ערך חיזוי: מגביר את הביטחון בזיהוי מועמדים מובילים על ידי צמצום העמימות המכניסטית בהערכת מטרות לב בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר רקמה לבבית מיושרת עם טיפול משופר בסידן וביטוי ערוצי יונים, המאפשרים קבלת מדדים תפקודיים אמינים.
- ערך תפעולי: מספק פלטיים כמותיים הניתנים לשחזור, כגון קינטיקת התכווצות ותגובות אלקטרופיזיולוגיות המתאימות לסטנדרטיזציה של בדיקות.
- יכולת הרחבה (Scalability): הפלטפורמה תומכת בשימוש חוזר במספר קווי תאים ובמשטרי גירוי שונים, לצורך מוכנות עקבית לסריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מדגים הבשלה הרלוונטית למחלה באמצעות ארגון סרקומרי משופר ותכונות אלקטרופיזיולוגיות.
- ערך תפעולי: מספק רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מידול תפקוד של קרדיומיוציטים דמויי מבוגר.
- הפחתת סיכונים: תומך בהפחתת סיכונים ניבוית על ידי שיפור צפיפויות זרם hERG וזרם מיישר פנימה, שהם סממנים ביולוגיים מרכזיים של בטיחות.
שילוב תהליכי עבודה וקווי עיבוד
שיטת ה-biowire משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של מטרות, דרך זיהוי מועמדים (lead identification) ועד להערכה פרה-קלינית, שבה מודלים של קרדיומיוציטים בוגרים הם חיוניים להפקת נתונים מהימנים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים על ידי אפשור הבשלה מבוקרת של קרדיומיוציטים למחקרים פונקציונליים.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות יישור רקמות סטנדרטי ופלט אלקטרופיזיולוגי מדיד.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה בין מצבי הבשלה באמצעות נקודות סיום מדידות, כגון אמפליטודת מעברים של סידן ותדירות התכווצות.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרצף פרה-קליני על ידי מידול של אלקטרופיזיולוגיה ויכולת התכווצות של קרדיומיוציטים בוגרים.
- שימוש חוזר ארגוני: הפלטפורמה ניתנת להתאמה בין קווי תאים ופרוטוקולי גרייה שונים, ובכך היא תומכת בשימוש חוזר לטווח ארוך בפרמקולוגיה של בטיחות לבבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף מטרות לבביות באמצעות שיפור הבשלות המבנית והתפקודית של תאי שריר לב (cardiomyocytes) המופקים מתאי גזע.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ושחזור של תהליך היווצרות הרקמה והתגובה לגירוי על פני סדרות ניסויים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות go/no-go משופרת באופטימיזציה של מועמדים מובילים (lead optimization) על ידי הפחתת הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים הנובע ממגבלות של מודלים לא בשלים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף של תוכניות לבביות המותאם לסיכון, בהתבסס על נתונים פרה-קליניים בעלי יכולת תרגום גבוהה יותר.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיפרנציאציה של תאי גזע, הנדסת רקמות ומערכות גירוי חשמלי.
- תלוי בגישה ליציקת PDMS, ציוד סטריליזציה ומגריצים חשמליים הניתנים לתכנות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולי זריעת תאים, הכנת ג'ל וגירוי.
- התאמה למערכות מודל שונות עשויה לדרוש אופטימיזציה של קצב ומשך הגירוי בהתבסס על השונות בין קווי התאים.
- מגבלות מעשיות כוללות את הצורך בטכניקה סטרילית וטיפול זהיר במבני biowire עדינים במהלך התרבית.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
9:16
Conclusion
7:22
Results: Biowire Cardiomyocyte Physiology
1:01
Fabrication of Biowire Templates
2:22
Fabricating the Electrical Simulation Chambers
3:55
Gel Preparation and Seeding of Cardiomyocytes into the Template
5:41
Culturing Cardiomyocytes in the Template with Electrical Stimulation (Biowire)
