כימות מוחלט של Aβ _1-42 ב CSF באמצעות הליך מדידת הפניה ההמוני spectrometric

המטרה הכוללת של הליך מדידת ייחוס זה היא ליצור הרמוניה בין מדידות של בטא ב-CSF אנושי. שיטה זו יכולה לסייע בסטנדרטיזציה של מבחנים למדידת CSF, בטא 42, המהווה סמן ביולוגי לפתולוגיה מרכזית של עמילואיד וסימן היכר נוירופתולוגי של מחלת אלצהיימר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאומתת ביסודיות ואינה משתמשת בנוגדנים לכימות AVR 142.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול במחלת אלצהיימר מכיוון שהיא תשמש להרמוניה של מבחנים ולהקל על הכנסת רמות ניתוק כלליות בניסויים קליניים. בעוד ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי פתולוגיה של עמילואיד בבני אדם, ניתן ליישם אותה גם על אורגניזמים בני תמותה אחרים כגון עכברים טרנסגניים ופרימטים לא אנושיים כדי לפתח תרופות חדשות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון ש-AVR 142 הוא הידרופובי מאוד ויכול להיצמד בקלות למשטחים כגון קצות פיפט וצינורות.

ראשית, הוסף 40 מיקרוליטר של N15 פפטיד בטא ל-0.46 מיליליטר של 20% אצטוניטריל ו-4% אמוניה מרוכזת בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר. מערבבים את תמיסת הפפטיד על מערבל מערבולת למשך דקה. הוסף 50 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד ל -1.95 מיליליטר של 20% אצטונטריל ו-4% אמוניה מרוכזת בצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר.

מערבבים את תמיסת הפפטיד על מערבל מערבולת למשך דקה. לאחר מכן, הכינו שש תמיסות כיול על ידי ערבוב הנפחים המתאימים של כל תמיסה בצינורות מיקרוצנטריפוגה. לאחר ערבוב תמיסות הכיול, הכינו את הכיולים הסופיים בשכפול על ידי ערבוב הנפחים המתאימים של תמיסות הכיול המתאימות ו-CSF אנושי בצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר.

מערבבים כל תמיסה על מערבל מערבולת למשך דקה. כדי להכין את התקן הפנימי, הוסף תחילה 32 מיקרוליטר של 13C פפטיד בטא ל-1.968 מיליליטר של 20% אצטוניטריל ו-4% אמוניה מרוכזת בצינור מיקרו-צנטריפוגה של שני מיליליטר. מערבבים את תמיסת הפפטיד על מערבל מערבולת למשך דקה.

לאחר מכן, הוסף 0.1 מיליליטר מתמיסת הפפטיד ל -4.9 מיליליטר של 20% אצטוניטריל ו -4% אמוניה מרוכזת בצינור מיקרוצנטריפוגה של חמישה מיליליטר. מערבבים את תמיסת הפפטיד על מערבל מערבולת למשך דקה. כדי להכין את דגימת גורם התגובה, הוסף 40 מיקרוליטר של פפטיד בטא מקומי ל-0.46 מיליליטר של 20% אצטוניטריל ו-4% אמוניה מרוכזת בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר.

לאחר הערבוב מוסיפים 20 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד ו -20 מיקרוליטר של ארבעה מיקרוגרם למיליליטר, 15N פפטיד בטא ל -1.96 מיליליטר של 20% אצטונטריל ו -4% אמוניה מרוכזת בצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר. מערבבים את תמיסת הפפטיד על מערבל מערבולת למשך דקה. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר מתמיסת הפפטיד ל-0.38 מיליליטר של CSF מלאכותי בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.5 מיליליטר.

לאחר הכנת כפילויות, מערבבים כל תמיסה על מערבל מערבולת למשך דקה. לאחר הפשרת הדגימות על רולר, הוסף 0.18 מיליליטר מכל כיול, גורם תגובה ודגימה לא ידועה לצלחת באר עמוקה של מיליליטר 96, והקפד להוסיף את הדגימות בתחתית הבארות או קרוב אליהן. כעת, הוסף 20 מיקרוליטר של תקן פנימי לכל באר על ידי שחרור טיפה של התקן בצד הבאר קרוב לפני השטח של הדגימה מבלי להטביע את קצה הפיפט.

לאחר מכן, הוסף 0.2 מיליליטר של חמישה גונאדין הידרוכלוריד טוחנת לכל באר. הניחו את צלחת הדגימה על שייקר מיקרופלייט וערבבו את הדגימות במשך 45 דקות ב-1100 סל"ד. לאחר הערבוב מוסיפים 0.2 מיליליטר חומצה זרחתית 4% לכל באר.

לאחר מכן, הניחו את לוחית הדגימה על שייקר המיקרופלייט וערבבו קצרות ב-1000 סל"ד. הנח מגש מאגר לפסולת תחת חילופי קטיון במצב מעורב 96 באר חילוץ פאזה מוצקה, או צלחת SPE בתא סעפת צלחת החילוץ. לאחר מכן, מרכך את סופג ה- SPE על ידי הוספת 0.2 מיליליטר מתנול לכל באר.

לאחר מכן, יש לאזן את הספיגה על ידי הוספת 0.2 מיליליטר של 4% חומצה זרחתית לכל באר. בעזרת פיפט שמונה ערוצים, העבירו את כל הדגימות מלוח הבאר העמוק לצלחת SPE. לאחר מכן, יש לשטוף את הספיגה פעמיים לאחר מעבר הדגימות על ידי הוספת 0.2 מיליליטר של 4% חומצה זרחתית לכל באר.

לאחר שממס הכביסה נפלט מהסופג, החלף את מגש המאגר בצינורות. כעת, הסר את הדגימה מהסופג על ידי הוספת שני אלוקאט של 50 מיקרוליטר של 75% אצטוניטריל ו-10% אמוניה מרוכזת, ושים לב שתמיסה זו דורשת ואקום נמוך מאוד כדי לעבור דרך הסופג. יבש את הפליטים באמצעות צנטריפוגה ואקום מבלי להפעיל חום.

לבסוף, אטמו את הצינורות והקפיאו אותם בחום של 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. הכיולים קרובים לקו הרגרסיה עם סטיות תקן נמוכות. אם הכיול אינו ליניארי, יש להשליך את הריצה והסטייה נובעת ככל הנראה מטכניקות פיפטינג שגויות ו/או שגיאות בדילול הכיול.

מקדם השונות של שכפולים צריך להיות רצוי מתחת ל-10%15N ו-13C מקוריים של בטא נפלטים מעמודת ה-LC בו זמנית עם פסגות קרובות לסימטריות וללא זנב משמעותי. יש לבצע לפחות 10 מדידות לכל שיא וניתן לכוונן אותן עם זמן הזרקה מקסימלי בשיטה. ניתן למדוד את הפפטידים בו זמנית במהלך ניתוח הטרשת הנפוצה, אלא אם כן רגישות השיטה היא תת-אופטימלית, שבה יש למדוד רק פפטידים מעניינים עבור כל זריקה.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבע שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור תמיד להרוות את קצות הפיפט לפני העברת תמיסת הפפטיד. חשוב גם להשתמש בצינורות עם כמה שפחות נפח ריק.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחלת האלצהיימר לחקור התאמה עם שיטות אחרות, כגון הדמיית PET עמילואיד. הוא שימש גם להקצאת ריכוזי בטא 142 לחומרי ייחוס מבוססי CSF. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד להכין כיולים ב-CSF אנושי ולהשתמש במיצוי פאזה מוצקה לפני ניתוח LCMS כדי למדוד את הריכוז המוחלט של בטא 142 בדגימות.

אל תשכח שעבודה עם CSF אנושי עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון כפפות, משקפי מגן ואמצעי בטיחות אחרים בעת ביצוע הליך זה.