יעיל בידוד TCR תא בודד, דור של וקטורים Retroviral עבור במבחנה In Vivo הביטוי של האדם TCRs

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון רפרטואר TCR אלפא ובטא של אוכלוסייה ספציפית של אנטיגן, כמו גם פונקציונליות in vivo של TCRs אנושיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם היעילות הגבוהה יחסית של תגובת ה-PCR כמו גם תאימותה לשיבוט TCR שלאחר מכן. פרוטוקול זה משתמש ב-PCR דו-שלבי כדי להגביר את שרשראות ה-TCR אלפא ובטא מתא בודד ללא ידע מוקדם על רצף ה-TCR.

ה-PCR הראשון הוא תגובת מולטיפלקס המשתמשת במאגר של פריימרים ספציפיים לאזור משתנה אלפא או בטא בשילוב עם פריימר ספציפי לאזור הקבוע. ה-PCR השני הוא תגובה מקוננת היוצאת מרצף המתאם המשולב בקצה החמישי של תוצר ה-PCR וכן רצף אזור קבוע פנימי. פריימרים אלה משלבים גם אתרי הגבלה ייחודיים בחמשת הקצוות הראשוניים ושלושת הקצוות הראשוניים של מוצר ה-PCR כדי להקל על השיבוט הבא.

לאחר שיבוט לווקטור התבנית, רצף ה-TCR המקודד הוא כימרי, המורכב מאזורים משתנים אנושיים עם אזורים קבועים המשקפים. מבנה ה-TCR הכימרי מאפשר אינטראקציה בין ה-TCR לבין קומפלקס האיתות CD3 המשקף, מה שהופך את פרוטוקול שיבוט TCR זה לתואם למחקרים פונקציונליים עוקבים בשיקוף קווי תאים ובמודלים של עכברים אנושיים. הגדר למיון תאים בודדים על ידי הכנת ריאגנטים לשעתוק הפוך באזור נקי ונטול תבניות.

בדרך כלל אנשים חדשים בשיטת PCR חד-תאית יתקשו בגלל הרמות הנמוכות של התבנית. מצד שני, הרגישות של ה-PCR המקונן במולטיפלקס רגישה לרמות נמוכות של זיהום תבניות. לכן, יש צורך לנקות היטב את האזורים בהם תגדיר את תגובות ה-PCR.

בתגובה זו משתמשים בתערובת של שלושה פריימרים הפוכים הספציפיים לאזור הקבוע של שרשראות האלפא והבטא. הכן את תערובת המאסטר לתעתיק הפוך על ידי שילוב ריאגנטים במאגר פיפטינג. כדי להסביר את שגיאת הפיפטינג, הכינו מספיק תערובת תגובה לעשר בארות נוספות.

השתמש ברב ערוצי כדי לזרוק שישה מיקרוליטר לבאר לתוך צלחת PCR של 96 בארות. מכסים את הצלחת בצורה רופפת בחותם ושומרים את הצלחת על קרח. הכינו תאי T למיון תאים בודדים על ידי צביעת התאים בנוגדנים לסמני פני התא.

מיין תאי T בבת אחת לכל באר תוך השארת שתים עשרה השורות ריקות, מה שישמש כבקרה שלילית. אוטמים את הצלחת בניילון דבק וסובבים בחום של 1000 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. הפעל מיד את תגובת השעתוק ההפוך.

במידת האפשר, הפעל את תגובת ה-PCR הראשונה באותו היום. כדי להפעיל את תגובת המולטיפלקס, ערבבו בנפרד את תערובות המאסטר V alpha ו-V beta PCR במאגרי פיפטינג. שמור את הצלחת עם cDNA על קרח או על גוש קר.

העבירו 22.5 מיקרוליטר של תגובת בטא TCR לתוך צלחת PCR חדשה של 96 בארות. לאחר מכן השתמש ברב ערוצי כדי להעביר 2.5 מיקרוליטר של cDNA לתוך צלחת ה-PCR. השתמש ברב ערוצי כדי לפפט 22.5 מיקרוליטר של תגובת אלפא TCR ישירות לתוך הצלחת המכילה את שארית ה-cDNA.

אוטמים את הצלחות בדבק, מערבולת בעדינות ומסתובבים בקצרה. הפעל את תגובת ה-PCR הראשונה. ניתן לאחסן צלחות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

למחרת, הכינו את תגובות ה-PCR המקוננות השנייה. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הפיפטה הראשית מתערבבת עבור תגובות הבטא של TCR אלפא ו-TCR ב-22.5 מיקרוליטר לבאר לשתי לוחות PCR חדשים של 96 בארות. הוסף את תבנית תגובת ה-PCR המולטיפלקס ב-2.5 מיקרוליטר לבאר.

אוטמים את הצלחות, מערבולת בעדינות ומסתובבים בקצרה. יש לאטום את תגובת ה-PCR הראשונה שנותרה ולאחסן אותה ב-20 מעלות צלזיוס כדי לשמש כמקור לתבנית גיבוי. בצע את תגובת ה-PCR השנייה.

לאחר השלמת תגובת ה-PCR המקוננת השנייה, יש להוציא חמישה מיקרוליטרים מהתגובה על ג'ל אגרוז 1%. כלול את בארות הבקרה החיוביות והשליליות. הרצועה הצפויה אמורה לרוץ בסביבות 500 זוגות בסיסים בגודל.

טהר את שארית התגובה השנייה, עשרים מיקרוליטר, באמצעות ערכת טיהור PCR בפורמט 96 בארות ובצע ריצוף סנגר. ניתן לנתח את רצפי ה-TCR המתקבלים באמצעות תוכנה אימונוגנטית זמינה מקוונת. ניתן להשתמש במידע הרצף כדי להעריך את הרפרטואר והשיבוטיות של אוכלוסיית תאי ה-T.

ניתן להשתמש ברצפי TCR אלפא ובטא מזווגים בניתוח פונקציונלי נוסף. בצע קשירה רצופה של TCR beta ו-TCR alpha לתוך וקטור התבנית. התבנית TCR beta ו-TCR alpha מוחלפות בשרשראות המוגברות של PCR.

בקשירה הראשונה, תבנית הבטא TCR מוחלפת בשרשרת הבטא המוגברת של PCR. לאחר שהחדרה מוצלחת של TCR beta אומתה על ידי ריצוף תקציר בדיקה, החלף את תבנית TCR alpha בשרשרת אלפא מוגברת PCR. תאי HEK293T משמשים לבדיקת זיווג מוצלח של שרשרת TCR וביטוי פני התא.

תאים HEK293T עוברים טרנספטציה משותפת עם וקטור TCR המסומן על ידי המדווח הפלואורסצנטי האמטריני וקטור המקודד את קומפלקס CD3 המסומן על ידי GFP. ביטוי פני השטח של ה-TCR הכימרי מאומת על ידי זרימה ציטומטרית על ידי צביעת התאים בנוגדנים CD3 נגד עכבר. רמת ביטוי CD3 פני השטח בתאים שהועברו עם מבנה TCR הכימרי צריכה להיות דומה לאלה שהועברו עם וקטור תבנית הבקרה המשקף במלואו.

לסיכום, תיארנו פרוטוקול יעיל מבוסס PCR לזיהוי ושיבוט של שרשראות TCR מזווגות מתאים בודדים. אנו צופים שזה יהיה כלי רב ערך לחקר תגובות תאי T אנושיים באוטואימוניות, מעקב אחר גידולים וחיסול פתוגנים. היתרון העיקרי של פרוטוקול ה- PCR המתואר כאן הוא תאימותו למחקרי מבחנה ו- in vivo הבאים.