איתור והעשרה של נדיר- אנטיגן ספציפי בתאי B עבור ניתוח של הפנוטיפ ותפקוד

המטרה הכוללת של הליך פשוט אך יעיל זה היא לבודד ולהעשיר תאי B נדירים קושרי אנטיגן מדם היקפי אנושי באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים לניתוח הפנוטיפי והתפקודי שלהם. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האימונולוגיה לגבי הפנוטיפ והביולוגיה של תאי B נדירים קושרי אנטיגן לפני ואחרי מפגש אנטיגן in vivo. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מונעת בעיות הקשורות לגיאומטריה, במיוחד כאשר משתמשים בצלחת סטירן או בחרוז גדול.

וזה מונע בעיות הקשורות לקצב הזרימה כאשר מבודדים תאים על ידי זרימה ציטומטרית כדי לבודד תאים נדירים באוכלוסיות תאים התחלתיות גדולות למדי. מיד לאחר איסוף 30 עד 50 מיליליטר של דם מלא לתוך צינורות איסוף דם הפריניים, ערבבו את הדם ביחס של 1:1 עם מגנזיום סטרילי בטמפרטורת החדר ו-PBS ללא סידן. לאחר מכן, שכבו את תערובת הדם על 10 מיליליטר של תמיסת שיפוע צפיפות בטמפרטורת החדר בצינור חרוטי סטרילי של 50 מיליליטר באמצעות לחץ הדק פיפטה עקבי איטי.

הפרד את התאים באמצעות צנטריפוגה. השליכו את השכבה העליונה המכילה פלזמה וטסיות דם והשתמשו בפיפטה סטרילית כדי להעביר את מיכל התא החד-גרעיני לתוך צינור סטרילי חדש של 50 מיליליטר. מלאו את הצינור עד 50 מיליליטר PBS לשטיפת התאים החד-גרעיניים על ידי צנטריפוגה.

לאחר מכן, השעו מחדש את הגלולה ב-10 מיליליטר של PBS טרי לספירה והשעו מחדש את התאים בריכוז של 1x10^7 תאים למיליליטר ב-PBS טרי על קרח. כדי לצבוע את התאים לצורך קשירת חרוזים מגנטית, העבירו תחילה 1-2x10^6 aliquots תאים לצינורות פוליסטירן של חמישה מיליליטר עבור כל פיצוי פלואורסצנטי ובקרת פלואורסצנציה מינוס אחת לפי הצורך. לאחר מכן, אסוף את שארית דגימת התא על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הגלולה לריכוז של 3-6x10^7 תאים למיליליטר במאגר FACS קר מסונן סטרילי.

פצל את תמיסת התא באופן שווה לארבעה צינורות FACS על קרח והוסף קולטן Fcgamma אנושי חוסם ריאגנט לארבעת חלקי הדגימה הניסיוניים הללו. בתום הדגירה החוסמת הלא ספציפית, הוסף את הנוגדנים המתאימים לצביעה על פני התא הפלואורסצנטי המצומד לתאים בכל ארבעת חלקי הדגימה. לאחר מכן, הוסף את האנטיגן הביוטינילי המתאים לשברים A ו-D ואחריו הוספת נפח מספיק של אנטיגן לא מסומן לשבר B כך שרוב הקולטנים עם זיקה של לפחות 1x10^6 טוחנת חסומים.

דגירה של כל הדגימות למשך 30 דקות על קרח ואחריה דגירה של 30 דקות של חלק B עם האנטיגן הביוטינילי המתאים. בתום הדגירה, שטפו את התאים פעמיים במיליליטר אחד של מאגר FACS קר כקרח לכל 5x10^7 תאים. ולהשעות את הכדורים במיליליטר אחד של 2% פורמלדהיד לכל 5x10^7 תאים למשך חמש דקות בחושך על קרח.

לאחר הקיבוע יש לשטוף תאים פעמיים נוספות כפי שהודגם זה עתה. ולהשעות את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר FACS קר כקרח טרי לכל 5x10^7 תאים. לאחר מכן סמנו את התאים במיקרוגרם אחד עד שניים של הנוגדן המצומד המשני המתאים לסטרפטווידין למשך 20 דקות בחושך על קרח ושטפו את התאים פעמיים נוספות.

להעשרה מבוססת ננו-חלקיקים מגנטיים, השעו מחדש את שברי תאי A, B ו-C במיליליטר אחד של מאגר הפרדה קר לכל 5x10^7 תאים וסנן את התאים דרך מסננות בודדות של 40 מיקרוליטר כדי לחסל גושים. לאחר מכן, הוסף את ננו-חלקיקי הצבע הפלואורסצנטיים בריכוז המתאים למשך 10 דקות בחושך בארבע מעלות צלזיוס עם סיבוב ושטוף את הדגימות פעמיים במיליליטר אחד של מאגר הפרדה קר. השעו מחדש את הכדורים במיליליטר אחד של מאגר הפרדה קר לכל 5x10^7 תאים.

לאחר מכן אזנו שלושה עמודים מגנטיים על המגנטים בגודל המתאים שלהם עם שלושה מיליליטר של מאגר הפרדה כל אחד, מה שמאפשר לכל נפח מאגר ההפרדה לעבור דרך כל עמודה לתוך מיכל פסולת. כעת הנח צינור חרוטי אחד מסומן של 15 מיליליטר מתחת לכל עמודה והוסף את התאים המסומנים בחלקיקים המגנטיים לעמודות שלהם. כאשר כל הנפח של כל שבר תא עבר דרך כל עמודה, הוסף שלושה מיליליטר של מאגר הפרדה קר קרח טרי לראש כל עמודה, ואסוף את השפכים בצינורות המסומנים

לאחר שהכביסה השנייה התנקזה לחלוטין דרך העמודים, הניחו את הצינורות של תאים שנבחרו שלילית מכל שבר על קרח והעבירו את העמודים לצינורות חדשים של 15 מיליליטר לכל שבר. מלאו כל עמודה בכשישה מיליליטר של מאגר הפרדה טרי וצללו מיד את המאגר דרך העמודות כדי לאסוף את התאים הקשורים מגנטית. לאחר מכן אסוף את שברי התאים החיוביים והשליליים על ידי צנטריפוגה והשהה מחדש את הכדורים בתמיסה המתאימה לניתוח המתוכנן במורד הזרם.

בגרפים אלה, שכיחות תאי B ריאקטיביים של טטנוס-טוקסואיד מאדם שחוסן לאחרונה נגד טטנוס לפני יותר מעשור מדגימה את יכולתה של שיטה זו לשמש להעשרת התאים קושרי הרעלן של טטנוס בערך פי שבעה בטוהר של כ-4%תוספת של פי 50 של רעלן טטנוס לא מסומן לתאים מנבדק שחוסן כשלוש שנים לפני לקיחת הדם. לפני הוספת אנטיגן ביוטיניל, קשירת הטטנוס-טוקסואיד יורדת ב-83%, מה שמדגים את הספציפיות של קשירת האנטיגן. כאשר האנטיגן הביוטינילי מושמט מההליך, רק 0.2% מתאי B עדיין נקשרים, ככל הנראה, מה שמשקף את הקישור של אנטיגן שאינו טטנוס כלשהו בחומר הסופג.

גרפים אלה מדגימים כיצד תדירות תאי B נאיביים ספציפיים לרעלן טטנוס מדגימת דם שנלקחה שבעה ימים לאחר חיסון הדחף של נבדק בריא, יורדת מ-84% ל-64% לאחר הדחף. בעוד שאחוז אוכלוסיית הזיכרון והפלזמה עולה מ-16% ל-36% ואפס ל-40% בהתאמה. יתר על כן, נתונים מייצגים של ELISPOT מדגימת דם היקפית שהתקבלו שבעה ימים לאחר הדחיפה מנבדק בריא ממחישים את ההעשרה פי ארבעה בתדירות התאים המפרישים נוגדנים טטנוס-טוקסואיד שנצפתה בתאי B מבודדים קושרי טטנוס-טוקסואיד.

לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כשלוש עד ארבע שעות עם כל הפקדים המתאימים. ניתן לשלב את השיטה עם מבחנים משניים, למשל, העברת תאים לנמענים מאומצים למחקרים עוקבים על גורל התא ותפקודו. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבודד ולהעשיר תאי B נדירים קושרי אנטיגן מדם היקפי אנושי באמצעות הבקרות המתאימות.