שני אלגוריתמים עבור תפוקה גבוהה וכימות Multi-פרמטרית של דרוזופילה מורפולוגיה צומת Neuromuscular

המטרה הכוללת של הליך זה היא לכמת אוטומטית את התכונות המורפולוגיות של הצומת העצבי-שרירי של דרוזופילה באמצעות פקודות מאקרו של תוכנה מורפומטרית. שיטה זו יכולה לסייע בזיהוי מווסתים של התפתחות סינפסות, שאלת מפתח בנוירוביולוגיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הכימות האוטומטי של תכונות NMJ מרובות.

זה מאפשר ניתוח אובייקטיבי של מורפולוגיה של NMJ בפוט גבוה. החלטנו לפתח מתודולוגיה זו כדי להיות מסוגלים לחקור מורפולוגיה של NMJ בכמות גדולה של מודלים של מחלות. חשבנו על דרכים כיצד למנוע את ההבדלים האישיים ביניהם וכיצד להאיץ משמעותית את תהליך הכימות.

הדגמה חזותית של שיטה זו מועילה מאוד. הגדרות מאקרו מתאימות הן חיוניות ושלבים מסוימים עשויים להיות קשים למשתמשים חדשים, במיוחד כאשר אינם מכירים תוכנת VT. עבור פרוטוקול זה, צור ערימות תמונות של NMJs ושמור אותן כקבצי TIFF בודדים, כאשר ערוץ ראשון מציג צביעת DLG1, או סמן דומה, וערוץ שני מציג צביעת BRP.

כדי להתחיל, צור הקרנות C וערימות היפר של קבצי התמונה של NMJ. פתח את אפשרויות התוסף ובחר Drosophila NMJ Morphometrics. כעת, זהה את מחרוזת הקבצים הייחודית שהמיקרוסקופ הקצה לסדרת התמונות בעת אחסונם כ-TIFF.

זה יופיע בסוף שם התמונה. העתק והדבק את המחרוזת שניתנה למישור ולמספר הערוץ הנמוכים ביותר בחלון הגדרת מחרוזת הקובץ הייחודית. לאחר מכן, בחר את המרת המאקרו המשני לערימה ובחר את הספרייה או התיקיה שבה ממוקמות התמונות.

לכל קובץ תמונה נוצרים שני קבצים חדשים עם אוסף השמות של ברירת המחדל ואוסף שטוח, ואחריהם שם התמונה המקורי. לאחר מכן ניתן למחוק את הקבצים המקוריים כדי לחסוך מקום אחסון. לאחר מכן, מממשק Drosophila NMJ Morphometrics בחר את הגדרת תת המאקרו ROI ובחר את ספריית קבצי התמונה.

עם פתיחת ההקרנה הראשונה, בחר בכלי הבחירה ביד חופשית. לאחר מכן השתמש בעכבר כדי להגדיר אזור המכיל מסוף NMJ שלם מעניין. לאחר הבחירה, לחץ על אישור בחלון הגדרת המסוף.

המשך לעשות זאת עד שמסופי NMJ יוגדרו בכל התחזיות. המאקרו מקדם את התהליך באופן אוטומטי. עבור כל קובץ תמונה נוצר קובץ חדש אחד עם שמות ברירת המחדל ROI ואחריו שם התמונה המקורי.

כדי לכמת את תכונות NMJ, ראשית עבור לממשק Drosophila NMJ Morphometrics והגדר את קנה המידה. לדוגמה, אם פיקסל אחד בתמונה מתאים ל- 0.72 מיקרון, הגדר פיקסלים בקנה מידה לאחד ומרחק קנה מידה ל- 0.072. לאחר מכן בחר את ניתוח המאקרו המשנה, ואם יש שתי תמונות ערוצים, החלף גם את המשקל.

לחץ על אישור וכאשר תתבקש לבחור את ספריית קבצי התמונה. זמן העיבוד יכול להיות מספר דקות לכל סינפסה. לאחר הניתוח, קבצי תמונה חדשים עבור כל סינפסה שנותחה מאוחסנים בתיקיית ההורים והמדידות הכמותיות הן התוצאות.

txt. בדוק את כל התמונות ואל תכלול תמונות עם שגיאות פילוח. לדוגמה, ייתכן שחלקים מהמסוף הסינפטי לא ייכללו בקו המתאר הצהוב.

חלקים מהרקע עשויים להיכלל במסוף הסינפטי. קו שלד כחול עשוי להימשך מעבר לקצה הסינפטי. ייתכן שיש יותר מדי אזורים פעילים, או שחלק מהאזורים הפעילים עשויים להישאר בלתי מזוהים.

אם ליותר מ-5% מהתמונות יש שגיאות סגמנטציה, בדוק אלגוריתמי ניתוח שונים כדי לשפר את עיבוד התמונה. מקטעי הווידאו הקרובים מתארים כיצד להגדיר רבות מהגדרות ניתוח המאקרו הללו. כדי להתאים את ערך רדיוס הכדור המתגלגל עבור המאקרו, בחר שלוש הקרנות NMJ Z המייצגות את מערך נתוני התמונה.

מחק את שם התמונה של התוצאה res ושני אזורים פעילים שם תמונת מחסנית, שנוצרו בעבר על ידי ניתוח המאקרו המשנה. פתחו את קובצי שמות תמונות האוסף של כל תמונה שנבחרה, ולאחר מכן, בסרגל הכלים, בחרו 'פצל ערוצים' ליצירת תמונה של ערוץ ראשון ותמונה של ערוץ שני, ושמרו קבצים אלה. פתח את התמונה השייכת לערוץ הראשון, שבמקרה זה תואמת לתיוג חיסוני של DLG one.

כעת, הפעל את המסנן להחסיר רקע, שנמצא תחת לשונית התהליך. הגדר את רדיוס הכדור המתגלגל לערך שמגדיל את הניגודיות בין הסינפסה לרקע. צור הקרנת Z עם סוג הקרנה כעוצמה מרבית ושמור את התמונה.

לאחר מכן הפעל את אלגוריתם הרקע החסר עם רדיוס הכדור המתגלגל החדש על כל הקרנות Z ושמור את התוצאות. כדי לקבוע את הספים האוטומטיים הטובים ביותר עבור המאקרו, פתח את תחזיות C השמורות והפעל את הסף האוטומטי עם האפשרות נסה הכל. מהתמונות המתקבלות, מצא את האלגוריתם המתאים ביותר לתמונות והמשך להשתמש בהגדרת הסף הזו בעת הפעלת המאקרו לתמונות נוספות.

הגדרת הספים האוטומטיים השונים, היא קריטית לפילוח נכון של התמונה לפי המאקרו. מסיבה זו, כדי לכמת כראוי שמונה מפרמטרי השילוט, חשוב להכיר את 16 אפשרויות הסף האוטומטי שמציעה התוכנה. לחץ על כפתור הפלוס כדי להגדיל את תמונת התוצאה של הסף האוטומטי.

שמות האלגוריתמים ממוקמים מתחת לכל תמונת תוצאה. בדוגמה זו, אלגוריתם הסף האוטומטי הטוב ביותר להגדרת סף המתאר של NMJ הוא הואנג. עבור סף השלד, ההגדרה הטובה ביותר היא לי, וההגדרה הטובה ביותר עבור סף האזור הפעיל היא הואנג.

כדי להגדיר את ערך סובלנות הרעש המקסימלית העדינה עבור המאקרו, חזור לתמונות NMJ המייצגות המקוריות. פתח את ערוץ BRP. עבור לכרטיסיית התוספים בתפריט הנפתח ובחר מקסימום תלת מימד

לאחר זמן קצר תופיע תמונה חדשה ולאחר מכן סגור את התמונה המקורית. לאחר מכן, השתמש בפקודה המינימלית 3D. לאחר מכן סגור את המקסימום של ערימות C2 סינפסה תמונה אחת ובחר את התמונה החדשה שנוצרה מינימום של מקסימום סינפסה של ערימת C2 אחת.

כעת השתמש בפקודה find maxima. בחלון החדש בחר בחירת נקודת תצוגה מקדימה והגדר את עמידות הרעש ל-50. נקודות המקסימום מסומנות לאחר מכן עם צלבים קטנים, שאמורים לכסות רק את האזורים הפעילים של הסינפסה.

אם נעשים יותר מדי צלבים, הגדל את ערך סובלנות הרעש. אם חלק מהאזורים הפעילים אינם מופיעים, הפחת את ערך סובלנות הרעש. השתמש בערך הסף הנגזר עבור שדה סובלנות הרעש המקסימלית של המאקרו.

בבחירת ערך סובלנות הרעש המקסימלי חשוב לכמת כראוי את מספר האזורים הפעילים. לפעמים יש צורך לנסות ערכים שונים כדי להגדיר את הערך המתאים. כעת התאם את כל הערכים הנגזרים באלגוריתמי הסף בממשק המאקרו והפעל את ניתוח תת המאקרו על התמונות המייצגות ששימשו במקור להגדרת הגדרות המאקרו.

ייווצר קובץ חדש עם האזורים הפעילים המסומנים בנקודות לבנות. פתח קובץ זה על ידי גרירה ושחרור שלו בסרגל הכלים ובחירת פרויקט Z עם סוג הקרנה כפרוסות מסוימות. לפיכך, נוצר קובץ הקרנה.

השלב הבא הוא התאמת הסף. בחלון הסף החדש החלק את הסרגל העליון כדי לבחור ערך סף שבו נקראים כל המוקדים הרצויים. אלה הנקודות החיוביות של BRP.

השתמש בערך זה כסף תחתון של BRP puncta. כעת, הפעל מחדש את הניתוח על תמונות ה-NMJ המייצגות המקוריות באמצעות הערכים, האלגוריתמים שהוגדרו קודם לכן, ולאחר מכן ערך הסף התחתון החדש של BRP. התמונות המתקבלות צריכות לעמוד בקריטריונים לניתוח ביקורתי.

כעת השתמש בהגדרות ההגדרה כדי להפעיל את המאקרו על כל תמונות NMJ המתקבלות באותם תנאים. המאקרו המורפומטרי של Drosophila NMJ שימש לאימות פגמים סינפטיים ידועים שונים בשלושה גנוטיפים מוטנטיים. ידוע כי לשני מוטאנטים של אנקירין יש בוטונים מאוחים ו-NMJs קטנים יותר.

באמצעות המאקרו נמדדו השטח וההיקף של פנורוניל וקווירין שני NMJs של RNAI ונמצאו קטנים משמעותית מקבוצת הביקורת. ה-GTPase Rab3 נדרש להפצה נכונה של ברוקפילה. כאשר מופרעים, יש פחות אזורים פעילים.

באמצעות המאקרו panuronil Rab 3 לזבובים היו בממוצע 138 אזורים פעילים לכל מסוף NMJ בהשוואה ל-290 שזוהו בבקרות. חוט גבוה הוא מווסת חשוב של צמיחת NMJ, וכאשר NMJs שעברו מוטציה הרחיבו את ההסתעפות במסופים שלהם. שימוש במאקרו פנורוניל חוט גבוה RNAI קווים הראו עלייה משמעותית במספר פרמטרים שמקורם בשלד ב-NMJs שלהם, כולל אורך כולל, אורך הענף הארוך ביותר, מספר הענפים ומספר נקודות ההסתעפות.

לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד להפעיל ולהתאים את ההגדרות של המאקרו Drosophila NMJ morphometrics. לאחר השליטה ניתן לבצע ניתוח של 50 סינפסות תוך שעה. זה חוסך כ-15 דקות של זמן כימות לכל סינפסה.

חשוב לרכוש תמונות באיכות טובה של ה-NMJ. ככל שהתמונות טובות יותר, כך ביצועי המאקרו יהיו טובים יותר. טכניקה זו תסייע לחוקרים בתחום הנוירוביולוגיה לכמת ביעילות פרמטרים מורפולוגיים של Drosophila NMJ.