Name: כימות מוחלט של Aβ 1-42 ב CSF באמצעות הליך מדידת הפניה ההמוני spectrometric (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: למד כימות מוחלט של Aβ1-42 בנוזל מוח שדרתי אנושי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מס תאומה. שיטה זו תקנית ללא שימוש בנוגדנים ומיועדת למחקר מחלת אלצהיימר ופיתוח תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו בוצעה מטעם קבוצת העבודה של הפדרציה הבינלאומית לכימיה קלינית בנושא חלבוני CSF, שיש לה את ההרכב הבא: קאי בלנאו (יו"ר) והנריק זטרברג, אוניברסיטת גטבורג, שוודיה; לס שו ומגדלנה קורצקה, אוניברסיטת פילדלפיה, פנסילבניה, ארה"ב; אינגריד זגרס, המכון לחומרי ייחוס ומדידות, גיל, בלגיה; פיוטר לבצ'וק, אוניברסיטת ארלנגן, גרמניה; ורנד ג'נקינס, המעבדה הביואנליטית PPD, ריצ'מונד, וירג'יניה, ארה"ב; רנדל בייטמן, אוניברסיטת וושינגטון, מיזורי, ארה"ב; ו-H Vanderstichele, Innogenetics NV, גנט, בלגיה. עבודה זו הייתה גם חלק מקבוצת העבודה של הקונסורציום העולמי לסטנדרטיזציה של סמנים ביולוגיים CSF Reference Methods, שבראשה עומדת ד"ר מריה קאריו, מנהלת בכירה ליחסים רפואיים ומדעיים, איגוד האלצהיימר. המחקר נתמך על ידי מועצת המחקר השוודית (מענקים #14002, #521-2011-4709 ו-#2013-2546); קרן קנוט ואליס ולנברג; Demensförbundet; ושל אמיל וורה קורנל, של איינה וולסטרום ומרי-אן סיובלום, של גאן וברטיל סטון, של מגנוס ברגוול ושל גמלא טינארינור.

הערה: פרוטוקול זה דורש aliquots של לפחות 50 μL, עם ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​עבור כל הפפטיד Aβ, כמו חומר המוצא. פפטידים Aβ צריך להיות מומס אצטוניטריל 20% (ACN) ו -4% פתרון אמוניה מרוכזים מים ללא יונים (v / v) המאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס. זהירות: ראה טבלה 1 עבור מידע בטיחות. 1. הכנה של פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ&quot;ל של 20% ACN ו -4% פתרון אמוניה מרוכזים מים ללא יונים (v / v) על ידי דילול 20 מ&quot;ל של ACN ו -4 מ&quot;ל של אמוניה מרוכזת (~ 25%) במים deionized. התאם את נפח סופי 100 מ&quot;ל עם מים ללא יונים. הפוך טרי מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של 5 M-hydrochloride guanidine ידי המסת 26.08 גרם של hydrochloride guanidine במים deionized לנפח סופי של 50 מ&quot;ל. חנות ב 20 ° C ולעשות חודשים טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200 מ&quot;ל של חומצה זרחתית 4% במים deionized (נ /v) על ידי דילול 9.4 מ&quot;ל של חומצה זרחתית מרוכזת (~ 85%) במים deionized. התאם את נפח סופי 200 מ&quot;ל עם מים ללא יונים. לאחסן במקרר ולעשות שבועי טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של 75% ACN ו -10% פתרון אמוניה מרוכזת (V / V) במים deionized ידי דילול 37.5 מ&quot;ל של ACN ו -5 מ&quot;ל של אמוניה מרוכזת (~ 25%) במים deionized. התאם את נפח סופי 50 מ&quot;ל עם מים ללא יונים. הפוך טרי מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר לפחות 2.5 מ&quot;ל של CSF אדם עבור כיילי, המתקבל דגימות שאריות-מזוהה דה מניתוח קליני שגרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CSF מלאכותי המכיל 150 מ&quot;מ Na, 3.0 מ&quot;מ K, 1.4 מ&quot;מ Ca, 0.8 מ&quot;מ Mg, 1.0 מ&quot;מ P, ו -155 מ&quot;מ Cl במים deionized ולהוסיף אלבומין בסרום שור לריכוז סופי של 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל. רק 1 המ&quot;ל נדרש לכל ניתוח, אבל להכין כמות גדולה, aliquot אותו, ולאחסן לשימוש עתידי. </li></ol> 2. הכנת כיילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.5 מ&quot;ל של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל 15 NAβ 1-42 פפטיד על ידי הוספת 40 μL של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל 15 NAβ 142 כדי 0.46 מ&quot;ל של 20 ACN% ו -4% אמוניה מרוכזת בתוך שפופרת 0.5 מ&quot;ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 מ&quot;ל של 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 פפטיד על ידי הוספת 50 μL של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל 15 NAβ 142 כדי 1.95 מ&quot;ל של ACN 20% ואמוניה מרוכזת 4% בצינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שישה פתרונות כיל (AF) על ידי ערבוב הכרכים של כל פתרון המצוין בטבלה 2. השתמש 0.5, 1.5, ו -2 צינורות מ&quot;ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כיילי הסופי (בשני עותקים) ב 0.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge ידי הוספת הפתרונות כיול המקביל ו CSF האדם לפי טבלה 3. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li></ol> 3. הכנת ההתקן הפנימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 מ&quot;ל של 0.8 מיקרוגרם / מ&quot;ל 13 CAβ 1-42 פפטיד על ידי הוספת 32 μL של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל 13 CAβ 142 כדי 1,968 מ&quot;ל של ACN 20% ו -4% אמוניה מרוכזת בתוך שפופרת 2-מ&quot;ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ&quot;ל של 16 ng / mL 13 CAβ 1-42 פפטיד על ידי הוספת 0.1 מ&quot;ל של 0.8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ל -4.9 מ&quot;ל של 20 ACN% ואמוניה מרוכזת 4% בתוך שפופרת 5 מ&quot;ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li></ol> 4. הכנת מדגם פקטור התגובה הערה: גורם התגובה (RF) נחישות מתבצעת על מנת לקבוע את הריכוז של פפטיד שכותרתו המשמש לכיול (15 NAβ 1-42). זה דורש ריכוז הפפטיד Aβ 1-42 יליד נקבע באמצעות ניתוח של חומצות אמיניות (AAA). לפיכך, היקף וריכוז aliquots פפטיד יליד Aβ 1-42צריך למלא את הדרישות של AAA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.5 מ&quot;ל של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל הילידים (ללא תווית) Aβ 1-42 על ידי הוספת 40 μL של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל יליד Aβ 1-42 כדי 0.46 מ&quot;ל של 20 ACN% ו -4% אמוניה מרוכזת בתוך שפופרת 0.5 מ&quot;ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת של 2 מ&quot;ל 40 ng / mL של יליד 15 NAβ 1-42 על ידי הוספת 20 μL של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל יליד Aβ 1-42 ו -20 μL של 4μg / מ&quot;ל 15 NAβ 1-42 1.96 מ&quot;ל של 20% ACN ו -4% מרוכזים אמוניה בצינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL של תמהיל 40 ng / mL 0.38 מ&quot;ל של CSF מלאכותי צינור 0.5 מ&quot;ל microcentrifuge. הכן כפילויות ומערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li></ol> לדוגמא כנה 5. הערה: להפשיר את דגימות כדי להימדד בטמפרטורת החדר על רולר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">להוסיף 0.18 מ&quot;ל של כל כיל, גורם תגובה, מדגם לא ידוע (כולל בקרת איכות [QC] דגימות, אם משתמשים בו) לחלבון מ&quot;ל 1 צלחת 96-עמוק היטב, על פי איור 1 (בהנחה צלחת מלאה משמש). הקפד להוסיף את הדגימות, או קרוב, חלק התחתון של הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL של תקן פנימי זה טוב (כלומר, כיילי, גורם בתגובה QCs, ואת נעלמים); חשוב לשחרר את הירידה בצד של באר קרובה לפני השטח של המדגם בלי לצלול קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2 מ&quot;ל של 5 M guanidine-hydrochloride היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת המדגם על שייקר microplate ומערבבים את הדגימות למשך 45 דקות ב -1,100 סל&quot;ד. התדירות האופטימלית עשויה להשתנות בהתאם מכשור. הגדר את תדירות אמפליטודה של המערבל כך הפתרונים מעורבבים היטב ושום טיפות של תקן פנימי או CSF נותרות צרופות בצד של הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2 מ&quot;ל של חומצה זרחתית 4%זה טוב. וורטקס לערבב בקצרה. </li></ol> 6. מיצוי שלב מוצק הערה: בכל כביסה, טעינה, וצעדים elution, להחיל את הוואקום הנמוך ביותר האפשרי לאחר הוספת הפתרון ובהדרגה להגדיל לפי הצורך כדי לטעון או elute הפתרון. השבת את הוואקום בין כל טעינת צעד elution. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מגש מאגר לפסולת תחת מצב מעורב, קטיון חליפין, 96-גם מיצוי שלב מוצק (SPE) צלחת בתא סעפת צלחת חילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנות את הסופג SPE על ידי הוספת 0.2 מ&quot;ל של מתנול היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הסופג על ידי הוספת 0.2 מ&quot;ל של חומצה זרחתית 4% זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל הדגימות (כ 0.62 מיליליטר בכל טוב) מהצלחת העמוקה היטב לצלחת SPE. השתמש פיפטה שמונה ערוצים בעת העברת הדגימות מהצלחת העמוקה היטב לצלחת SPE; זה לא חיוני כדי להעביר את הכרכים השלמים או שווים של כל הדגימות, מאז הדגימות מכילות כמתמחהאל תקן שיפצה עבור וריאציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הסופג לאחר הדגימות עברו על ידי הוספת 0.2 מיליליטר של חומצה זרחתית 4% זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ממס הכביסה eluted מן sorbent, להחליף את מגש המאגר עם צלחת אוסף או צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute המדגם מן sorbent ידי פעמיים הוספת 50 μL של 75% ACN / 10% אמוניה מרוכזת, ושים לב כי פתרון זה דורש ואקום נמוך מאוד לעבור דרך הסופג. זכור להשבית את החלל בין כל הוספה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: חותם את הצלחת אוסף או צינורות ולהקפיא אותם ב -80 ° C. הסר את החותם מצלחת האוסף או הצינורות לפני שתמשיך לשלב 6.8.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את eluates באמצעות צנטריפוגה ואקום (ללא הפעלת חום); זה יכול להימשך בין שנה עד מספר שעות, תלוי צנטריפוגות ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את המכל ולהקפיא אותם ב -80 ° C. </li></ol></li></ol> 7. נוזלי Chromatography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלב נייד A (ACN 5% ו -0.3% אמוניה מרוכזת מים ללא יונים [v / v]), B (4% מים ללא יונים ואמוניה מרוכזת ב -0.1% ACN [v / v]), וכן לשטוף מחט (50% ACN ו -4% מרוכזים אמוניה במים deionized [v / v]). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 500 מיליליטר של שלב נייד, להוסיף 25 מיליליטר של ACN ו -1.5 מיליליטר של אמוניה מרוכזת מים ללא יונים. התאם את נפח סופי 500 מ&quot;ל עם מים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 500 מיליליטר של B שלב הנייד, להוסיף 500 μL של אמוניה מרוכזת 25 מיליליטר של מים ללא יונים כדי ACN. התאם את נפח סופי 500 מ&quot;ל עם ACN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 250 מיליליטר של מחט לשטוף ידי הוספת 120 מיליליטר של ACN ו -10 מיליליטר של אמוניה מרוכזת מים ללא יונים. התאם את נפח סופי 250 מ&quot;ל עם מים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים א השלבים הנייד ובקבוקי B ו- מחט לשטוף הפתוח באמבט sonication במשך 20 דקות לפני חיבורו למערכת LC </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כל דגימה עם 25 μL של 20% ACN ו -4% Concentraפתרון אמוניה טד ומניחים אותם על שייקר במשך 20 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ולמקם אותם autosampler (לשמור ב -7 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 20 μL של המדגם על 1 x 250 מ&quot;מ 2-divinylbenzene קלקר טור מונוליטי (התהפכה פאזי) שמרו על 50 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שיפוע LC שניתן לראות בטבלה 4 עם קצב זרימה של 0.3 mL / min. להסיט את שני הראשונים וחמש הדקות האחרונות לבזבז (פוסט-טור) באמצעות שסתום הפניית להפחית את הזיהום של ספקטרומטר המסה. </li></ol></li></ol> 8. ניתוח ספקטרומטריה הערה: פרמטרים אלה שימשו ספקטרומטר מסה היברידית quadrupole-orbitrap מצויד מקור יינון electrospray aheated. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים עבור מקור יון לפי טבלה 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כווננו את המכשיר MS לבודד 4+ המדינות אחראי יליד Aβ 1-42 (1,129.48 ההמוניתכדי תשלום [m / z] יחס), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 מ &#39;/ z), ו -13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) ב מסת Analyzer quadrupole עם רוחב הבידוד של 2.5 מ&#39; / z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבר פפטידים המבודד בתא ההתנגשות עם אנרגית התנגשות מנורמלת (NCE) של 17.0. זה אולי צריך להיות מכוון עבור כל מכשיר, אפילו מאותו הסוג (ובמיוחד אם להשתמש בסוגים אחרים של מכשירים, כגון quadrupole משולשת MS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הספקטרום שהבר עם רזולוציה של 17.500, עם מטרת שליטה אוטומטית של 2 x 10 5 אישומים זמן הזרקת מקסימלית של 250 מילישניות. </li></ol> 9. עיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הסכום של יוני המוצר (עם סובלנות המונית של יחידות מסת מילי ± 250 [MMU]) בלוח 6 לחשב אזורי chromatographic עבור כל הפפטיד. ראוי לציין, כי סוגים ומספרי יון מוצגים רק עבור Aβ הילידים <sub&gt; 1-42 יוני מוצר, שכן הם זהים עבור שני 15 NAβ 1-42 ו -13 CAβ 1-42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את גורם התגובה הממוצע של דגימות גורם שני תגובה על ידי חלוקת השטח מתחת לעקומה (שיא chromatographic) של 15 NAβ 1-42 עם השטח מתחת לעקומה של Aβ 1-42 ילידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז של 15 NAβ 1-42 המשמש כיול ידי הכפלתו עם הגורם בתגובה מחושב בשלב 9.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות עקומת כיול על ידי התוויית יחסי שטח של 15 NAβ 1-42 ל -13 CAβ 1-42 משני סטים של כיילי נגד ריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את המדרון ליירט של עקומת הכיול באמצעות רגרסיה ליניארית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את יחס שטח של המקומיים Aβ 1-42 התקן פנימי (13 CAβ 1-42) עבור האו&quot;םדגימות ידועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיץ הריכוז של דגימות ידועות מעקום הכיול באמצעות המדרון ליירט שהושג בשלב 9.5. </li></ol>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20107219">Alzheimer's disease.</a> N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+neuropathology+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease.</a> Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).</li>
<li>Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16876668">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).</li>
<li>Dubois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+research+diagnostic+criteria+for+Alzheimer%27s+disease%3A+the+IWG-2+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria.</a> Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).</li>
<li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li>
<li>Buchhave, P., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22213792">Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia.</a> Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).</li>
<li>Olsson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+and+blood+biomarkers+for+the+diagnosis+of+Alzheimer%27s+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).</li>
<li>Bjerke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+influencing+amyloid+Beta+concentration+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2010).</li>
<li>Dumurgier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intersite+variability+of+CSF+Alzheimer%27s+disease+biomarkers+in+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting.</a> Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF+biomarker+variability+in+the+Alzheimer%27s+Association+quality+control+program%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program.</a> Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).</li>
<li>Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23519967">Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers.</a> Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).</li>
<li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedures+for+Alzheimer%27s+disease+cerebrospinal+fluid+biomarkers%3A+definitions+and+approaches+with+focus+on+amyloid+beta42%5BTitle%5D)+AND+%22Biomark+Med%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42.</a> Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).</li>
<li>Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+endogenous+androgenic+steroids+in+cattle%27s+meat+by+gas+chromatography+mass+spectrometry+using+a+surrogate+analyte+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach.</a> Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).</li>
<li>Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry+methods+for+quantitation+of+mevalonic+acid+in+human+plasma+and+urine%3A+method+validation%2C+demonstration+of+using+a+surrogate+analyte%2C+and+demonstration+of+unacceptable+matrix+effect+in+spite+of+use+of+a+stable+isotope+analog+internal+standard%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).</li>
<li>Leinenbach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+candidate+reference+measurement+procedure+for+quantification+of+amyloid-beta+in+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid.</a> Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).</li>
<li>Li, W., Cohen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+endogenous+analytes+in+biofluid+without+a+true+blank+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix.</a> Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).</li>
<li>Perret-Liaudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+collection+tubes%3A+a+critical+issue+for+Alzheimer+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis.</a> Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).</li>
<li>Lewczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).</li>
<li>Pannee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+measurement+procedure+for+CSF+amyloid+beta+%28A%CE%B2%291-42+and+the+CSF+A%CE%B21-42+%2FA%CE%B21-40+ratio+-+a+cross-validation+study+against+amyloid+PET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (Aβ)1-42 and the CSF Aβ1-42 /Aβ1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET.</a> J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).</li>
<li>Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+to+a+common+standard+for+protein+measurements+by+immunoassay+for+in-vitro+diagnostic+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes.</a> Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).</li>
<li>Vesper, H. W., Thienpont, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traceability+in+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Traceability in laboratory medicine.</a> Clin Chem. 55 (6), 1067-1075 (2009).</li>
</ol>

JP ו-EP לא מדווחים על גילויים. HZ כיהנה במועצות המייעצות של Roche Diagnostics, Eli Lilly ו-Pharmasum Therapeutics. KB שימש כיועץ או במועצות המייעצות של Fujirebio Europe, IBL International ו-Roche Diagnostics. HZ ו-KB הם מייסדים שותפים של Brain Biomarker Solutions בגטבורג AB, חברת פלטפורמה מבוססת GU Venture באוניברסיטת גטבורג.

לקבלת השיטה המתוארת, במקום להשתמש מטריצה פונדקאית, השתמשנו בגישה אנליטי הפונדקאית 13, 14, 15, 16, אשר מאפשרת כיול CSF אדם. הגישה אנליטי הפונדקאית כרוכה שני סטנדרטים שונים isotopically שכותרתו. אחת (15 NAβ 142) משמש כדי ליצור את עקומת הכיול ב CSF אדם, ואילו אחר (13 CAβ 142) משמש כסטנדרט הפנימי. ריכוזי אנדוגני Aβ...

מחלת אלצהיימר (AD) היא הצורה הנפוצה ביותר של דמנציה משפיעה על 35 מיליון בני אדם ברחבי העולם 1. סימני ההיכר נוירו של מחל אמין נרחב לשקר בליבה של בפתוגנזה לספירה הם סבכי neurofibrillary תאיים של טאו hyperphosphorylated חלבון 2 ושלטי תאיים מורכבים בטא עמילואיד מצטבר (Aβ) פפטידים 3. בקנה אחד עם זה, ההערכה של פתולוגיה פלאק in vivo על ידי סמנים ביולוגיים נכללה לאחרונה הקריטריונים לאבחון מחקר למחלת אלצהיימר 4. עבור מדידות CSF של Aβ 1-42, כמה immunoassays זמין ומשמשים במעבדות קליניות רבות 5. ריכוז Aβ 1-42 ב CSF הוא כ 50% נמוך יותר בחולי אלצהיימר מאשר אצל הקשישים קוגניטיבית נורמלים, המשקף את בתצהיר של פפטיד הפלאק br6 עין, 7. סמנים אלה מנותחים בעיקר באמצעות immunoassays (כלומר, טכניקות מבוססות נוגדנים), אבל אלה מבחנים עשויים להיות מושפעים השפעות מטריקס 8. שימוש immunoassays על פלטפורמות טכנולוגיות שונות ואת חוסר סטנדרטיזציה assay 9, 10 הופך את כניסתה של ריכוזי העולמי חתוך 11 קשה, 12. RMP תוקפת אנליטית תתיר הכיול האחיד של פלטפורמות assay שונות, באופן אידיאלי וכתוצאה מכך השוואתית טובים יותר על פני פלטפורמות אנליטיים שליטה טובה יותר של הגורמים תורמי השתנות המדידה הכוללת. כימות המוחלטת של Aβ 1-42 באמצעות השיטה שפותחה LC-MS / MS מתגברת רבה של בעיות הקשורות techn נוגדן מבוססiques. השיטה, מופיעה בתור RMP ע&quot;י הוועדה המשותפת עבור עקיבות ברפואת מעבדה (C11RMP9 מספר זיהוי מסד JCTLM), תשמש כדי לקבוע את הריכוז המוחלט של Aβ 1-42 ב בחומרי ייחוס (CRM) ליצור הרמונית CSF Aβ 1 מדידות -42 פני טכניקות ופלטפורמות אנליטי. זרימת העבודה המתוארת צריכה להיות רלוונטית לפיתוח שיטות התייחסות מועמד פפטידים וחלבונים בתוך האזורים השונים של רפואה.

<table><tbody><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה חלבון Eppendorf LoBind, צינורות מיקרוצנטריפוגה</td> חלבון <td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind, צינורות מיקרוצנטריפוגה של חלבון</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind, 2 מ"ל</td><td></td> צינורות מיקרוצנטריפוגה של חלבון <td>Eppendorf</td> 022431102 <td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind, 5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>חלבון אפנדורף LoBind Deepwell Plates 96</td><td></td> צינורות פוליפרופילן <td>Eppendorf</td> 951032905 <td></td></tr><tr><td>Micronic 0.75 מ"ל,</td> צינורות <td>MPW32071BC3 מיקרוניים</td><td></td> V-bottom <td>המשמשים לאיסוף SPE משפרים, אך ניתן להשתמש במכשירי איסוף אחרים כגון צלחות 96 בארות.</td></tr><tr><td>Micronic Split TPE Capcluster עבור 96 ind. צינורות</td><td>מיקרוניים</td><td>MP53026</td><td>כובעים לצינורות מיקרוניים.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96 לבן עם כיסוי גבוה מקודד</td><td>מחזיק MPW51015BC3 מיקרוני</td><td></td><td>לצינורות מיקרוניים.</td></tr><tr><td>טיפים של Biohit Optifit 1.2 מ"ל</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>משמש כדי להגיע עד לתחתית לוחות הבאר העמוקים של LoBind (96 בארות). טיפים צרים אחרים עשויים לעבוד גם כן.</td></tr><tr><td>ווטרס אואזיס MCX 96-באר ומיקרו; מי צלחת אלוטיון</td><td></td><td>186001830BA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מגש מאגר סעפת צלחת מים</td><td></td> מים <td>WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>סעפת צלחת מיצוי מים לנווה מדבר 96 בארות צלחות</td><td>מים</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אמוניום הידרוקסיד, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~ 25% בסיס NH3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל, דרגת שיפוע UV HPLC רחוקה, 2.5 ליטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אורתו-זרחתית 85%, ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td><td>Merck Millipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>גואנידין הידרוכלוריד, 500 גרם</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap ספקטרומטר מסה</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>עם Dionex Ultimate 3000 LC ודגימה אוטומטית.</td></tr><tr><td>Dionex ProSwift RP-4H עמודת מונוליט (1.0 x 250 מ"מ)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר, אבקה ליופילית, מתאימה (לביולוגיה מולקולרית),</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B6917</td><td></td>בטא-עמילואיד ללא אצטילציה</tr><tr><td>(1-42), טהור במיוחד, TFA</td><td>rPeptide</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N בטא-עמילואיד (1-42), תווית אחידה</td><td>rPeptide</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr><tr><td>13C בטא-עמילואיד (1-42),</td> שייקרים <td>rPeptide</td><td>A-1106-2</td><td></td>Microplate עם תווית אחידה</tr><tr><td>, TiMix 2</td><td>Edmund B&uuml; HLER</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות מוחלט של aβ<sub&gt; 1-42</sub&gt; ב csf באמצעות הליך מדידת הפניה ההמוני spectrometric

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

מחלת אלצהיימר (AD) היא המחלה הנוירודגנרטיבית השכיחה ביותר בקרב קשישים ומהווה 60-80% מכלל מקרי הדמנציה. נכון לעכשיו, האבחנה של אלצהיימר מבוססת על מבחנים קוגניטיביים ובדיקות מצב נפשי, אך הפפטיד עמילואיד-בטא (Aβ) בנוזל המוח השדרתי (CSF) נמצא בשימוש יותר ויותר בניסויים קליניים ובמסגרות. באשר לרוב הסמנים הביולוגיים של חלבונים ופפטידים, הכימות מתבצע באמצעות טכניקות מבוססות נוגדנים, כגון בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA). עם זאת, שונות תוך-מעבדתית ובין-מעבדתית במבחנים אלה פוגעת בשימוש בו כסמן אבחנתי בשגרה הקלינית.
נוהל מדידת ייחוס בלתי תלוי בנוגדנים (RMP) פותח על בסיס מיצוי פאזה מוצקה (SPE) וכרומטוגרפיה נוזלית (LC)-ספקטרומטריית מסה טנדם (MS/MS), כאשר פפטידי Aβ יציבים ומסומנים באיזוטופים שימשו כתקנים פנימיים, המאפשרים כימות מוחלט. מכשיר היברידי מרובע ברזולוציה גבוהה שימש למדידות. השיטה מאפשרת כימות של CSF Aβ1-42 בין 150-4,000 pg/mL.

<html> התקנת הצלחת באיור 1 משמשת צלחת מלאה של דגימות. אם דגימות ידועות פחות הם להיות מנותחים, את כיל השני, RF, ו- QC סטים צריכים להיות ממוקם שרק שופט לסיום המחצית הראשונה של הדגימות הידועות. כפי שניתן לראות באיור 2, כייל קרובים הקו הרגרסיה, עם סטיות תקן נמוכות. שיטה זו יש רמה נמוכה יותר של כימות של 150 pg / mL ו ברמ...

מתואר הליך מדידת ייחוס לכימות מוחלט של Aβ1-42 ב-CSF אנושי המבוסס על מיצוי פאזה מוצקה וספקטרומטריית מסה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית.

כימות מוחלט של Aβ<sub&gt; 1-42</sub&gt; ב CSF באמצעות הליך מדידת הפניה ההמוני spectrometric

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

המטרה הכוללת של הליך מדידה ייחוס זה היא להביא להרמוניזציה של מדידות של beta-amyloid בנוזל חוט השדרה (CSF) אנושי. שיטה זו יכולה לסייע בתיקנון של בדיקות למדידת CSF Aβ42, המהווה סמן ביולוגי לפתולוגיה עמילואידית מרכזית וסימן নিউרופתולוגי של מחלת האלצהיימר. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא עברה תיקוף יסודי ואינה משתמשת בנוגדנים לצורך כימות של Aβ42.להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על הטיפול במחלת האלצהיימר, שכן היא תשמש להרמוניזציה של בדיקות ותסייע בהחדרה של רמות סף כלליות בניסויים קליניים. בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי פתולוגיה של עמילואיד בבני אדם, ניתן ליישמה גם על אורגניזמים אחרים, כגון עכברים טרנסגניים ופרימטים שאינם בני אדם, לצורך פיתוח תרופות חדשות. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להיתקל בקשיים, מכיוון ש-AVR 142 הוא הידרופובי מאוד ויכול להיצמד בקלות למשטחים כגון טיפים של פיפטות ומבחנות.ראשית, הוסף 40 µL של N15 a beta peptide ל-0.46 mL של 20% acetonitrile ו-4% concentrated ammonia בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 0.5 mL. ערבב את תמיסת הפפטיד באמצעות מערבל וורטקס למשך דקה אחת. הוסף 50 µL מתמיסת הפפטיד ל-1.95 mL של 20% acetonitrile ו-4% concentrated ammonia במבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח 2 mL.ערבבו את תמיסת הפפטיד באמצעות מערבל וורטקס למשך דקה אחת. לאחר מכן, הכינו שש תמיסות כיול על ידי ערבוב הנפחים המתאימים מכל תמיסה במבחנות מיקרוצנטריפוגה. לאחר ערבוב תמיסות הכיול, הכינו את כילויי הסוף בשכפולים על ידי ערבוב הנפחים המתאימים של תמיסות הכיול התואמות ושל CSF אנושי במבחנות מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מיליליטר.ערבבו כל תמיסה במיקסר וורטקס למשך דקה אחת. להכנת התקן הפנימי, הוסיפו תחילה 32 µL של 13C a beta peptide ל-1.968 mL של 20% acetonitrile ו-4% concentrated ammonia בתוך מבחנת מיקרוצנטריפוגה בנפח של שני מיליליטר.בשלב הבא, הוסף 0.1 milliliters של תמיסת הפפטיד ל-4.9 milliliters של 20%acetonitrile ו-4%concentrated ammonia בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח של חמישה מיליליטר. ערבב את תמיסת הפפטיד במיקסר vortex למשך דקה אחת. להכנת דגימת מקדם התגובה, הוסף 40 microliters של a beta peptide טבעי ל-0.46 milliliters של 20%acetonitrile ו-4%concentrated ammonia במבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח של 0.5 milliliter.לאחר הערבוב, הוסף 20 µL של תמיסת הפפטיד ו-20 µL של 15N a beta peptide בריכוז של 4 µg/mL ל-1.96 mL של 20% acetonitrile ו-4% ammonia מרוכז בתוך מבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח של 2 mL. ערבב את תמיסת הפפטיד בוורטקס למשך דקה אחת. לאחר מכן, הוסף 20 µL מתמיסת הפפטיד ל-0.38 mL של CSF מלאכותי במבחנה למיקרוצנטריפוגה בנפח של 0.5 mL.לאחר הכנת כפילויות, ערבבו כל תמיסה באמצעות מערבל וורטקס למשך דקה אחת. לאחר הפשרת הדגימות על גבי רולר, הוסיפו 0.18 milliliters מכל כיול, פקטור תגובה ודגימה לא ידועה לפלטת 96 בארות עמוקות עבור חלבון בנפח של one milliliter, תוך הקפדה להוסיף את הדגימות לתחתית הבארות או קרוב אליהן. כעת, הוסיפו 20 microliters של סטנדרט פנימי לכל באר על ידי שחרור טיפה מהסטנדרט לדופן הבאר קרוב לפני השטח של הדגימה, ללא טבילת קצה הפ pipette.לאחר מכן, הוסף 0.2 milliliters של guanadine hydrochloride בריכוז five molar לכל באער. הנח את פלטת הדגימות על מנער מיקרו-פלטות (microplate shaker) וערבב את הדגימות למשך 45 דקות במהירות של 1100 rpm. לאחר הערבוב, הוסף 0.2 milliliters של 4% phosphoric acid לכל באער.לאחר מכן, הנח את פלטת הדגימות על מנער מיקרו-פלטות (microplate shaker) וערבב קצרות במהירות של 1000 rpm. הנח תבנית איסוף פסולת תחת פלטת מיצוי פאזה מוצקה (SPE), מסוג mixed mode cation exchange בעלת 96 בארות, בתוך תא המניפולד של פלטות המיצוי. לאחר מכן, בצע התניה (conditioning) לסורבנט של ה-SPE על ידי הוספת 0.2 milliliters של מתנול לכל בארה.לאחר מכן, יש להביא את הסורבנט לשיווי משקל על ידי הוספת 0.2 milliliters של 4%phosphoric acid לכל באער. באמצעות פיפט שמונה-ערוצי, העבירו את כל הדגימות מלוח הבאערים העמוקים (deep well plate) ללוח ה-SPE. לאחר מכן, שטפו את הסורבנט פעמיים לאחר מעבר הדגימות על ידי הוספת 0.2 milliliters של 4%phosphoric acid לכל באער.לאחר שמסממנה של השטיפה נשטפה מהסורבנט, החליפו את מגש המאגר במבחנות. כעת, אלואו את הדגימה מהסורבנט על ידי הוספת שתי מנות של 50 µL של 75% acetonitrile ו-10% concentrated ammonia, תוך שימת לב כי תמיסה זו דורשת ואקום נמוך מאוד כדי לעבור דרך הסורבנט. ייבשו את האלואטים באמצעות סנטריפוגת ואקום ללא הפעלת חום.לבסוף, אטמו את המבחנות והקפיאו אותן בטמפרטורה של 80 °C עד לביצוע האנליזה. כילי הכיול קרובים לקו הרגרסיה עם סטיות תקן נמוכות. אם הכיול אינו ליניארי, יש להשליך את תוצאות הריצה; סטיות אלו נובעות ככל הנראה מטכניקות פיפטינג שגויות ו/או משגיאות בדילול כילי הכיול.מקדם השונות של החזרות צריך להיות רצוי נמוך מ-10%. ה-15N וה-13C טבעיים של beta בולטים מעמודת ה-LC בו-זמנית עם שיאים סימטריים בקירוב וללא זנב משמעותי. יש לבצע לפחות 10 מדידות עבור כל שיא, וניתן להתאימן באמצעות זמן הזרקה מקסימלי בשיטה. ניתן למדוד את הפפטידים בו-זמנית במהלך אנליזת ה-MS, אלא אם רגישות השיטה אינה אופטימלית, ובמקרה זה יש למדוד רק את הפפטידים הרלוונטיים עבור כל הזרקה.ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצע אותה בתוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להרוות תמיד את קצות הפפיט לפני העברת תמיסת הפפטיד. כמו כן, חשוב להשתמש במבחנות עם נפח מת מנימלי ככל האפשר.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מחלת האלצהיימר לבחון התאמה עם שיטות אחרות, כגון הדמיית amyloid PET. היא שימשה גם לקביעת ריכוזי beta 142 בחומרי ייחוס מבוססי CSF. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנת כילי כיול ב-CSF אנושי ושימוש במיצוי פאזה מוצקה לפני ניתוח LCMS למדידת הריכוז המוחלט של beta 142 בדגימות.יש לזכור כי עבודה עם CSF אנושי עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון שימוש בכפפות, במשקפי מגן ובשאר אמצעי הבטיחות בעת ביצוע פרוצדורה זו.

absolute-quantification-a1-42-csf-using-mass-spectrometric-reference

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מקור: סמואלס, ד. ג'יי. ואחרים. גישה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית טנדם–ספקטרומטריית מסה לניתוח מטבוליטים של סטפילוקוקוס אוראוס. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את השימוש בכרומטוגרפיה נוזלית–ספקטרומטריית מסה לזיהוי וכמת מטבוליטים תוך-תאיים מ-S. aureus. הוא מפרט את השלבים המעורבים בהפקת מטבוליטים, נרמול פפטידים, כרומטוגרפיה נוזלית וניתוח ספקטרומטרי מסה.

גישה מבוססת כרומטוגרפיה נוזלית–ספקטרומטריית מסה לניתוח מטבוליטים מ-S. aureus

מאמר זה מתאר את היישום של מיקרוסקופיה האלקטרונית cryoanalytical למדידת כמותית של תוכן הכולל סידן והפצה ברזולוציה subcellular בדגימות ביולוגיות מוגדרות מבחינה פיזיולוגית.

מדידה של סידן סה&quot;כ בנוירונים על ידי אלקטרונים רנטגן Microanalysis Probe

פרופיל המטבוליט היה נכס יקר בחקר חילוף חומרים בבריאות ובחוליים. ניצול כרומטוגרפיה נוזלית בהדרגה נורמלית מצמידים ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה עם מיתוג קוטביות ומחזור עבודה מהיר, אנו מתארים פרוטוקול לנתח את הרכב חילוף חומרים הקוטבי של חומר ביולוגי עם רגישות גבוהה, דיוק, ורזולוציה.

אסטרטגיה בקנה מידה גדולה Metabolomics רגיש, כמותי

שילוב של גידול מיקרו-אצות עם גז פליטה תעשייתי יכניס בסופו של דבר מתכות כבדות ותרכובות אנאורגניות אחרות למצע הגידול. מחקר זה מציג הליך המשמש לקביעת גורלן הסופי וההשפעה של מתכות כבדות ומזהמים אנאורגניים על צמיחת Nannochloropsis salina הגדל בפוטו-ביו-ריאקטורים.

כימות של מתכות כבדות ומזהמים אורגניים אחרים בפרודוקטיביות של מייקרו

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע בדיקות כימות מוחלטות של חלבוני מטרה בתוך דגימות ביולוגיות מורכבות באמצעות ניטור תגובה נבחר. הוא שימש לכימות מדויק של חלבונים של מסלול האיתות הכימוטקסיס של מקרופאגים בעכבר. בחירת פפטיד יעד, פיתוח בדיקה ובדיקות איכותיות וכמותיות מתוארים בפירוט.

תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט

Size exclusion chromatography עם פלזמה מצומדת אינדוקטיבית - ספקטרומטריית מסה (ICP-MS) היא כלי רב עוצמה למדידת שינויים בשפע של מטאלופרוטאינים ישירות מדגימות ביולוגיות. כאן אנו מתארים קבוצה של תקני מטאלופרוטאין המשמשים להערכת המסה המולקולרית וכמות המתכת הקשורה לחלבונים לא ידועים.

התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS

אנו מתארים תפוקה גבוהה, רב מפלסים, ואת הנוזל השדרתי proteomic ממוקד (CSF) assay שפותחה עם פוטנציאל תרגום קליני. הבדיקה יכולה לכמת סמנים פוטנציאל וגורמי סיכון עבור ניווניות של מערכת העצבים, כגון גרסאות E אפוליפופרוטאין (E2, E3 ו E4), ולמדוד ביטוי אללים שלהם.

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

כאן, אנו מציגים כימות לא משוחדת של חלבון ספציפי לאתר acetylation ו/או succinylation תפוסה (סטויכיומטריה) של פרוטאום כולו באמצעות ניתוח רציומטרי של שינויים אנדוגני שינויים שהוכנסו לאחר כמותיים acylation כימי באמצעות anhydrides התווית על-ידי איזוטופ יציב. בשילוב עם ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים רגישים, מתקבלים באתר מדויק תפוסת מדידות.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

סינתזה חלבונים היא תהליך ביולוגי קריטי עבור תאים. במוח, זה נדרש עבור שינויים גמישים. מדידת שיעורי סינתזה של חלבון במוח שלמה מחייבת שיקולים מתודולוגיים זהירים. כאן אנו מציגים את L-[1-14ג]-השיטה האוטומטית לאוצין כמותי לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בvivo.

השיטה הכמותית האוטומטית לקביעת שיעורי הסינתזה של חלבון מוחי בVivo

רמת החלבון של נוזל השדרה הגבוה יכול להיות תוצאה של דיפוזיה של חלבון פלזמה על פני מחסום דם-מוח שונה או סינתזה התוך. פרוטוקול בדיקה מיטבי מוצג במאמר זה, המסייע להפלות את שני המקרים ומספק מדידות כמותית של חלבונים מסונתז באופן פנימי.

מדידה כמותית של מתוך מסונתז חלבונים בעכברים

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

למד כימות מוחלט של Aβ1-42 בנוזל מוח שדרתי אנושי באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מס תאומה. שיטה זו תקנית ללא שימוש בנוגדנים ומיועדת למחקר מחלת אלצהיימר ופיתוח תרופות.

כימות מוחלט של Aβ

גלה סרטונים נוספים