Name: הכנה פיזיולוגית של תאי שיער מן Sacculus של הבוקסר האמריקאי ( רנא catesbeiana) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: למד הכנה פיזיולוגית של תאי שיער מן Sacculus של הבוקסר האמריקאי (Rana catesbeiana) למחקר ביופיזיקלי. שיטה זו מאפשרת גישה לתאים בריאים למשך שעות ותומכת במחקרי מדעי החישה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מבקשים להודות לד"ר א.ג. הדספת' על המימון והמומחיות בפיתוח התכשירים המתוארים במאמר זה. ברצוננו גם להודות לבריאן פבלה על היצירה והתחזוקה של חלק ניכר מהציוד והתוכנה המותאמים אישית המשמשים בפרוטוקול זה.
J.B.A. נתמך על ידי מענק F30DC014215, J.D.S. נתמך על ידי מענק F30DC013468, וגם J.B.A. ו-J.D.S. נתמכים על ידי T32GM07739 מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+Adult+Mouse+Utricle+and+Adenovirus-mediated+Supporting-cell+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3734-e3734 (2012).</li>
<li>Howard, J., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compliance+of+the+hair+bundle+associated+with+gating+of+mechanoelectrical+transduction+channels+in+the+bullfrog%27s+saccular+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Compliance of the hair bundle associated with gating of mechanoelectrical transduction channels in the bullfrog's saccular hair cell.</a> Neuron. 1 (3), 189-199 (1988).</li>
<li>Jaramillo, F., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+hair+cell%27s+transduction+channels+at+the+hair+bundle%27s+top+by+iontophoretic+application+of+a+channel+blocker%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Localization of the hair cell's transduction channels at the hair bundle's top by iontophoretic application of a channel blocker.</a> Neuron. 7 (3), 409-420 (1991).</li>
<li>Assad, J. A., Hacohen, N., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+dependence+of+adaptation+and+active+bundle+movement+in+bullfrog+saccular+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Voltage dependence of adaptation and active bundle movement in bullfrog saccular hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (8), 2918-2922 (1989).</li>
<li>Benser, M. E., Issa, N. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair-bundle+stiffness+dominates+the+elastic+reactance+to+otolithic-membrane+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Hair-bundle stiffness dominates the elastic reactance to otolithic-membrane shear.</a> Hearing research. 68 (2), 243-252 (1993).</li>
<li>Martin, P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+hair-bundle+movements+can+amplify+a+hair+cell%27s+response+to+oscillatory+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Active hair-bundle movements can amplify a hair cell's response to oscillatory mechanical stimuli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (25), 14306-14311 (1999).</li>
<li>Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Fabella, B. A., Tobin, M., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+a+hair+bundle%27s+mechanosensory+function+by+its+mechanical+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Control of a hair bundle's mechanosensory function by its mechanical load.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (9), E1000-E1009 (2015).</li>
<li>Martin, P., Bozovic, D., Choe, Y., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Oscillation+by+Hair+Bundles+of+the+Bullfrog%27s+Sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Oscillation by Hair Bundles of the Bullfrog's Sacculus.</a> Journal of Neuroscience. 23 (11), 4533-4548 (2003).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> The Journal of physiology. 400, 275-297 (1988).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage-and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> The Journal of physiology. , (1988).</li>
<li>Fisher, J. A. N., Kowalik, L., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+electrical+resonance+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging electrical resonance in hair cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1651-1656 (2011).</li>
<li>Patel, S. H., Salvi, J. D., Ó Maoiléidigh, D., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-selective+exocytosis+by+ribbon+synapses+of+hair+cells+in+the+bullfrog%27s+amphibian+papilla%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Frequency-selective exocytosis by ribbon synapses of hair cells in the bullfrog's amphibian papilla.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (39), 13433-13438 (2012).</li>
<li>Gale, J. E., Meyers, J. R., Periasamy, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+bundleless+hair+cells+and+subsequent+bundle+replacement+in+the+bullfrog%27s+saccule%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Survival of bundleless hair cells and subsequent bundle replacement in the bullfrog's saccule.</a> Journal of neurobiology. 50 (2), 81-92 (2002).</li>
<li>Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoelectrical+transduction+by+hair+cells+of+the+bullfrog%27s+sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+brain+research%22%5BJournal%5D)">Mechanoelectrical transduction by hair cells of the bullfrog's sacculus.</a> Progress in brain research. 80, 129-135 (1989).</li>
<li>Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+the+active+process+of+hair+cells+with+cochlear+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integrating the active process of hair cells with cochlear function.</a> Nature Reviews Neuroscience. 15 (9), 600-614 (2014).</li>
<li>Corey, D. P., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+latency+of+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Response latency of vertebrate hair cells.</a> Biophysical journal. 26 (3), 499-506 (1979).</li>
<li>Cheung, E. L. M., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2BChanges+the+Force+Sensitivity+of+the+Hair-Cell+Transduction+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Ca2+Changes the Force Sensitivity of the Hair-Cell Transduction Channel.</a> Biophysical journal. 90 (1), 124-139 (2006).</li>
<li>Choe, Y., Magnasco, M. O., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+amplification+of+hair-bundle+motion+by+cyclical+binding+of+Ca2%2B+to+mechanoelectrical-transduction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A model for amplification of hair-bundle motion by cyclical binding of Ca2+ to mechanoelectrical-transduction channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15321-15326 (1998).</li>
<li>Assad, J. A., Corey, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+active+motor+model+for+adaptation+by+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An active motor model for adaptation by vertebrate hair cells.</a> Journal of Neuroscience. 12 (9), 3291-3309 (1992).</li>
<li>Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+and+adaptation+of+transducer+currents+in+turtle+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Activation and adaptation of transducer currents in turtle hair cells.</a> The Journal of physiology. , 405-434 (1989).</li>
<li>Howard, J., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+relaxation+of+the+hair+bundle+mediates+adaptation+in+mechanoelectrical+transduction+by+the+bullfrog%27s+saccular+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical relaxation of the hair bundle mediates adaptation in mechanoelectrical transduction by the bullfrog's saccular hair cell.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (9), 3064-3068 (1987).</li>
<li>Purves, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+release+of+drugs+from+iontophoretic+pipettes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">The release of drugs from iontophoretic pipettes.</a> Journal of Theoretical Biology. 66 (4), 789-798 (1977).</li>
<li>Tinevez, J. Y., Jülicher, F., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unifying+the+various+incarnations+of+active+hair-bundle+motility+by+the+vertebrate+hair+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Unifying the various incarnations of active hair-bundle motility by the vertebrate hair cell.</a> Biophysical journal. 93 (11), 4053-4067 (2007).</li>
<li>Ó Maoiléidigh, D., Nicola, E. M., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diverse+effects+of+mechanical+loading+on+active+hair+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The diverse effects of mechanical loading on active hair bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (6), 1943-1948 (2012).</li>
<li>Kennedy, H. J., Crawford, A. C., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+generation+by+mammalian+hair+bundles+supports+a+role+in+cochlear+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Force generation by mammalian hair bundles supports a role in cochlear amplification.</a> Nature. 433 (7028), 880-883 (2005).</li>
<li>van Netten, S. M., Khanna, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stiffness+changes+of+the+cupula+associated+with+the+mechanics+of+hair+cells+in+the+fish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stiffness changes of the cupula associated with the mechanics of hair cells in the fish lateral line.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1549-1553 (1994).</li>
<li>Bormuth, V., Barral, J., Joanny, J. F., Jülicher, F., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+channels%27+gating+can+control+friction+on+vibrating+hair-cell+bundles+in+the+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transduction channels' gating can control friction on vibrating hair-cell bundles in the ear.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7185-7190 (2014).</li>
<li>Crawford, A. C., Evans, M. G., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+actions+of+calcium+on+the+mechano-electrical+transducer+current+of+turtle+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">The actions of calcium on the mechano-electrical transducer current of turtle hair cells.</a> The Journal of physiology. , 369-398 (1991).</li>
<li>Kozlov, A. S., Risler, T., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+motion+of+stereocilia+assures+the+concerted+gating+of+hair-cell+transduction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Coherent motion of stereocilia assures the concerted gating of hair-cell transduction channels.</a> Nature Neuroscience. 10 (1), 87-92 (2007).</li>
<li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+free+Ca2%2B+concentration+in+hair-cell+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of free Ca2+ concentration in hair-cell stereocilia.</a> Journal of Neuroscience. 18 (16), 6300-6318 (1998).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

בתוך של sacculus הצפרדע לשקר כמה אלף תאי שיער חושיים נגישים. כאן אנו מדגימים חילוץ והכנה sacculus להקלטות אחד והשני קאמרית. ההכנות שני אלה מאפשרים בשני המחקרים micromechanical ו אלקטרו של תאי השיער חבילות הקשורים בהם. מכיוון הרקמה יכולה לשרוד במשך כמה שעות עם החלפה תכופה של תמיסת מלח מחומצן, ניסויים יכולים להימשך תקופות ארוכות. תאי שיער בהכנות אלה בדרך כלל נשארים קיימא עבור הקלטה microelectrode עד 6 שעות לאחר הניתוח, בעוד צרורות שיער להתנדנד באופן ספונטני עד 24 שעות לאחר החילוץ. מיצוי הרכבה מוצלח של sacculus צירים על surmounting כמה אתגרים משותפים. ראשית, מגע ישיר עם למשטח הפסגה של המקולה saccular יש להימנע לאורך כל ההליך הכנה. העצב saccular מספק ידית נוחה manipu בטוחאוכלוסייה של sacculus. לאחר משוחררים משאר האיברים הפנימיים-האוזן, sacculus יועברו בעזרת פיפטה גדול נשא תוך שמירה שקוע בנוזל, כדי למנוע נזק מכני האפיתל חושית שלה. הסרת otoconia מפני השטח מקולרי חייב להסתיים ללא נזק מכני לתאי שיער. מכיוון otoconia לשקר ישירות על גבי המקולה, בתאי השיער עלולים להיפגע על ידי מגע מקרי בין כלי לנתיחה הממברנה otolithic תוך הסרת otoconia. כדי למנוע ניזק, אנו ממליצים שההמסה הדביקה של otoconia שתתקיים בבאתר רחוק המקולה והוציאה כגוש אחד. זה ימנע פיצול של מסת otoconial לאשכולות רבים, שכל אחד מהם יהיה חילוץ בנפרד. אם אשכולות קטנים של otoconia להישאר הם יכולים להסיר עם לחץ נוזל עדין נמסר על ידי פיפטה פסטר. אתגר אחרון כולל היווצרות חותמת חזק בין כיכר הרכבת sacculus והאלומיניום בהכנת שתי קאמרית. העסקה מרובעת עם נקב קטן מספיק כדי לאפשר חפיפה של כ -100 מיקרומטר בין sacculus ואת היתרי אלומיניום שמסביב אטימה מלאה של הרקמה. הדבק צריך להיות מובא במגע עם כ 100 מיקרומטר של רקמות saccular מסביב של המקולה כדי ליצור חותם חזק. ריכוז Ca חינם 2+ הוא שיקול חשוב בחקר תאי שיער. Ca 2 + המסדיר הוא הסתגלות מהירה ואיטית, ובכך בקביעת קינטיקה של מנגנון mechanotransduction ואת המאפיינים של תופעות פעילה בתהליך של צרור השיער, כולל תנועת 8 צרור ספונטני, 23. סידן Endolymphatic in vivo נמצא ב 250 מיקרומטר, ולכן קינטיקה הרלוונטית ביותר מהבחינה הפיזיולוגית מוערכת בריכוז זה (Maunsell JHR, ר &#39;ג&#39; ייקובס, ו AJ Hudspeth. Unpublisתצפיות הד 16). עם זאת, קלטות microelectrode מתאי שיער דורשות ריכוז סידן חיצוני עולה על 2 מ&quot;מ לאיטום תקין של הממברנה התאית סביב microelectrode. לכן חשוב להשתמש מלוחים גבוה סידן לניסויים אלה. לבסוף, אחד מומלץ לחקור את ההשפעות של סידן חיצוני על mechanotransduction באמצעות מגוון של ריכוזי סידן. במקרים אלה, חשוב לזכור כי ריכוזי סידן מתחת ל -1 מיקרומטר בדרך כלל להוביל לקרע טיפ-link ואובדן בלתי הפיך של תמרה 28. שתי ההכנות ניסיון המתואר כאן מאפשרות מגוון של מדידות biophysical על תאי שיער. עם זאת, מדידות נוספות יכולות להתבצע עם שינויים קלים כדי ההכנות הללו. בהכנת saccular המקופלת, חבילות שיער הם דמיינו רוחביים. הדמיה בתנועה שיער חלק מחבילה מנקודת תצפית זו מגלה mot קוהרנטיתיון של שני stereocilia הקצר והגבוה 29. הנה המקולה saccular מופרדת ראשונה מרקמות הבסיס שלה ובהמשך מקופל לאורך הציר המוגדר על ידי עצב saccular כך צרורות שיער פן כלפי חוץ הם דמיינו רוחביים בקפל. מודיפיקציה שני, דיסוציאציה שיער תאים, מאפשר המחקר הן של הצרור של תא שיער סומה שלה. תאי שיער הם ניתקים מכאניים על גבי זכוכית נושאת עבור הקלטת הדמית אלקטרו 30. לבסוף, בתאי השיער ניתן הנמתח מן האפיתל על ידי ביצוע פרוטוקול דיסוציאציה דומה אך ללא הצעד ניתוק מכני. תוצאות טיפול זה בתאי השיער בהדרגה extrude מתוך האפיתל, מתן גישה basolateral עבור הקלטות אלקטרו תוך מזעור נזק מכני. תכשירים אלה ושינויים רבים שלהם להפגין את הרבגוניות של הצפרדע sacculus כמערכת מודל עבור biophysicalמחקר של תאי שיער חושיים.

אברי acousticolateralis של יונקים בעלי ארכיטקטורה מורכבת שקר בתוך נישה אנטומיים שיכולים להיות קשים לגישה. לדוגמא, השבלול היונק מורכב מבוך התפתל והוא מוטבע בתוך העצם הטמפורלית העבה. בידוד של השבלול לעתים קרובות גורם ניזק מכני התא החושי שוכב בתוכו ולכן הוכיח להיות משימה קשה 1. חוקרי מערכת העצבים ובכך הפכו מודל מערכות אשר יותר חילוץ בקלות מן הקודשים של האוזן. אחת ממערכות מודל אלה, sacculus של צפרדע האמריקאי (רנא catesbeiana), במשך עשרות שנים הניב תובנות להכליל לתוך הפונקציה של מערכת השמיעה ואת שיווי המשקל. Sacculus הוא איבר מעורב פונקציה עם תפקידים חושיים בשתי שמיעה בתדירות נמוכה ותחושה סייסמיים. התאים החושיים של sacculus הם תאי השיער שלה, מתמרים מיוחדים שממירים אנרגיה מכאניתלאותות חשמליים בתוך האיברים השמיעתיים הווסטיבולארית. הקרנה מפני שטח הפסגה של כל תא שיער הנה למעשה אגודת שיער mechanosensitive שכוללת ציצת ​​מדורגים של microvilli המוגדל שנקרא stereocilia. העצות של stereocilia הסמוך הם מחוברים על ידי חלבוני filamentous טיפ-מקשרים מכאני תעלות יוני שער בתגובה לגירויים מכאניים 2, 3. למרות איברים שמיעתיים שיווי משקל להגיב לסוגים שונים של גירויים, הם חולקים מנגנון זיהוי משותף. אחידות זו היא תחילתה של תובנות רבות שנרכשו לתוך mechanotransduction שיער תאים באמצעות מחקרים של sacculus לצפרדע. לדוגמא, התהליך הפעיל של שיער התא נחקר בהרחבת האיבר הזה 4, 5, 6, 7, ואת צרור השיער מעסיק בתהליך רב-אנרגיה כדי לייצר מכניםעֲבוֹדָה. לא זו בלבד שהיא הוכחה כי תאי שיער ליצור עבודה פעילה 6, אבל מנגנונים נפרדים שבבסיס התהליך הפעיל מאפייני הכוונון של תא שיער כבר חשפו באמצעות מחקרים של צפרדע acousticolateralis איברים. אלה כוללים תנועתיות שיער חלק מחבילה פעילה 8 ותא שיער חשמלי תהודה 9, 10, 11 sacculus סלקטיביות תדירות הסינפסה הסרט של תא השיער 12 ב פטמית אמפיבי. של sacculus הצפרדע מושך מדעני מוח חושיים מסיבות רבות. בניגוד השבלול היונק, האיבר הזה נמצא בתוך הקפסולה otic נגיש בקלות. שנית, בתאי השיער בתוך האיבר הזה יכול להישאר בריאים במשך כמה שעות תחת תנאים מתאימים 13, 14. זה מאפשר experimentatיון על תאים אלה על לוחות זמנים ארוכים יחסית לעמיתיהם היונקים שלהם. שלישית, האיבר נושא עקמומיות קטנה, המתיר מניפולציה קלה. רביעית, כל איבר מורכב שיער אלף תאים או יותר 15, מתן גם תפוקה גבוהות סבירות גבוהה איתור של סט מתאים של תאי שיער עבור בניסוי נתון. לבסוף, של sacculus הצפרדע היא דמיינה בקלות בשל הרזון של האיבר הזה וגודל גדול של תאי השיער שלה. מאפיינים אלה מספקים גמישות רבה לחקר תאי חושי בתוך של sacculus לצפרדע. בהתאם השאלה שעל הפרק, אחד ההכנות ניסיוני כמה ניתן המתקבל sacculus. הפשוט שבהם הוא הכנת חד קאמרית. כאן sacculus היא משותקת בתא מלא perilymph מלאכותית, מלוח נתרן עשיר גבוה סידן. הכנה זו מאפשרת הלימוד של זרמי תא שיער ומכניקה צרור שיער בסיסית. תצורה שנייה, הכנה שני הקאמרי, יכולה לשמש כדי לחקור תנועות צרורות שיער ספונטניות. כאן בצד הפסגה של תאי השיער חשוף מלוחים אשלגן-עשיר בסידן עניים כינה endolymph מלאכותית, בעוד הצד basolateral טובל perilymph מלאכותית. תאים אלה שני לחקות את הסדר in vivo של Salines ולספק סביבה המאפשרת צרורות שיער להתנדנד באופן ספונטני. אנו מתארים במאמר זה ההכנה של sacculus הצפרדע למחקר ביו-תאי השיער החושיים שלה. אנחנו ראשונים לספק תיאור מפורט של הבידוד של האיבר הזה מהאוזן הפנימית של הצפרדע. לאחר מכן, אנו מתארים הם אחד ו הכנות ניסיון שני הקאמרי וכוללים תוצאות נציג עבור כל תצורה.

<table><tbody><tr><td><חזק>משותף לשני התכשירים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה סטריאו</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>Tricaine methanesulfonate</td><td>Sigma</td><td>E10521</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים מוט</td></tr><tr><td>צנרת מתכת</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-01</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים של Vannas</td><td>מדע משובח כלים</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה ונורה מזכוכית פסטר (x2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-042816</td><td></td></tr><tr><td>ריסים עדינים המורכבים על מחט היפודרמית</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-557-172</td><td></td></tr><tr><td>גריז ואקום Dow-corning</td><td>מזרק Fisher Scientific</td><td>14-635-5C</td><td></td></tr><tr><td>לוואקום גריז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-829-45</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים צלחת</td></tr><tr><td>פטרי 35 מ"מ (x2 - 3)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-772A</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>בחולץ מיקרופיפטה</td><td>סאטר</td><td>P-97 או P-2000</td><td></td></tr><tr><td>120 V חולץ</td><td></td><td></td> סולנואיד <td>תוצרת בית, ראה רשימת חלקים</td></tr><tr><td>ציפוי מקרטע</td><td>Anatech ארה"ב</td><td>האמר 6.2</td><td></td></tr><tr><td>מקור נוכחי ליונטופורזה</td><td>Axon Instruments</td><td>AxoClamp 2B</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>במפעיל פיזואלקטרי</td><td>Piezosystem Jena</td><td>P-150-00</td><td></td></tr><tr><td>מגבר למפעיל פיזואלקטרי</td><td>Piezosystem Jena</td><td>ENV800</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>להכנה חד-תאית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגבר מיקרואלקטרודה</td><td>Axon Instruments</td><td>AxoClamp 2B</td><td>יכול לשמש להקלטות יונטופורזה ומיקרואלקטרודות בו זמנית</td></tr><tr><td>פינים מגנטיים (x2)</td><td></td><td></td><td>תוצרת בית, ראה רשימת חלקים</td></tr><tr><td>תא פתוח עם יריעה</td><td></td><td></td> מגנטית <td>תוצרת בית, ראה רשימת חלקים</td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog</td><td>Comments</td></tr><tr><td>להכנה דו-קאמרית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא</td><td></td><td></td> <td>עליוןקובץ משלים 1</td></tr><tr>תא <td></td><td></td><td>תחתון שוקת</td><td>קובץ משלים 2</td></tr><tr><td>רדיד אלומיניום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>01-213-100</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים בלוק</td></tr><tr><td></td><td></td><td>הרכבה</td><td>קובץ משלים 3</td></tr><tr><td>מקלות מוליך מעץ</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-400-112</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>יריעת טפלון</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td>8545K12</td><td>עבור מוליך טפלון</td></tr><tr><td>דבק ציאנואקרילט</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>רקמות מעבדה (Kimwipes)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-666A</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1914</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>אפוקסי להגדרה מהירה</td><td>McMaster-Carr</td><td>7605A18</td><td></td></tr><tr><td>18 מ"מ כיסויי זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-546</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>מלח components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td></td><td></td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td><td></td></tr> <tr><td>CaCl2 &bull; 2H2</td><td>O Fisher Scientific</td><td>10035-04-8</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-100G</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr> D<tr><td>-(+)-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>ניתן להשתמש</td></tr> <tr><td>במקורות אחריםname</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments/Description</strong</td></tr><tr><td>>רשימות חלקים לציוד תוצרת בית</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solenoid Puller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solenoid</td><td>Guardian Electric</td><td>A420-065426-00</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>מתג דוושת רגל</td><td>Linemaster</td><td>T-51-SC36</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים מחזיק</td></tr><tr><td>פיפטה</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH900R</td> ניתן <td>להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>מניפולטור גס</td><td>Narishige</td><td>Group MM-3</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>בחוט פלטינה</td><td>Alfa Aesar</td><td>25093</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>Leica</td><td>Z050-261</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות/תיאור</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>סיכות מגנטיות</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אפוקסי</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td>7556A33</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>אלומיניום בעובי 1 מ"מ</td><td>McMaster-Carr</td><td>89015K45</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים ניתן להשתמש בסיכות</td></tr><tr><td>חרקים</td><td>Fine Science</td><td>Tools 26000-40</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>שם</td><td>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות/תיאור</td></tr><tr><td>מגנטי פתוח תא</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>פס מגנטי גמיש</td><td>McMaster-Carr</td><td>5759K75</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr><tr><td>אלומיניום בעובי 1 מ"מ</td><td>McMaster-Carr</td><td>89015K45</td><td>ניתן להשתמש במקורות אחרים</td></tr></tbody></table>

הכנה פיזיולוגית של תאי שיער מן sacculus של הבוקסר האמריקאי (<em&gt; רנא catesbeiana</em&gt;)

Physiological Preparation of Hair Cells from the Sacculus of the American Bullfrog (Rana catesbeiana)

המחקר של השמיעה ושיווי המשקל נשען על תובנות שנשאבו מחקרים biophysical של מערכות מודל. מודל אחד כזה, את sacculus של הצפרדע האמריקנית, הפך תווך של מחקר שמיעתי שיווי משקל. מחקרים של האיבר הזה חשפו כיצד חושי בתאי שיער יכול לזהות אותות פעילים מהסביבה. בגלל המחקרים הללו, עכשיו אנחנו מבינים טוב יותר את gating ולוקליזציה מכני של ערוצי התמרה של תאים שיער, תפקידו של הסידן הסתגלות מכני, ואת הזהות של זרמים תא השיער. איבר נגישות גבוהה זו ממשיך לספק תובנה פעילותם של תאי שיער. כאן אנו מתארים את ההכנה של sacculus הצפרדע ללימודי biophysical על תאי השיער שלה. אנו כוללים את ההליך לנתיחה המלא לספק פרוטוקולים ספציפיים עבור הכנת sacculus בהקשרים ספציפיים. אנחנו גם כוללים תוצאות נציג השימוש בתכשיר, לרבות חישוביחס עקירה בכוח מיידי של שיער צרור ומדידה של תנודה ספונטנית של אגד.

האפיתל החושית של sacculus של הצפרדע יכולה להיות מועסקת בתצורות שונות כדי לחקור את הפיסיולוגיה של תאי שיער. מכיוון הרקמה הוא שטוח יחסית, זה יכול להיות מותקן בשני חד והכנות שני קאמריות. התצורה חד התא מספקת התקנה פשוטה עבור קלטות אלקטרו ו micromechanical של תאי שיער. הכנת שני הקאמרית במקום מדמה היא endolymphatic ותאי perilymphatic על בהתאמה צדדי apical ואת הבסיס של תאי שיער. תאים אלו יחד מספקים סביבה-רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לחקר mechanotransduction ידי תאי שיער. המאפיינים רגישי תמרה של תאי שיער בבסיס התגובה החשמלית שלהם לגירוי מכאני. כדי לחקור תכונות אלה, הקליטו בו זמנית מתוך שיער בודד לתא עמדת הצרור שלהפוטנציאל קולטן של התא (איור 2). אנחנו ראשונים צרפנו סיבי זכוכית גמישים הנורה kinociliary של צרור שיער ליישם פולסים כוח. לאחר מכן, אנו מודדים את העקירה של צרור השיער באמצעות (איור 2 א) מערכת 2 כפול photodiode. אנחנו ובמקביל רכשנו את הפוטנציאל של שיער התא על ידי impaling התא עם microelectrode חדה. השגנו עקומת עקירה-תגובה על ידי התוויית תגובת מתח השיא שהושרה על ידי כל גירוי מכאני נגד העקירה המקבילה של השיער הצרור (איור 2 ב). שיער התגובה החשמלית של תא המרווה היא קיצון positive- ושלילית עקירה. צמצום פוטנציאל הממברנה בצעדי תזוזה שליליים מעיד על קיומו של מנוחה פנימה נוכחי mechanotransduction. נוכחי מנוחה זו היא מווסת על ידי הפעולה של Ca 2 + משתי ההסתגלות המהירה ואיטית 17, 18, 19, 20, 21. ההתנהגות של שיער תא תלוי לא רק על התכונות החשמליות שלה, אלא גם על micromechanics של צרור השיער החושי שלה. מחק תצורת שני קאמרי הפרדת endolymph ו perilymph in vivo, מתן תנאים אידיאליים עבור המחקר של המכניקה של צרור שיער. בתנאים אלה ועם קרום otolithic המוסר, חבילות שיער יכולות להתנדנד באופן ספונטני 6. הנה שיישמנו הכנת השנייה הקאמרית להעריך את micromechanics צרורה בודד. הקלטנו את תנודות ספונטניות של צרור שיער על ידי ומטילה צל על צג עקירה כפול photodiode (איור 3). כדי להעריך את התפקיד של גנטמיצין aminoglycoside אנטיביוטי על mechanotransduction, אנו iontophoretically rele<html> ased גנטמיצין ישירות על גבי צרור שיער (איור 3). ריכוז גנטמיצין שוחרר עולה באופן יחסי עם הזרם עבר דרך micropipette. גנטמיצין מעכב בתנודה של צרור שיער ומשרת סטטי הקיזוז הצרור לכיוון הצד הגבוה שלה. תופעות אלה משקפים את התפקיד של גנטמיצין כמו חוסם פתוח ערוצים המקיים במצב הפתוח של ערוצי mechanotransduction תוך חסימת הנקבוביות החלחול שלהם. Iontophoresis של כימיקלים טעונים מתיר מקומי ושחרור לכימות של כימיקלים בריכוזים שונים בהעדר הפרעה מכאנית הנגרמת זרימת נוזל ובכך הוא אידיאלי לחקר אברונים mechanosensitive כגון צרור שיער 22. הצעה ספונטנית של שיער צרור נובעת הגומלין בין הסתגלות וקשיחות צרור קוי 7,Xref &quot;&gt; 8, 23, 24. תנועה ספונטנית זוהי חתימה של תהליך הפעיל של שיער צרור, אשר ממיר אנרגית אות לעבודה מכאנית להתגבר גרור צמיג. צרורות שיער הוכחו להפגין קשיחות מיידית קוית של שיווי המשקל 2, שמיעה 25, ומערכות לרוחב-קו 26. אנחנו ישירות מדדנו את הקשיחות המיידית של צרור שיער בודד מתוך של sacculus הצפרדע (איור 4). כדי להשיג זאת, אנו מצמידים קצה סיב זכוכית גמיש כדי נורת kinociliary של השיער הצרור (איור 4 א). סיפקנו כוחות אל צרור שיער על ידי תפיסת הבסיס של סיבים. הכח המופעל על צרור השיער על ידי סיבי הגירוי תואם את ההבדל בין ההתקות של bas של הסיביםדואר קצה, כשהוא מוכפל של קשיחות סיבים 2, 27. מתן פולסים על פני מגוון של כוחות מגלה קשר בין הכח המופעל על הצרור ואת העקירה שהתפתחה של האגד. השיפוע ביחס לכוח-עקירה זו תואם את הקשיחות המיידית של השיער הצרור (איור 4 א). שיטה זו אפשרה לנו למדוד ונוקשות מיידי של צרור הפרט כפונקציה של הסטייה שלה (איור 4B). עקומת כוח-העקירה המיידית מציגה מערכת יחסים ליניארית, חושף נוקשות קויות של הצרור על פני טווח של כ -20 ננומטר סביב למצב ההמנוח שלו. מחוץ לטווח זה, צרור השיער מתנהג כמו חומר Hookean, הנוקשות שלה היא ליניארי עבור סטיות גדולה בסולם ריכטר. תוצאות אלו demonstלדרג את הרבגוניות של צפרדע sacculus בחקר הפיזיולוגיה שיער תאים. באמצעות תכשירים אחרים ואלה, ואפשר לטייל בה mechanotransduction בשלבים מרובים בהעברת מידע מהצרור לכיוון המוח. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig1.jpg" /> איור 1: Dissection של האוזן הפנימית של הבוקסר. (א) צופה בחיך העליון של הצפרדע מצד הגחון שלה ניתן לזהות את חצוצרת השמע (העיגול). השתקפות לרוחב של העור המכסה את הצד הימני של החיך העליון מגלה את מיקומו של האוזן הפנימית (תיבה מקווקות). הסרה (B) של הסחוס בצד הגחון של העצם הטמפורלית של הצפרדע פותחת את הקפסולה otic (קו מקווקו). (ג) הוצג הוא תמונה בהגדלה גבוהה יותר של הקפסולה otic, שבו sacculus, lagena, CN VIII, ו sacc<html> עצב תואר בלבד ניתן לזהות בקלות. (ד) נוכח הקפסולה otic לאחר הסרת האיברים באוזן הפנימית מגלה את מיקומם של התעלות הסמי. (ה) לאחר הסרת האוזן הפנימית המבודדת, sacculus, lagena, ו- VIII ה עצב גולגולתי (VIII CN) ניתן לזהות בקלות. (ו) sacculus המבודד בעל גדם קצר של עצב saccular ו קרום otolithic שוכב על גבי האפיתל החושית שלה. תוויות מתאימות (i) sacculus, (ii) lagena, (iii) CN VIII, (iv) העצבים saccular, ו (v) קרום otolithic. ציר תוויות P ו- A מתאימה בהתאמה להנחיות האחוריות קדמיות. ברים סולם מייצגים 1 ס&quot;מ (A, B), 1 מ&quot;מ (C, D, E), ו -400 מיקרומטר (F). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> s &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן להורדת גרסה וקטור של נתון זה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig2.jpg" /> איור 2: Curve תגובת תזוזה עבור תא שערה אחת. (א) קצה סיב גירוי זכוכית היה מצמיד את נורת kinociliary של צרור שיער והבסיס של הסיבים נעקר ובהמשך פני תשע פסיעות בדידות. העמדה הצרורה הייתה במעקב על מערכת הכפולה-פוטו-דיודה, ופוטנציאל הקולטן שלו נמדד בו זמנית באמצעות microelectrode שתפוקתם נחקקה דרך מגבר במצב גשר. התנגדות טיפ של האלקטרודה הייתה 95 MΩ ואת פוטנציאל הממברנה המנוחה של הצרור היה -47 mV. (ב) עלילה של פוטנציאל קולטן של הצרור כפונקציה של העקירה שלה חושפת מערכת יחסים לינארית בין תגובת הצרור שלהעמדה. כל נקודה תואמת את העקירה ולהתכוון ממוצע מעל חלון 2.5 ms זמן, החל 2.5 מילישניות לאחר הופעת הגירוי מכאני. כל צבע מייצג סט של סדרת הזמן המתאימה לאותו דופק העקירה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/Figure2_Xd_Xc_Vm_version4.eps" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד בגרסה וקטורית של נתון זה.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig3.jpg" /> איור 3: השפעת גנטמיצין על תנודה Bundle ספונטני שיער. התנועה הספונטנית של צרור שיער תכשיר השני קאמרי נרשמה באמצעות מערכת פוטו-דיודה כפולה. בהיעדר שחרור iontophoretic של גנטמיצין (0 Na), השיערצרור מציג תנודות סימטריות. כמו גודל של זרם עבר דרך פיפטה iontophoretic מלא 500 מ&quot;מ סולפט גנטמיצין גדל (10 נה, 20 Na), תדירות טיולים שיער חלק מחבילה נופל באופן תלוי מינון ואת צרור מקוזז לכיוון קצה גבוה שלה למשך זמן ארוך יותר תקופות זמן. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/Figure3_GentaSpontOsc_version2.eps" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד בגרסה וקטורית של נתון זה.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55380/55380fig4.jpg" /> איור 4. חישוב קשיחות המיידי של שיער Bundle. (א) סיבי גירוי (אדום) של קשיחות K F מצמיד to נורה kinociliary (החום) של צרור שיער בודד (צהובה). לעקירתם בבסיס סיבים במרחק ידוע X F גורם צרור להעביר B X המרחק. ההבדל בין ההתקות של סיבים ואת הצרור הוא יחסי הכח המופעל על הצרור ידי סיבי הגירוי, F F. חזרה זו על פני מגוון של כוחות מניב יחס כוח-עקירה מיידי (מימין), השיפוע אשר תואם את הקשיחות המיידית של השיער הצרור. (ב) צרור פרט היה נתון לכפות פולסים בעצמה גוברת והתזוזה שלה בתוך 50 ms הראשונים לאחר הופעת הדופק נמדדה (נקודות כחולות). הנה צרור שיער מציג קשיחות קוית מיידית על פני טווח של כ 20 ננומטר סביב למצב ההמנוח שלו. עקומת אדום מתאים לנכון היחס F = k * X - * 60 * z (1 / (1 + exp (- z *<html> (X - X 0) / (k B * T))) + F 0, שבו F הוא הכוח המופעל על הצרור, X הוא עקירה של צרור, k = 790 ± 51 μN ∙ מ -1 הוא צרור של קבוע כאשר נוקשים כל הערוצים הם או סגורים או פתוחים, z = 0.43 ± 0.04 pN הוא הכח של קפיץ gating יחיד, X 0 = 2 ± 1.9 ננומטר הוא המיקום של הצרור שבה 50% של הערוצים שלה פתוחים, B k הוא בולצמן של מתמיד, T היא הטמפרטורה, ו- F 0 = 11.7 ± 1.3 pN הוא כוח לקזז. התאמת בעל מקדם הסבר של 0.98. סיבי הגירוי היו נוקשות של 107 μN ∙ -1 מ &#39;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55380/55380fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> es / ftp_upload / 55,380 / Figure4_v5.eps &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן להורדת גרסה וקטור של נתון זה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> המומס </td><td rowspan="2"> משקל פורמולה (g / mol) </td><td colspan="2"> הוסף 1 L </td></tr><tr><td> perilymph מלאכותית </td><td> endolymph מלאכותית </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.4 </td><td> 6.54 גרם </td><td> 0.117 גרם </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 0.149 </td><td> 0.149 גרם </td><td> 8.62 גרם </td></tr><tr><td> CaCl 2 ⦁ 2H 2 O </td><td> 147 </td><td> 2 מ&quot;ל של 1 M CaCl 2 המניות </td><td> 250 μL של 1 M CaCl 2 מניות </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 238.3 </td><td> 1.19 גרם </td><td> 1.19 גרם </td></tr><tr><td> D - (+) - גלוקוז </td><td> 180.2 </td><td> 0.541 גרם </td><td> 0. 541 גרם </td></tr></tbody></table> פתרונות לוח 1. לנתיחת הכנה ניסויית. מוצגים בלוח זה הם מתכוני perilymph מלאכותית ופתרונות endolymph מלאכותיים המשמשים לנתיחה בהכנות אחת או שני קאמריות. הפתרונות להביאן 7.2 pH - 7.4 עם כ -2 מ&quot;ל של NaOH (perilymph) או 2 מ&quot;ל KOH (endolymph). כוחו האוסמוטי צריך לקרוא כ 230 מילימול · קילו -1 עקב ניתוק יוני שלם.

של הצפרדע האמריקנית (רנא catesbeiana) sacculus מתיר בדיקה ישירה של פיזיולוגית שיער תאים. כאן לנתיחה וההכנה של sacculus הצפרדע ללימודי biophysical מתוארת. אנחנו מראים ניסויי נציג מתאי שיער אלה, לרבות חישוב יחס כוח-העקירה של צרור והמדידה של התנועה המאולצת שלה.

הכנה פיזיולוגית של תאי שיער מן Sacculus של הבוקסר האמריקאי (<em&gt; רנא catesbeiana</em&gt;)

The study of hearing and balance rests upon insights drawn from biophysical studies of model systems. One such model, the sacculus of the American ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להכין את הסקולוס (sacculus) של צפרדע השור (bullfrog) למחקרים מיקרו-מכניים וביו-פיזיקליים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירו-מדע החושי: כיצד תאי שיער שמיעתיים ווסטיבולריים מסתגלים?מה גורם לתנודה ספונטנית של צמורי השערות וכיצד תאי השערה מגיבים באופן פעיל לגירויים מכניים. טכניקה זו מאפשרת גישה קלה לתאי שערה הנשארים בריאים למשך מספר שעות. מכיוון שתאי השערה הם שבירים ורגישים מבחינה מכנית, שימור של תקינותם עלול להתגלות כקושי במהלך הליכים אלו.כאן אנו מספקים הדגמה חזותית של שיטה זו, כדי שאחרים יוכלו ליישם טכניקות נכונות לטיפול ברקמות ולהשיג הצלחה במחקרים ביופיזיקליים של האוזן הפנימית. התחילו בהנחת ראשו של צפרדע שורתית שכרתה זה עתה תחת מיקרוסקופ דיסקציה סטרילי. התיבה המקווקו בתמונה זו מראה את מיקומה של האוזן הפנימית.השתמש בסקלפל כדי לבצע חתך בקו האמצע דרך רקמת החיך, מהשיניים הוומריניות ועד לקצה האחורי ביותר של הרקמה. לאחר מכן, בצע חתכים אופקיים בעזרת הסקלפל כדי לנתק ולנקות כל שריר הנמצא מתחת לרקמת החיך, במטרה לחשוף את הסחוס האחורי. לאחר הסרת השריר, התבונן בצורת ה"סוכרייה על מקל" של הסחוס הטמפורלי המהווה את הגבול של הקפסולה האוטיקה.נתקו את ה-columella בנקודת המגע שלה עם הסחוס של הקפסולה האוטיקה (otic capsule). לאחר מכן, בצעו חתכים אופקיים רדודים חוזרים דרך הסחוס כדי להסיר מספר שכבות דקות. הימנעו מחתכים עמוקים כדי למנוע נזק לאיברי האוזן הפנימית.הפסיקו את הגילוח ברגע שקפסולת האוזן (otic capsule), הנמצאת בתוך מבנה ה"סוכרייה" (lollipop structure) של הסחוס הרקותי, נפתחת ואיברי האוזן הפנימית נראים, כפי שמוצג בתמונה זו. לאחר מכן, גזמו את הקצוות האחוריים והצדיים של קפסולת האוזן, תוך הקפדה לא לפגוע באיברי האוזן הפנימית. זרימו תמיסת סלין על איברי האוזן הפנימית בתדירות גבוהה כדי להבטיח שהם יישארו טבולים ולחים לאורך כל תהליך הנתיחה.כעת, אתרו את שני הפתחים המעגליים בעצם הרקה בחיבור המדיאלי של הסחוס לקו האמצע. חתכו כלפי מטה דרך הפתח המדיאלי ביותר כדי לשבור את עצם הרקה. לאחר מכן, בצעו חתך שני כלפי מטה דרך הקפסולה האוטיקה (otic capsule) בשוליה הפוסטורלית-לטרלית שלה.הפר את פיסת הסחוס שבין חתך זה לחתך הקודם כדי לאפשר גישה לאיברי האוזן הפנימית. פעולה זו קוטעת את התעלה החצי-עיגולית הקרובה ביותר, שניתן להשתמש בה לאחר מכן כידית למניפולציות נוספות. לאחר מכן, תוך הקפדה לא לגעת ב-sacculus, קטוע את ה-lagena ואת העצב הגולגולתי השמיני בגובה ה-Scarpa's ganglion.תוך כדי החזקת האמפולה של התעלת חצי-המעגלי הקרובה ביותר, סובב בעדינות את האוזן הפנימית ונתק את שתי התעלות חצי-המעגליות שנותרו. תוך כדי החזקת העצב או אמפולת התעלה חצי-המעגלית, הוצא את האוזן הפנימית מהראש והנח אותה בצלחת מלאה במי פרילימף מלאכותיים מקוררים ומחומצנים. הסרת האוזן הפנימית מאפשרת ויזואליזציה של המעברים בתוך עצם הרקה שבהם עברו בעבר התעלות חצי-המעגליות.ניתן לזהות את ה-sacculus לפי המסה הגדולה והרחבה של ה-otoconia והעצב הסקולרי על פני השטח. זהו את ה-sacculus ולאחר מכן גזרו את התעלות החציות (semi-circular canals) כדי להפוך את האוזן הפנימית לקלה יותר לתמרון. לאחר מכן, בצעו חתכים עדינים מסביב להיקף ה-perilymphatic cistern המכסה את הצד העצבי של ה-sacculus.נתקו את עמודי הרקמה הקטנים המגשרים בין ממברנת הציסטרנה לצד העצבי של הסקולוס (sacculus) והסירו את הציסטרנה. לאחר מכן, הסירו את העצב המוביל לאוטריקולוס לגנה (utriculus lagena) ואת עצב הלגנה (lagena). לאחר מכן, תוך כדי החזקת העצב הסקולרי, הרימו בעדינות את הסקולוס וחתכו דרך הממברנה הדקה של שק האוטוקוניה (otoconia sac); כאשר האוטוקוניה נשפכת מהשק, שחררו את הסקולוס על ידי חיתוך מסביב להיקפו.השתמשו במספריים או בפינצטה כדי לנגב בזהירות את כל האוטוֹקוֹנִיָּה (otoconia) שנותרו על הסקולוס (sacculus). היזהרו לא לגעת בסקולוס במהלך תהליך זה. כעת, גזרו כל שארית של ממברנת האוטוקוניה משולי הסקולוס כדי למנוע הידבקות של הממברנה למשטחי פלסטיק וזכוכית.לבסוף, זרימו מי מלח בעדינות מעל ה-sacculus באמצעות פיפט פסטור, כדי להסיר שאריות של otoconia. ה-sacculus בבידוד מוצג כאן בפירוט. הקו המקווקו מתווה את מיקומה של ממברנת האוטוליטה (otolithic membrane) ואת המקולה החושית שמתחתיה, המכילה תאי שיער.בעזרת החלק האחורי של פיפט פסטר עם קצה שבור, העבירו את הסקולוס (sacculus) המבודד לצלוחית פטרי המכילה Proteus 24 Solution. לאחר מכן, דגרו את הרקמה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 22 degree celsius. העבירו כל סקולוס שעבר עיכול לתא ניסוי פתוח, וקבעו את הרקמה באמצעות פינים מגנטיים.לאחר מכן, השתמש בריס של ריס עדין כדי להסיר את קרום האוטילית (otolithic membrane) העליון ולחשוף את המקולה של הסקולוס (saccular macula) המכילה את תאי השיער. לאחר בידוד הסקולוס (sacculus), מלא את בלוק הקיבוע בפרילימף סינתטי. לאחר מכן, מרח שתי נקודות של גריז ואקום על פתח אחד, והנח מעליו אלומיניום מחורר ליצירת איטום חלש.לאחר מכן, העבירו את ה-sacculus אל הרדיד, וממרכזו מעל החור כאשר ה-macula פונה כלפי מטה והבסיס של העצב פונה כלפי מעלה. השתמשו בחתיכת רקמה מפותלת כדי לשאוב סלין מהצד הנגדי של תא ההרכבה, על מנת ליצור אטימה הדוקה בין ה-sacculus לרדיד ההרכבה. ספגו את הסלין שמסביב ל-sacculus מפני השטח של ריבוע האלומיניום.השתמשו במורח פולי-טטרהפלואורואתילן כדי למרוח במהירות דבק ציאנואקרילט לאורך הגבול שבין קצה ה-sacculus לריבוע האלומיניום. ודאו שכל היקפו של ה-sacculus מכוסה בדבק. בעת מריחת דבק הציאנואקרילט, השתמשו במורח כדי להנחות את הדבק מסביב לקצה הרקמות תוך הימנעות ממגע ישיר.המטרה היא להשיג איטום מלא כדי לבודד את המדורים האנדולימפטיים והפרילימפטיים. פעלו במהירות כדי למנוע מהדבק לזלוג אל גב הרקמה. הניחו טיפה של תמיסת סלין על גבי הרקמה המקובעת כדי לקשח את הדבק.שכבה דקה של דבק עלולה להיווצר על גבי טיפת הסליין; אם כן, הסרה באמצעות פינצטה. הסר בזהירות את הרדיד מבלוק הקיבוע. הפוך את הרקמה המקובעת כך שצד המקולה של הסקולוס (sacculus) פונה כלפי מעלה והנח אותה לצוף בצלחת פטרי מלאה בפרילימף מלאכותי.הוסף טיפה אחת של Proteus 24 Solution על גבי המקולה (macula) והדגר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 22 degree celsius. לאחר ההדגרה, מלא את התעלה התחתונה של מכשיר שני התאים ב-perilymph, ומריח גריז ואקום מסביב לתא המרכזי. הנח את הסקולוס (sacculus) המורכב על רדיד על התא התחתון, כאשר העצב פונה כלפי פני התא.מרחו גריז מסביב להיקף הרדיד. הניחו את התא העליון של מערך ההכנה על הרדיד, תוך הקפדה על יצירת אטם מלא באמצעות גריז הוואקום. מלאו את התא העליון באנדולימפה מלאכותית מבעבעת, ולאחר מכן הסירו בעדינות את קרומי האותוליט בעזרת עטריה, כדי לחשוף את התווך של השקיק (saccular media) המכיל את תאי השערה.תמונה זו מציגה את תוצאות ההעתקה של צרור השערות בצעדים בדידים. העתקת הצרור נמעכבה באמצעות מערכת דיודות פוטו כפולה עם מדידה סימולטנית של פוטנציאל קולטן באמצעות מיקרו-אלקטרודה חדה. גרף של פוטנציאל הקולטן של הצרור כפונקציה של העתקתו חושף קשר לא ליניארי בין תגובת הצרור לבין מיקומו.כל צבע מייצג סדרה של סדרות עתים, התואמות לאות פעימת ההעתקה. כאשר נצפים מלמעלה, צרורות שערות בהכנה בעלת שני תאים תנודדים באופן ספונטני. בהיעדרו של שחרור ביוניטופוריה של gentamycin, צרור שערות מציג תנודות סימטריות.לאחר מכן, ככל שעוצמת הזרם העוברת דרך פיפטה יוניטופורטית המלאה ב-500 millimeter gentamycin sulfate עולה, תדירות התנודה של צרור השערות יורדת באופן התלוי במינון, והצרור מוסט לעבר הקצה הגבוה שלו לפרקי זמן ממושכים יותר. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו ב-75 דקות. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות ניסיוניות כגון אלקטרופיזיולוגיה ודפיקה של עומס מכני (mechanical load clapping) כדי לחקור את התהליך האקטיבי של תאי השערה.טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוירוביולוגיה של החושים, כדי לחקור את המכניקה של השמיעה והשיווי משקל בחולייתנים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן הכנת ה-sacculus של צפרדע השור (bullfrog) לצורך חקירה ביופיזית של פיזיולוגיית תאי השערה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

physiological-preparation-hair-cells-from-sacculus-american-bullfrog

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Whole-cell-clamp תיקון הקלטות של עצב השמיעה דנדריטים סיבים בבית סינפסה סרט פנימי תא שיער שבלול יונקים.

הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

שיטה אמינה לחקור תא השיער החיצוניים (OHC) תגובות ניעתי, כולל electromotility, תנועתיות איטית כיפוף, הוא תיאר. תנועתיות OHC הוא שהושרו על ידי גירוי חיצוני עם שדה חשמלי לסירוגין, ואת השיטה מנצלת את הקלטת במהירות גבוהה התמונה, מבוססי LED תאורה, הדור האחרון התמונה תוכנת ניתוח.

חקירות תנועתיות החיצונית Cell שיער עם שילוב של גירוי חיצוני לסירוגין שדה חשמלי במהירות גבוהה ניתוח תמונה

מטרת סרטון זה היא להדגים הליכים לקבלת תאי שיער בריאים, ללא פגע מהאיברים הפנימיים של דג זברת האוזן בוגר ולאחר מכן להשתמש בם ללימודים מהדקים תיקון שנועדו לאפיין את מאפייני biophysical של ערוציהם מתח המגודרים.

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

ניתוח של תפקוד תא שיער שיווי משקל הוא מסובך בשל מיקומם העמוק בתוך החלק הקשה ביותר של הגולגולת, העצם הטמפורלית petrous. רוב מחקרי תא שיער פונקציונליים השתמשו בחריפות תאי שיער מבודד. כאן אנו מתארים הכנה למחצה שלמה של האפיתל שיווי משקל עכבר למחקרי מיקרוסקופיה אלקטרו ושני פוטונים.

הכנה חצי שלמות מבודדת של האפיתל החושית שיווי משקל העכבר למיקרוסקופיה שני הפוטונים אלקטרופיזיולוגיה והרזולוציה גבוהה

מוצגת טכניקה פשוטה וחדשנית לרישום פריקה אפרנטית עקב גירוי מכני של מסופי lanceolate של קצות ה-palisade המעצבבים את עור אוזן העכבר, זקיקי שיער.

הקלטה משולב של תוויות מסוף פלט ועצב מבחינה מכנית מאולצת מביא ב Endings עכבר זקיק השיער אזמלי

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי להקליט התגובה גזע המוח של עכברוש לאחר הלידה הגורים. לבחון התפתחות תפקודית של תאים שיער החיצוני, ההליך ניסיוני של קלאמפ תיקון שלם-תא הקלטה בתאים מבודדים שיער החיצוני מתואר צעד אחר צעד.

גזע המוח השמיעתית תגובה והקלטה החיצוני תא שיער תיקון שלם-תא קלאמפ בחולדות כמחנכת

בנייר זה, נדון שלושה תכשירים המוח משמש עבור כל תיקון קלאמפ הקלטה ללמוד את המעגל retinotectal של ראשנים של צפרדע רפואית זריזה . כל הכנה, עם יתרונות ספציפיים משלה, תורמת ללקוחות שלנו ניסיוני של הראשן צפרדע רפואית כמודל ללמוד תפקוד מעגלים עצביים.

ההכנות ופרוטוקולים עבור כל תא, תיקון קלאמפ הקלטה של נוירונים Tectal צפרדע רפואית זריזה

מאמר זה מציג משטח שונה הכנה שבלול שיטה הדורשת decalcification ושימוש של תא ודבק רקמה לדבוק פיסות של epithelia לכסות 10 מ"מ כיסוי עגול עבור אימונוהיסטוכימיה העכבר למבוגרים כנימת.

הכנה לפני שבלול בעכבר למבוגרים

כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

הגוזל הוא אורגניזם מודל חסכוני, נגיש וזמין באופן נרחב למגוון מחקרים. כאן מפורטת סדרה של פרוטוקולים להבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתחדשות של האוזן הפנימית של העופות.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וטיפוח תאי שערת שבלול ראשוניים מעכברים. בתחילה, האיבר של קורטי נותח מהיילוד (בגיל 3-5 ימים) שבלול מורין תחת מיקרוסקופ. לאחר מכן, התאים עוכלו אנזימטית לתרחיף חד-תאי וזוהו באמצעות אימונופלואורסנציה לאחר מספר ימים בתרבית.

בידוד ותרבית של תאי שיער שבלול ראשוניים מעכברי יילודים

למד הכנה פיזיולוגית של תאי שיער מן Sacculus של הבוקסר האמריקאי (Rana catesbeiana) למחקר ביופיזיקלי. שיטה זו מאפשרת גישה לתאים בריאים למשך שעות ותומכת במחקרי מדעי החישה.

הכנה פיזיולוגית של תאי שיער מן Sacculus של הבוקסר האמריקאי (

גלה סרטונים נוספים