Name: הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: למדו פרוטוקול להכנת רקמת מוח פרימטים לא-אנושיים לטרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיית אלקטרונים באמצעות קיבוע אקרולין. שיטה זו מאפשרת שימור לטווח ארוך ותיוג יעיל של מבנים סינפטיים במחקר נוירואנטומיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC, 401,848-2011 כדי MP). MP קיבל פרס הקריירה מן Fonds דה משוכלל ונדיר קוויבק-Santé (FRQ-S). LE היה הנמען של דוקטורט מן FRQ-S (FRQ-S 14D 29,441). אנו מודים מארי ג&#39;וזי Wallman לקבלת סיוע טכני.

<ol><li>Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+spatial+light+modulation+two-photon+microscopy+for+fast+functional+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging.</a> Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+study+of+detecting+gold+nanorods+in+living+cells+with+confocal+reflectance+microscopy+and+two-photon+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).</li>
<li>Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+12+nm+resolution+Fresnel+zone+plate+lens+based+soft+X-ray+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy.</a> Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).</li>
<li>Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+50+nm+spatial+resolution+EUV+imaging-resolution+dependence+on+object+thickness+and+illumination+bandwidth%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth.</a> Opt Express. , (2011).</li>
<li>Wachulak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+%26%2334%3Bwater+window%26%2334%3B+microscope+with+60+nm+spatial+resolution+for+applications+in+biology+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">A compact &#34;water window&#34; microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology.</a> Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).</li>
<li>Stikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+histology+of+the+myelin+g-ratio+with+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging.</a> Neuroimage. 118, 397-405 (2015).</li>
<li>Stikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+myelin+g-ratio+from+electron+microscopy+images+of+the+macaque+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum.</a> Data Brief. 4, 368-373 (2015).</li>
<li>Mollenhauer, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artifacts+caused+by+dehydration+and+epoxy+embedding+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy.</a> Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).</li>
<li>Henderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Realizing+the+potential+of+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Q.+Rev.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Realizing the potential of electron cryo-microscopy.</a> Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).</li>
<li>Sander, B., Golas, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+bionanostructures+using+transmission+electron+microscopical+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques.</a> Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).</li>
<li>Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+of+human+low-density+lipoprotein+and+bound+receptor+based+on+cryoEM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).</li>
<li>Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+cells+and+tissues+for+immuno+EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of cells and tissues for immuno EM.</a> Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).</li>
<li>Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+structural+organization+of+eukaryotic+and+prokaryotic+cytoskeletons+using+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography.</a> Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).</li>
<li>Humbel, B. M. Freeze-substitution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHumbel%2C+BM+%22Handbook+of+cryo-preparation+methods+for+electron+microscopy%22">Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy</a>. 13, 319-341 (2009).</li>
<li>Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStierhof%2C+Y+%22Handbook+of+cryo-preparation+methods+for+electron+microscopy%22">Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy</a>. 14, 344-365 (2009).</li>
<li>Leranth, C., Pickel, M. V. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-4757-2055-6_6">Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods.</a> Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).</li>
<li>Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).</li>
<li>Saito, T., Keino, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrolein+as+a+fixative+for+enzyme+cytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry.</a> J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).</li>
<li>King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrolein%3A+a+fixative+for+immunocytochemical+localization+of+peptides+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system.</a> J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).</li>
<li>Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemistry+and+electron+microscopy.+The+preservation+of+cellular+ultrastructure+and+enzymatic+activity+by+aldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation.</a> J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).</li>
<li>Karlsson, U., Schultz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+the+central+nervous+system+for+electron+microscopy+by+aldehyde+perfusion%3A+I.+Preservation+with+aldehyde+perfusates+versus+direct+perfusion+with+osmium+tetroxide+with+special+reference+to+membranes+and+the+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ultrastruct.+Res%22%5BJournal%5D)">Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space.</a> J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).</li>
<li>Sesack, S. R., Pickel, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+ultrastructural+localization+of+enkephalin+and+tyrosine+hydroxylase+immunoreactivity+in+the+rat+ventral+tegmental+area%3A+multiple+substrates+for+opiate-dopamine+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions.</a> J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).</li>
<li>Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+cortical+innervation+of+the+subthalamic+nucleus+in+MPTP-treated+parkinsonian+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys.</a> Brain. 138 (4), 946-962 (2015).</li>
<li>Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/protocol/10.1007%2F7657_2015_97">Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates.</a> Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).</li>
<li>Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+ultrastructural+study+of+serotonin+innervation+of+the+globus+pallidus+in+squirrel+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys.</a> Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).</li>
<li>Eid, L., Parent, A., Parent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asynaptic+feature+and+heterogeneous+distribution+of+the+cholinergic+innervation+of+the+globus+pallidus+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct.+Funct%22%5BJournal%5D)">Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates.</a> Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).</li>
<li>Eid, L., Parent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+evidence+for+dopamine+interactions+with+pallidal+neurons+in+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates.</a> Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).</li>
<li>McDonald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+freezing+for+preservation+of+high+resolution+fine+structure+and+antigenicity+for+immunolabeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling.</a> Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).</li>
<li>Gilkey, J., Staehelin, L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jemt.1060030206/abstract">Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure.</a> J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).</li>
<li>Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+adult+mouse+neocortex+comparing+aldehyde+perfusion+with+cryo+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation.</a> eLife. 4, (2015).</li>
<li>Karlsson, U., Schultz, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022532066800345">Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion.</a> J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).</li>
<li>Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+neurons+and+neuroglia+of+cerebral+cortex+and+corpus+callosum%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum.</a> Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).</li>
<li>Gocht, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+LR+white+resin+for+post-embedding+immunolabelling+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anat.+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue.</a> Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).</li>
<li>Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fixation+and+penetration+enhancement+techniques+for+use+in+ultrastructural+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry.</a> J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).</li>
<li>Manocha, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+glutaraldehyde+fixation+on+the+localization+of+various+oxidative+and+hydrolytic+enzymes+in+the+brain+of+rhesus+monkey%2C+Macaca+mulatta%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+J%22%5BJournal%5D)">Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta.</a> Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).</li>
<li>Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+immunodetection+of+various+protein+antigens+in+glutaraldehyde-fixed+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue.</a> J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).</li>
<li>Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemistry+of+glutamate+at+the+synaptic+level%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level.</a> J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).</li>
<li>Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kainate+receptors+in+primary+afferents+to+the+rat+gracile+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus.</a> Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).</li>
<li>Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+of+neural+tissues+for+electron+microscopy+by+perfusion+with+solutions+of+osmium+tetroxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide.</a> J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).</li>
<li>Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorthell%2C+J+%22Basic+Molecular+Protocols+in+Neuroscience%3A+Tips%2C+Tricks%2C+and+Pitfalls%22">Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls</a>. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).</li>
<li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+prepared+from+paraformaldehyde+is+stable%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Histochem%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable.</a> Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).</li>
<li>van Harreveld, A., Khattab, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+with+glutaraldehyde+and+post-fixation+with+osmium+tetroxide+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy.</a> J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).</li>
<li>Renno, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-embedding+double-gold+labeling+immunoelectron+microscopic+co-localization+of+neurotransmitters+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Sci.+Monit%22%5BJournal%5D)">Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain.</a> Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).</li>
<li>Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picking+Faces+out+of+a+Crowd%3A+Genetic+Labels+for+Identification+of+Proteins+in+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging.</a> Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).</li>
<li>Labrecque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+multiplex+single-particle+tracking+of+different+receptor+subtypes+labeled+with+quantum+dots+in+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons.</a> J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008(2016).</li>
<li>Bailey, R., Smith, A., Nie, S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1386947704003443">Quantum dots in biology and medicine.</a> Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).</li>
<li>Perkovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light-+and+electron+microscopy+with+chemical+tags%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative light- and electron microscopy with chemical tags.</a> J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).</li>
</ol>

החוקרים אין לחשוף.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול אמין זלוף transcardiac של פרימטים לא אנושיים אימונוהיסטוכימיה טרום ההטבעה המתאימה לבדיקת מדגם EM. למרות טיפוסי קריו-EM, כגון CEMOVIS, מספק שימור טוב של ultrastructure המוח, זה גם מגביל את השימוש אימונוהיסטוכימיה 12. טכניקות אחרות, כוללים החלפת קריו וטכניקת Tokuyaso, לאפשר שיתוף של פוסט-הטבעת אימונוהיסטוכימיה, אך הטכניקות הללו הן יקרות בשל התקנים נוספים הדרושים בתהליך ויכולות להיות רב זמן ומיומן-מאתגר 12,<...

במיקרוסקופ אור, כולל confocal מיקרוסקופיה שני פוטונים, הוכיחה להיות כלי יעיל לחקר בתהליכים עצביים vivo, בין היתר 1, 2. למרות הרזולוציה המרחבית הטיפוסית ברמת האור המיקרוסקופית (LM) היא כ 200 ננומטר, התקדמות טכנולוגית אחרונה באמצעות מקורות אור שונים, כגון אולטרה סגול קיצוני וכן במיקרוסקופ רנטגן הרכה, גדל בעיקר החלטה זו החלטה מרחבית 10 ננומטר כמעט 3 , 4, 5. התקדמות טכנולוגית אחרת הדמיה כוללת בשילוב הדמיה בתהודה מגנטית עם היסטולוגיה ולספק שיטה חדשה למדידת העובי של מעטפת המיאלין in vivo, פרמטר זה היה למדידה באופן מסורתי רק על מיקרוסקופית אלקטרונים (EM) הרמה 6, 7. AlthouGH התקדמויות אלה ברמת LM לספק כלי מצוין ללימוד תהליכי חיים, נוף ואפיון מפורט של מבנים, כגון קשרים סינפטיים, יכול להיות מושגת רק עם EM, המציע רזולוציה שיכול להגיע 0.5 ננומטר. עם זאת, תצפית ברמת EM מחייבת דגימות להיות מת ושינה במובנים מסוימים, עם fixatives כימי ותהליכי התייבשות, על מנת לשמר את cytoarchitecture. לפיכך, בחינת דגימות ביולוגיות ברזולוציה גבוהה יכול להיות מאתגרת בשל נזקי קרינה מקרן האלקטרונים, ניגודיות נמוכה, סטיות מבניות של ממברנות, או אפילו נוכחות של חפצים שיכולים להתרחש התייבשות אפוקסי הבאים הטבעה 8, 9, 10. שימור דגימות בצורתם המקורית לניתוח מבני יכול להיות מושגת על ידי שימוש &quot;Cryo EM סעיפים מזוגגים&quot; או CEMOVIS, גישת חתך כיכרוך מקפיא והטבעה המדגם במהירות קרח זגוגי בחינת הסעיפים תחת EM בטמפרטורה קריוגני 11, 12. הליך זה מאפשר בחינת דגימות בזמן שהם עדיין מוצקים hydrated מלא, ובכך לחסל חפצים הנגרמים על ידי התייבשות מעבד 13. עם זאת, שיטה זו כרוכה מכשירים נוספים קריו-ultramicrotomy, כמו גם מכשירים נוספים על EM הרגיל, על מנת לאפשר תצפית זו בטמפרטורות מאוד נמוכות, אשר יוצרות עלויות משמעותיות נוספות. בנוסף, הגישה CEMOVIS מונע את השימוש של immunolabeling טכניקות, מאז נוגדנים בדרך כלל צריך להיות וטופחו על RT. לחלופין, אפשר לשלב ניתוח ultrastructural עם נהלים אימונוהיסטוכימיים ידי שימוש בגישה הקפאת-החלפה, שבמהלכה דגימות קבוע קריו הם הפשירו לאט תוך immerged ב כימיקלים קריו-מגן והם הen מוטבע שרפים מיוחדים, כגון Lowicryls. פוסט-הטבעת immunolabeling יכול להתבצע אז על חומר כזה 12. עם זאת, הקפאה-החלפה וטכניקות קריו-קיבוע הן זמן רב. הם דורשים התקנה של ציוד נוסף ועדיין דורשים דגימות להיחשף ממס אורגני ו מקבעים כימי שיכול לשנות את cytoarchitecture, למרות השימוש בטמפרטורה נמוכה 14, 15. לפיכך, למרות כל ההתקדמות הטכנולוגית הן בבית LM ורמת EM, קיבוע כימי של רקמת המוח, במיוחד עם acrolein, נשאר שיטה בעלות נמוכה זמן יעיל לשלב אימונוהיסטוכימיה עם EM 16. בעשורים האחרונים, נעשו ניסיונות רבים למצוא תערובת של אלדהידים המספקים לשימור רקמות הטוב. לפני 1960, מקבע כימי רק כי נתן תוצאות מקובל EM היה tetroxide אוסמיום. עם זאת, tetroxide אוסמיום הוא רעיל ביותר ויקר, מניעת השימוש בו דרך מערכת כלי דם כדי לתקן איברים כמו המוח. Acrolein הוצג בשנת 1950 מאוחר כשיטה אמינה לשימור רקמות בעלי החיים מתאים תצפית EM של מבנים הסלולר 17. זה חודר לרקמה עמוקה יותר ומגיב מהר יותר מאשר אלדהידים אחרים כאשר נעשה שימוש עבור קיבוע על ידי טבילה ומאפשר שימור טוב של רכיבים ציטופלסמית, עם הצטמקות מינימאלית של הרקמה 17. תכונה כזו נותנת קיבוע acrolein יתרון ברור על פני אלדהידים אחרים בעת שימוש ברקמה טריה, על ידי מתן אפשרות לוקליזציה מדויקת יותר של חי תרכובות מולקולריות, כגון אנזימים וחלבונים אחרים 18. ואכן, שיטה זו הוכחה לאורך השנים כשיטה יעילה ונוחה בעלות נמוכה של קיבוע עבור להדמיה ברמה EM במינים רבים, כולל דו חיים מכרסמים, כפי שהוא יעיל stabiliפפטידים וחלבוני zes, שומרים antigenicity ומספקים יחסית ללא פגע ultrastructure כאשר נעשו שימוש בשילוב עם אלדהיד אחר קוֹבֵעַ 16, 18, 19, 20, 21. הפרוטוקולים לקיבוע acrolein במכרסמים יש ומאז כבר טופל ו שימוש נרחב, בעיקר על ידי קבוצת פיקל, ליישם immunolabeling כפול עבור 16 EM, 22. כמה קבוצות שהשתמשו קיבוע acrolein ברקמת המוח הפרימטים הלא-אנושי 23. עם זאת, למיטב ידיעתנו, יש רק פרוטוקול אחד שפורסם ביעילות המתאר קיבוע כימי עם acrolein ב פרימטים לא אנושיים התואמת EM immunolabeling 24. במאמר זה, אנו מספקים שיטה קלה ואמינה כימיים יעיל לתקן אי-לזמזםמוח הפרימטים עם acrolein, המאפשר שימור לטווח ארוך בפוטנציה יחד עם טרום הטבעת EM immunolabeling והעביר בדיקה.

<table><tbody><tr><td>נתרן פוספט נטול מים דו-בסיסי (Na2HPO4)</td><td>Fisher scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Monobasic monohydrate נתרן פוספט (NaH2PO4&#183; H2O)</td><td>EM Science</td><td>SX0710-1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>פישר מדעי</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>הידרוקסימתיל אמינומתאן (THAM)</td><td>פישר מדעי</td><td>T370-500</td><td></td></tr><tr><td>הידרוכלוריד&nbsp;</td><td>דילול EMD</td><td>HX0603-3</td><td>1 N. המוצר מאכל. יש להשתמש עם הגנה מתאימה.</td></tr><tr><td>דילול NaOH</td><td>EMD</td><td>SX0590-1</td><td>5 N. המוצר מאכל. יש להשתמש עם הגנה מתאימה.</td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>דילול של 4%. המוצר נדיף מאוד בצורת האבקה שלו ורעיל מאוד. השתמש בזהירות מתחת למכסה אוורור עם הגנה מתאימה.</td></tr><tr><td>אקרולאין (90%)</td><td>סיגמא</td><td>110221</td><td>דילול של 3%. המוצר רעיל מאוד. השתמש מתחת למכסה אוורור עם הגנה מתאימה.</td></tr><tr><td>שולחן אוורור נתיחה לאחר המוות</td><td>Mopec</td><td>CE400</td><td></td></tr><tr><td>משאבת זלוף אלקטרונית</td><td>קול פרמר</td><td>מאסטרפלקס L/S 7523-90</td><td></td></tr><tr><td>מחט (זלוף)</td> <td>terumo&nbsp;</td><td>NN-1838R</td><td>18 גרם 11/2</td></tr><tr>טרומו<td>מחט</td><td>&nbsp;</td><td>NN-2713R</td><td>21 גרם 1/2</td></tr><tr><td>קטמין</td><td></td><td></td><td>20 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>קסילזין</td><td></td><td></td><td>4 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>אצפרומזין</td><td></td><td></td><td>0.5 מ"ג/ק"ג</td></tr><tr><td>אזמל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>להבי אזמל</td><td>נוצות&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; לאנס</td><td>201011&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; J9913</td><td>מס '22 לניתוח ומס '11</td></tr><tr><td>למספריים</td><td></td><td></td><td></td>כירורגיים</tr> EM <tr><td>Rongeurs</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT 1200S</td><td>כיול להב לפני כל שימוש, כאשר המכשיר מאפשר זאת</td></tr><tr><td>סכין גילוח ויברטום</td><td>Gillette</td><td>GIN 642107</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר מדעי</td><td>G33-4</td><td>דילול 30%</td></tr><tr><td>אתילן גליקול</td><td>פישר מדעי</td><td>E178-4</td><td>דילול 30%</td></tr><tr><td>נתרן בורוהידריד (NaBH4)</td><td>Sigma</td><td>S-9125</td><td></td></tr><tr><td>סרום סוס רגיל (NHS)</td><td>Jackson immunoResearch Laboratories</td><td>008-000-121</td><td>דילול 2%</td></tr><tr><td>ג'לטין דגים קרים</td><td>Aurion</td><td>900.033</td><td>0.5% דילול. המוצר המקורי מרוכז ב-40%</td></tr> <tr><td>נוגדן ראשוני, SERT</td><td>Santa Cruz biotechnology</td><td>SC-1458</td><td>1/500 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני, דילול ChAT</td><td>Chemicon (Millipore)</td> <td>AB144P</td><td>1/25</td></tr><tr><td>נוגדן ראשוני, TH</td><td>ImmunoStar</td><td>22941</td><td>1/1,000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן משני ביוטיניל,</td><td>מעבדות וקטור</td> עזים <td>BA-9500</td><td>1/1,000 דילול</td></tr><tr><td>נוגדן משני ביוטיניל,</td><td>מעבדות וקטור</td><td>עכבר BA-2000</td><td>1/1,000 דילול</td></tr><tr><td>ערכת ABC עלית Vectastain מעבדות</td><td>וקטור</td><td>PK6100</td><td>8.8 ומיקרו; L/mL של A ו-B כל אחד</td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzidine (DAB)</td><td>Sigma</td><td>D5637</td><td>דילול של 0.05%. המוצר נדיף מאוד בצורת האבקה שלו ורעיל. אין לזרוק פסולת לכיור.</td></tr><tr><td>מי חמצן (H<תת>2O2) 30%</td> <td>פישר מדעי</td><td>H-323</td><td>0.005% דילול</td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד (OsO4)</td><td>מדע מיקרוסקופי אלקטרונים</td><td>2% 19152 4% 19150 </td><td>תמיסה מקורית יכולה להיות 2 או 4%. שימו לב לאיזה מהם משמש לחישוב הדילול הסופי של 1%. המוצר רגיש מאוד לאור. אוסמיום רעיל מאוד. השתמש רק מתחת למכסה אוורור עם הגנה מתאימה.</td></tr><tr><td>שרף אפוקסי דוחה מים Durcupan</td><td>Sigma</td><td>A: שרף אפוקסי M (44611) B: מקשה 964 (44612) C: מאיץ 960 (DY 060) (44613) D: פלסטיק (44614)&nbsp;</td><td>פילמור 48 שעות ב-58 מעלות; C לפני שזורקים פסולת.</td></tr><tr><td>כוסות אלומיניום</td><td>מדע מיקרוסקופי אלקטרונים</td><td>70048-01</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול מסחרי</td><td>אתנול</td><td>1019C</td><td>לדלל במים מזוקקים בריכוז מתאים</td></tr><tr><td>תחמוצת פרופילן</td><td>מדע מיקרוסקופי אלקטרונים</td><td>20401</td><td>ממס אורגני. נדיף מאוד ורעיל. השתמש מתחת למכסה המנוע.</td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית בינונית לא מצופות</td><td>מעבדות מחקר מוח</td><td>3875-FR</td><td>משטח גריז עם שמן מינרלי</td></tr><tr><td>סרט פלסטיק (סרט הטבעה של Aclar)</td><td>מדע מיקרוסקופי אלקטרונים</td><td>50425-25</td><td>משטח גריז עם שמן מינרלי</td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica UC7</td><td>EM UC7</td><td></td></tr><tr><td>כלי חיתוך יהלום (אולטרה-טריים)</td><td>דיאטומה&nbsp;</td><td>UT 1081</td><td>יכול להשתמש בסכין זכוכית לחלופין</td></tr><tr><td>Ultra 45&deg; סכין יהלום דיאטום</td><td>&nbsp;</td><td>MC13437</td><td>מצויד בסירה</td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Fisher scientific</td><td>X5SK-4</td><td></td></tr><tr><td>150-mesh רשתות נחושת</td><td>אלקטרונים מדע מיקרוסקופי</td><td>G150-cu</td><td></td></tr><tr><td>תיבת רשת</td><td>אלקטרונים מדע מיקרוסקופי</td><td>71138</td><td>יכול לאחסן עד 100 רשתות</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>אנכימיה</td><td>81983</td><td></td></tr><tr><td>עופרת חנקתית</td><td>סיגמא</td><td>L-6258</td><td>הכינו תמיסת מלאי של ציטראט עופרת העשויה מ-1.33&nbsp; גרם עופרת חנקתית ו-1.76&nbsp; גרם נתרן ציטראט מדולל ב-42&nbsp; מ"ל מים מזוקקים מבושלים ומקוררים מראש שאליהם 8&nbsp; מ"ל של 1&nbsp; N NaOH מתווספים לאחר השלמת ההמרה מחנקת עופרת לציטראט עופרת. ה-pH צריך להיות בערך 12. אחסן את התמיסה בבקבוק פלסטיק הרמטי והגן מפני אור.</td></tr><tr>טרומו <td>מזרק</td><td>&nbsp;</td><td>מסנן מזרק SS-05L</td><td>5 מ"ל</td></tr><tr><td></td><td>קורנינג</td><td>431222</td><td>0.2 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>נייר סופג (נייר ביבולוסי)</td><td>מדע מיקרוסקופי אלקטרונים</td><td>70086-1</td><td></td></tr><tr><td>סרט מעבדת</td><td>פרפילם</td><td>PM-999</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>סיגמא</td><td>M5904</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

למרות כל ההתקדמות הטכנולוגית ברמה המיקרוסקופית האור, מיקרוסקופ אלקטרונים נשאר הכלי היחיד במדעי המוח לבחון ולאפיין פרטי ultrastructural ו מורפולוגי של נוירונים, כגון קשרים סינפטיים. שימור טוב של רקמת המוח עבור במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן להשיג על ידי שיטות קריו-קיבוע קפדני, אך הטכניקות הללו הם די יקרים ולהגביל את השימוש immunolabeling, שהוא חיוני כדי להבין את הקישוריות של מערכות עצביות מזוהה. שיטות Freeze-החלפה פותחו כדי לאפשר שילוב של קיבעון קריו עם immunolabeling. עם זאת, השחזור של גישות מתודולוגיות אלה בדרך כלל מסתמך על מכשירי קירור יקרים. יתר על כן, השיג תוצאות אמינות עם טכניקה זו הוא גוזל זמן מאוד ומיומן-מאתגר. לפיכך, המוח הקבוע המסורתי כימי, במיוחד עם מקבע אקרולאין, נשאר זמן-יעיל שיטה זולה לשלב אלקטרוניםמיקרוסקופ עם אימונוהיסטוכימיה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול ניסוי אמין באמצעות קיבוע acrolein כימי שמוביל לשימור רקמות מוח הפרימטים והוא תואם מראש הטבעת בדיקה מיקרוסקופית אלקטרונים אימונוהיסטוכימיה והעביר.

בחלק זה, אנו מציגים תוצאות נציגים שהושגו בעקבות התצפית, ברמת EM השידור, של רקמת המוח הפרימטים immunostained הקבוע כימי בתערובת של acrolein 3% ו 4% PFA. השגנו שימור טוב של ultrastructure, כפי שצוין על ידי מעטפת המיאלין יחסית ללא פגע והדמיון המודרך המסודר של ממברנות כפולות (איור 2 א). קשרים סינפטיים, יחד עם אלמנטים עצביים מן המיקרו-סביבה, ניתן לזהות בקלות (איור 2B). אלמנטים עצביים שכותרתו עם diaminobenzidine (DAB) im...

כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להשיג צביעה אימונוהיסטוכימית אמינה לפני הטמעה (pre-embedding immunostaining) של רקמת מוח שאינה מקוף לצורך מיקרוסקופיה אלקטרונית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הנוירו-אנ உடומיה, כגון השכיחות הסינפטית של עצבוב נתון במבנה מוחי מדויק. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה שיטה פשוטה וזולה לסימון עצבובים ספציפיים המתאימה למיקרוסקופיה אלקטרונית.התחילו בהעברה של חתכים בעובי 50 מיקרון של מוח פרימט שאינו אדם, שקובעו באקרולאין ומכילים את אזור העניין, לצלחת 12 באריים המכילה PBS. שטפו את החתכים הצפים חופשי שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הדגרו את החתכים בתמיסת סודיום בורוהידריד שהוכנה טרי למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. נעו בעדינות ללא כיסוי.לאחר תום 30 הדקות, שאבו את הנתרן בורוהידריד והוסיפו PBS לכל באר. הניחו את הפלטה על רוקר (Rocker) ונערו בעוצמה למשך 10 דקות. חזרו על השטיפה פעמיים נוספות או עד שכל גז התגובה יסולק.חסמו את החתכים על ידי דגירה בתמיסה של 2% normal serum ו-0.5% cold fish gelatin המדוללים ב-PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר תוך כדי ניעור עדין. לאחר תום זמן הדגירה, דגרו את החתכים בתמיסת נוגדן ראשוני עם ניעור עדין למשך לילה בטמפרטורת החדר. למחרת, לאחר שטיפת החתכים כפי שנעשה קודם לכן, דגרו את החתכים בתמיסת נוגדן שני למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.לאחר שטיפת החתכים כפי שבוצע קודם לכן, יש להדגיר בתמיסת avidin-biotin-peroxidase או תמיסת ABC למשך שעה אחת תוך써נדנוע. לאחר מכן, הכין תמיסה רעננה של 0.05% 3, 3'Diaminobenzidine עם 0.005% hydrogen peroxide המדוללים ב-TBS. לאחר השטיפה, הדגיר את החתכים בתמיסת ה-DAB למשך שלוש עד שבע דקות תוך써נדנוע עדין.ברגע שהמשקעת החומה הגיעה לצבע הרצוי, יש לעצור את התגובה על ידי שטיפה מהירה פעמיים ב-TBS קר, ולאחר מכן באמצעות סדרה של שטיפות מתוזמנות ב-TBS וב-PB. העבירו את הפלטה המכילה את החתכים שצבעו ב-DAB למכסה השאיבה. העבירו את החתכים לפלטה בעלת שישה בארות המלאה ב-PB והשטיחו את החתכים לחלוטין על ידי שאיבה זהירה של ה-PB מהפלטה באמצעות פיפט, ולאחר מכן הוסיפו תמיסת אוסמיום טטראוקסיד טיפה אחר טיפה כדי למנוע הפרעה לחתכים המושטחים.כסו את הפלטה בנייר אלומיניום כדי להגן על החתכים מפני אור והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ללא ערבוב. במהלך האוזמיפיקציה, הכינו שרף אפוקסי דוחה מים על ידי הוספת כמויות מתאימות מכל מרכיב של תערובת שרף האפוקסי לכוס פלסטיק גדולה. ערבבו בעזרת מקל עץ או פיפטה מפלסטיק עד לקבלת צבע חום הומוגני, ולאחר מכן העבירו כמויות שוות של שרף לכוסות אלומיניום בגודל המתאים למספר החתכים המיועדים לעיבוד והניחו לשרף להירגע.עם סיום תקופת האוסמיפיקציה, שטפו את החתכים שלוש פעמים ב-PB למשך 10 דקות תוך כדי ניעור איטי. לאחר השטיפה, בצעו דהידרטציה של החתכים בסדרה הבאה של אתנול בריכוזים מדורגים, למשך שתי דקות בכל שלב. לאחר מכן, העבירו את החתכים לבקבוקון זכוכית ממולא ב-propylene oxide והדגירו ב-propylene oxide שלוש פעמים למשך שתי דקות בכל פעם, כדי להשלים את תהליך הדהידרטציה.לאחר מכן, העבירו את החתכים בזהירות, אחד אחד, אל כוסות האלומיניום, תוך הימנעות ממגע עם האוויר ככל האפשר. הטמיעו את החתכים בצורה שטוחה בתוך שרף אפוקסי דוחה מים שהוכן מראש, והדגירו אותם למשך הלילה תחת מנדף פליטה בטמפרטורת החדר. למחרת, צפו שקופיות זכוכית וכיסויים פלסטיים בשמן מינרלי, ולאחר מכן רככו את השף על ידי הדגרה של כוסות האלומיניום בטמפרטורה של 60 °C למשך 12 עד 15 דקות לכל היותר.שטחו בזהירות את החתכים בצדו המשומן של השקף. הניחו את כיסוי הזכוכית המשומן ודחפו בזהירות החוצה כל בועת אוויר שנותרה. הדגרירו את השקפים בטמפרטורה של 60 °C למשך 48 שעות.לאחר 48 שעות, הסר את כיסוי הפלסטיק, כך שהחתך יישאר עטוף בשרף. התחל באיתור אזור העניין באמצעות משקפת, ולאחר מכן השתמש בסכין מנתחים (scalpel) כדי לחתוך פיסת רקמה קטנה ומרובעת בשטח של כ-one milliliter squared. לאחר מכן, שייף את קצהו של בלוק שרף והדבק עליו את פיסת הרקמה המרובעת.לאחר הייבוש, הניחו את בלוק השרף על משטח המיקרוטום האולטרה (ultramicrotome) במצב אנכי והשתמשו בלהב תער חד כדי לחתוך בהדרגה כל צד של בלוק השרף ליצירת טרפז בעל דפנות חלקות. לאחר מכן, העבירו את המשטח למצב אופקי וסובבו את הבלוק עד שהצד הארוך ביותר של הטרפז פונה כלפי מטה. הניחו כלי קיצוץ יהלום או סכין זכוכית במקום המיועד לכך.כוון את האולטרה-מיקרוטום לחיתוך חתכים בעובי 300 מיקרון במהירות של מילימטר אחד לשנייה. כוון את הסכין כך שתהיה מקבילה אנכית לחלק המרובע ותציג זווית אופקית קטנה מאוד של כמעלה אחת, וגזם את פני השטח של החלק המרובע עד להופעת הרקמה. כעת, עבור לסכין יהלום בעלת זווית של 45 מעלות המצוידת באמבטיה מלאה במים מזוקקים כדי לחתוך חתכים בעובי 80 מיקרון.החליקו את הSections על ידי מעבר עליהם עם פיסת נייר סופג טבולה ב-xylene מבלי לגעת בפני השטח של המים, ואספו Sections סדרתיים על גרידים מנחושת בחוזק 150 mesh ללא תמיכה. הניחו את הגרידים בקופסת אחסון לגרידים, ולאחר מכן הכינו תמיסה ביחס של אחד לאחד של תמיסות stock של lead citrate ומים מזוקקים וסננו אותה דרך מסנן מזרק של 0.2 micron. כסו את המבחנה בנייר אלומיניום כדי להגן עליה מהאור.הניחו כל רשת על טיפה של תמיסת לטד סיטרט (lead citrate) מדוללת, כך שהחתך יהיה במגע עם התמיסה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה קטנה כדי להחזיק את הרשת ושטפו אותה ביסודיות בשתי כוסות כימיות המכילות מים מזוקקים. הסירו בעדינות את עודפי המים בעזרת נייר סופג והניחו את הרשתות בקופסה המיועדת לרשתות. לאחר 30 דקות, ניתן לבחון את החתכים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (TEM).מיקרוגרף אלקטרוני זה של הגלובוס פאלידוס הפנימי (internal globus pallidus) של קוף סנאי מראה חומר שנשמר היטב לאחר פרפוזיה טראנס-קרדיאלית של acrolein-PFA בטכניקת immunoperoxidase diaminobenzidine. כפי שניתן לראות, הפרוצדורה מאפשרת לראות את מעטפת המיאלין של אקסון גדול, המסומן על ידי ראש החץ. מיקרוגרף אלקטרוני זה של הגלובוס פאלידוס החיצוני (external globus pallidus) מדגים כי ניתן לזהות בקלות פרופילים דנדריטיים, המסומנים באות d, אקסונים קטנים לאומילינתיים, המסומנים באות a, ובקוריקוסיטיות של אקסונים, המסומנות av.החצים מראים דוגמה לווריקוזיטי של אקסון המבססת מגע סינפטי סימטרי עם הפרופיל הדנדריטי. ניתן לזהות בקלות אלמנטים שעברו סימון אימונולוגי לפי הציטופלזמה או האקסופלזמה שלהם, המלאים במשקע DAB דחוס באלקטרונים. כאן, דנדריט שסומן אימונולוגית עבור choline acetyltransferase ב-GPi מקבל מגע סינפטי מווריקוזיטי של אקסון לא מסומן.מיקרוגרף אלקטרוני זה מציג אקסון מיאליני ב-GPe עם מעטפת מיאלין שלמה יחסית, כאשר האקסופלזמה שלו מסומנת אימונולוגית עבור tyrosine hydroxylase. דוגמה זו מציגה וריקוסיטי (varicosity) של אקסון ב-GPi המסומנת אימונולוגית עבור סרטונין טרנספורטר (serotonin transporter), היוצרת מגע סינפטי סימטרי עם דנדריט. בדוגמה זו, משקע ה-DAB מצפה את ממבנה הפלזמה ואת השטח החיצוני של האורגנלות.הבצילת האקסונית (axon varicosity) המוצגת כאן נצפתה ב-GPe ועוברה בסימון אימונוהיסטוכימי לטירוזין הידרוקסילאז. זהו דוגמה למשקע DAB הממלא לחלוטין את האקסופלזמה, כאשר שלפוחיות סינפטיות נראות אך קשה יותר להגדיר את גבולותיהן. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון אימונוהיסטוכימיה כפולה לפני הטמעה (pre-embedding), כדי לענות על שאלות נוספות כגון קולוקליזציה של חלבונים או רצפטורים ברמה הסינפטית.לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה לגבי אופן ההכנה של אימונוהיסטוכימיה לפני הטמעה (pre-embedding) של רקמת מוח שאינה מקוף, המשך לתהליך ההטמעה בשרף אפוקסי, וחיתוך אולטרה-דק של אזור העניין לפרוסות בעובי 80 מיקרומטר המתאימות למיקרוסקופיה אלקטרונית.

preparation-non-human-primate-brain-tissue-for-pre-embedding

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בנקאות המוח דגימה שיטתית של חומר ביולוגי מספק את הבסיס stereology משוחדת למקסימום את פוטנציאל נתונים המתקבלים הדגימה כל אחד.

בנקאות המוח: הפיכת רוב דוגמאות המחקר שלך

בקנה מידה גדול immunodetection של חלבונים יעד ברחבי המוח הפרימטים כולו ניתן על ידי העסקת רקמה רומן הטבעה וכן חתך שיטות בשילוב עם השימוש במנגנון יצירתיים מכתים אצווה של ריחוף ללא מקטעים מרובים בכל זמן נתון.

אצווה Immunostaining לגילוי בקנה מידה גדול חלבון הנמצא במוח הקופים שלמים

אנו מתארים פרוטוקול עבור זלוף transcardiac של הסרת, עכברים חתך של המוח, כמו גם מכתים אימונו, הטבעה שרף, Ultrathin חתך של חלקים במוח. עם השלמת הליכים אלה, החומר immunostained מוכן בדיקה עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

הכנת רקמות מוח עכבר מיקרוסקופית Immunoelectron

אנו מדגימים את השימוש באקדח הגן להציג צבעי ניאון, כגון DiI, לתוך הנוירונים פרוסות המוח של מכרסמים פרימטים שאינם בני אדם בגילאים שונים. במקרה הספציפי הזה, אנו משתמשים בעכברים בוגרים (3-6 חודשים) וקופים cynomologus מבוגר (9-15 שנים). טכניקה זו, שתוארה לראשונה על ידי במעבדה של ד"ר ליכטמן...

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

תהליך מלא של הכנת הדגימה המוח הדמיה חתך סדרתי באמצעות מיקרוסקופ כסכין סריקה, עד ראיה וניתוח של נתונים מתואר. טכניקה זו משמשת כיום לרכוש במוח העכבר נתונים, אך הוא החלים על איברים אחרים, מינים אחרים.

הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

מקור: Eid, L. &amp; Parent, M. הכנת רקמת מוח של פרימטים לא אנושיים להטמעה מוקדמת של אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופ אלקטרונים. J. Vis. Exp. (2017). סרטון זה מדגים את הכנת רקמת מוח פרימטים לא אנושית קבועה באלדהיד באמצעות אימונוהיסטוכימיה מוקדמת למיקרוסקופ אלקטרונים. הוא מתאר את השלבים לתיוג חיסוני של חלבון עצבי ספציפי, ואחריו תגובת פרוקסידאז המייצרת משקע צבעוני, המאפשר הדמיה של חלבון המטרה במיקרוסקופ אלקטרונים.

ביצוע אימונוהיסטוכימיה על רקמת מוח של פרימטים שאינם אנושיים

הפרוטוקול המתואר כאן מיועד להערכה מבנית של תכשיר רשתית שלם. זה כולל תיאורים של דיסקציה של רקמות, הרכבה על תוספת ממברנה פוליטטרפלואורואתילן הידרופילית (PTFE), העמסת בולוס עם סמנים פלואורסצנטיים, והשוואה של קיבוע עם קרבודימיד ופרפורמלדהיד לניתוח אימונוהיסטוכימי של רכיבים תאיים וסינפטיים.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

פרוטוקול רמת מבוא זה מתאר את הריאגנטים, הציוד והטכניקות הנדרשים להשלמת צביעה אימונוהיסטוכימית של מוחות מכרסמים, תוך שימוש בסמנים למיקרוגליה ואלמנטים עצביים כדוגמה.

פריימר לאימונוהיסטוכימיה על רקמות Cryosectioned מוח חולדה: דוגמא להכתמת Microglia ונוירונים

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה של הזרקה תוך חדרית ותוך וסקולרית של חלקיקים נגיפיים או מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים למוח העכבר היילוד. ניתן לזהות את דפוס הלוקליזציה של הנגיף והננו-חלקיקים על ידי הערכה מיקרוסקופית או על ידי הכלאה באתר.

הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד

רומן, חיסוני התאמה לניקוי רקמות הרקמה כמו הדמיה 3D האולטימטיבי של איברים הממס נקי לאפשר הדמיה 3D של זיהום המוח וירוס כלבת הסביבה הסלולרית המורכבת שלה. עבה, נוגדן מתויג פרוסות רקמת המוח נעשים שקופים להגדיל את עומק ההדמיה כדי לאפשר ניתוח תלת-ממד על ידי המיקרוסקופיה סריקת לייזר מיקרוסקופ.

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

פרוטוקול זה מתאר שיטה לשילוב הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) ואימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית (IHC) באזורי מוח עכבר טריים קפואים וקבועים, במטרה להשיג FISH רב-תוויות ואות IHC פלואורסצנטי. IHC התמקד בחלבונים ציטופלזמיים וחלבונים המחוברים לממברנה.

שילוב של הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם אימונוהיסטוכימיה פלואורסצנטית על חלקי מוח טריים של עכברים קפואים או קבועים

למדו פרוטוקול להכנת רקמת מוח פרימטים לא-אנושיים לטרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ומיקרוסקופיית אלקטרונים באמצעות קיבוע אקרולין. שיטה זו מאפשרת שימור לטווח ארוך ותיוג יעיל של מבנים סינפטיים במחקר נוירואנטומיה.

הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים

גלה סרטונים נוספים