הכנה של רקמת מוח הפרימאטים לא-אנושית עבור טרום הטבעת אימונוהיסטוכימיה ו מיקרוסקופי אלקטרונים
3 באפריל 2017
כאן, אנו מספקים קלה, בעלות נמוכה, וזמן חסכוני פרוטוקול לתקן כימי רקמת מוח הפרימטים עם מקבע אקרולאין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואמת טרום הטבעה אימונוהיסטוכימיה עבור במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להשיג צביעה חיסונית אמינה מראש של רקמת מוח שאינה פרימטים למיקרוסקופ אלקטרונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הנוירואנטומיה, כגון השכיחות הסינפטית של עצבוב נתון במבנה מוח מדויק. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמדובר בשיטה קלה ובעלות נמוכה לתיוג עצבים ספציפיים המתאימים למיקרוסקופ אלקטרונים.
התחל בהעברת חלקים בעובי 50 מיקרון של מוח פרימט לא אנושי קבוע של אקרולאין המכיל את אזור העניין לצלחת 12 בארות המכילה PBS. שטפו את החלקים הצפים החופשיים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגרו את החלקים בתמיסת נתרן בורוהידריד טרייה שהוכנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. נדנד בעדינות ללא כיסוי.
לאחר שחלפו 30 הדקות, שאפו את הנתרן בורוהידריד והוסיפו PBS לכל באר. מניחים את הצלחת על נדנדה ומנערים במרץ במשך 10 דקות. חזור על הכביסה פעמיים נוספות או עד שאף אחד מגז התגובה לא נשאר.
חסום את החלקים על ידי דגירה בתמיסה של 2% סרום רגיל ו-0.5% ג'לטין דגים קר מדולל ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין. לאחר שחלף זמן הדגירה, דגרו את החלקים בתמיסת נוגדנים ראשונית עם נדנוד עדין למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, לאחר שטיפת החלקים כמו קודם, דגרו את החלקים בתמיסת נוגדנים משנית למשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.
לאחר שטיפת החלקים כמו קודם, יש לדגור בתמיסת אבידין-ביוטין-פרוקסידאז או ABC למשך שעה עם נדנדה. לאחר מכן, הכינו תמיסה טרייה של 0.05%3, 3'Diaminobenzidine עם 0.005% מי חמצן מדולל ב-TBS. לאחר הכביסה, דגרו חלקים בתמיסת ה-DAB למשך שלוש עד שבע דקות עם נדנוד עדין.
לאחר שהמשקעים החומים התפתחו לצבע הרצוי, עצרו את התגובה על ידי שטיפה מהירה פעמיים ב-TBS קר, ולאחר מכן באמצעות סדרה של שטיפות TBS ו-PB מתוזמנות. העבר את הצלחת המכילה את החלקים המוכתמים ב-DAB אל מכסה האוורור. העבירו חלקים לצלחת שש בארות מלאה ב-PB ושטחו לחלוטין את החלקים על ידי הוצאת ה-PB בזהירות מהצלחת, ולאחר מכן הוסיפו תמיסת טטרוקסיד אוסמיום טיפה אחר טיפה כדי למנוע הפרעה לחלקים המשוטחים.
מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי להגן על החלקים מפני אור ודוגרים למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ללא תסיסה. במהלך האוסמופיקציה, הכינו שרף אפוקסי דוחה מים על ידי הוספת כמויות מתאימות של כל רכיב בתערובת שרף האפוקסי לכוס פלסטיק גדולה. מערבבים בעזרת מקל עץ או פיפטה מפלסטיק עד לקבלת צבע חום הומוגני, ואז מעבירים כמויות שוות של שרף לכוסות אלומיניום בגודל מתאים למספר החלקים שיש לעבד ומניחים לו לנוח.
לאחר שחלפה תקופת האוסמיפיקציה, שטפו את החלקים שלוש פעמים ב-PB למשך 10 דקות עם נדנדה במהירות נמוכה. לאחר הכביסה יש לייבש את החלקים בסדרה הבאה של אתנול מדורג למשך שתי דקות כל אחד. לאחר מכן, העבירו את החלקים לבקבוקוני זכוכית מלאים בתחמוצת פרופילן ודגרו בתחמוצת פרופילן שלוש פעמים למשך שתי דקות כל אחד כדי להשלים את תהליך ההתייבשות.
לאחר מכן העבירו את החלקים בזהירות, בזה אחר זה, לכוסות האלומיניום, הימנעו ככל האפשר ממגע עם אוויר. שטוח להטמיע את החלקים בשרף אפוקסי דוחה מים מעורבב בעבר ולדגור אותם למשך הלילה מתחת למכסה האוורור בטמפרטורת החדר. למחרת, ציפוי שקופיות זכוכית וכיסוי פלסטיק מחליק בשמן מינרלי, ואז מרכך את השרף על ידי דגירה של כוסות האלומיניום ב-60 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 15 דקות לכל היותר.
משטחים בזהירות את החלקים בצד המשומן של מגלשת הזכוכית. הנח את החלקת הכיסוי המשומנת ודחף בזהירות החוצה את כל האוויר שנותר. דגרו את המגלשות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
לאחר 48 שעות, הסר את החלקת כיסוי הפלסטיק והשאיר את החלק עטוף בשרף. התחל בשימוש במשקפת כדי לאתר את אזור העניין ולאחר מכן השתמש באזמל כדי לחתוך חתיכת רקמה מרובעת קטנה של כמיליליטר אחד בריבוע. לאחר מכן, תייק את קצה גוש השרף ולאחר מכן הדבק עליו את חתיכת הרקמה המרובעת.
לאחר הייבוש, הנח את גוש השרף בסיפון האולטרה-מיקרוטום במצב אנכי והשתמש בסכין גילוח חד כדי לחתוך בהדרגה כל צד של גוש השרף ליצירת טרפז עם דפנות חלקות. לאחר מכן, הניחו את הסיפון במצבו האופקי וסובבו את הבלוק עד שהצד הארוך ביותר של הטרפז פונה כלפי מטה. הניחו כלי חיתוך יהלומים או סכין זכוכית בחלל ייעודי.
הגדר את האולטרה-מיקרוטום לחתוך חלקים של 300 מיקרון במילימטר אחד לשנייה. כוונן את הסכין כך שתהיה מקבילה אנכית לחלק המרובע ולהציג זווית אופקית קטנה מאוד של כמעלה אחת וחתוך את פני החלק המרובע עד שהרקמה מתחילה להופיע. כעת, עברו לסכין יהלום אולטרה 45 מעלות המצוידת בסירה מלאה במים מזוקקים כדי לחתוך חלקים בעובי 80 מיקרון.
החלק חלקים על ידי מעבר עליהם עם פיסת נייר סופג עם קצה קסילן מבלי לגעת בפני המים, ואסוף חלקים סדרתיים על רשתות נחושת חשופות של 150 רשת. הנח את הרשתות בקופסת אחסון רשת ולאחר מכן הכין תמיסה אחת לאחת של תמיסת מלאי ציטראט עופרת ומים מזוקקים וסנן דרך מסנן מזרק 0.2 מיקרון. מכסים את הבקבוקון בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור.
הנח כל רשת על טיפה מתמיסת העופרת המדוללת ציטראט, כשהחלק במגע עם התמיסה לאחר מכן השתמש בפינצטה קטנה כדי להחזיק את הרשת ולשטוף אותה היטב בשתי כוסות המכילות מים מזוקקים. מסירים בעדינות את עודפי המים בעזרת נייר סופג ומניחים את הרשתות בקופסת רשת. לאחר 30 דקות ניתן לבחון את החלקים במיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
מיקרוגרף אלקטרונים זה של הגלובוס פלידוס הפנימי של קוף הסנאי מראה חומר שמור היטב לאחר זלוף טרנס-לב של אקרולאין-PFA בטכניקת אימונופרוקסידאז דיאמינובנזידין. כפי שניתן לראות שם, ההליך מאפשר לראות את מעטפת המיאלין של אקסון גדול, המסומן על ידי ראש החץ. מיקרוגרף אלקטרונים זה של הגלובוס פלידוס החיצוני מדגים את הפרופילים הדנדריטיים, המסומנים באות d, ניתן לזהות בקלות אקסונים קטנים לא מיאלינים, המסומנים על ידי a, ודליות אקסון, המסומנות av.
החצים מראים דוגמה לדליות אקסון היוצרות מגע סינפטי סימטרי עם הפרופיל הדנדריטי. ניתן לזהות בקלות אלמנטים בעלי תווית חיסונית על ידי הציטופלזמה או האקסופלזמה שלהם המלאה במשקעי DAB צפופים באלקטרונים. כאן, דנדריט מוכתם חיסוני לכולין אצטילטרנספראז ב-GPi מקבל מגע סינפטי מדליות אקסון לא מסומנות.
מיקרוגרף אלקטרונים זה מראה אקסון מיאליני ב-GPe עם מעטפת מיאלין שלמה יחסית שהאקסופלזמה שלה מסומנת כחיסונית לטירוזין הידרוקסילאז. דוגמה זו מציגה דליות אקסון ב-GPi המסומן בטרנספורטר סרוטונין היוצר מגע סינפטי סימטרי עם דנדריט. בדוגמה זו, משקעי ה-DAB מרפדים את קרום הפלזמה ואת המשטח החיצוני של אברונים.
דליות האקסון המוצגות כאן נצפתה ב-GPe וסומנה חיסונית לטירוזין הידרוקסילאז. זה מייצג דוגמה למשקעי DAB הממלאים לחלוטין את האקסופלזמה, כאשר שלפוחיות סינפטיות נראות אך קשות יותר לתיחום. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כמו הטמעה מוקדמת של אימונוהיסטוכימיה כפולה כדי לענות על שאלות נוספות כמו קולוקליזציה של חלבונים או קולטנים ברמה הסינפטית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין אימונוהיסטוכימיה מוקדמת של רקמת מוח שאינה פרימטים, להמשיך להטמעה בשרף אפוקסי, ולחתוך את אזור העניין למקטעים בעובי 80 מיקרומטר המתאימים למיקרוסקופ אלקטרונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לתיקון כימי של רקמת מוח פרימטים באמצעות חומר קיבוע אקרוליין, המאפשר שימור לטווח ארוך התואם עם אימונוהיסטוכימיה לפני הטמעה לצורך מיקרוסקופיית אלקטרונים. השיטה נועדה להיות קלה, חסכונית בעלות ויעילה מבחינת זמן.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- נוירולוגיה
- נוירואנטומיה
- מיקרוסקופיית אלקטרונים
רקע
- צביעה אימונוהיסטוכימית אמינה לפני הטמעה היא חיונית ללימוד רקמת מוח.
- הבנת שכיחות הסינפסות במבנים מוחיים ספציפיים היא מוקד מחקר מרכזי.
- קיבוע באקרוליין מציע יתרונות בשימור רקמות.
- שיטה זו מתאימה במיוחד למחקרים על מוח פרימטים שאינם בני אדם.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול לתיקון יעיל של רקמת מוח.
- להקל על צביעה אימונוהיסטוכימית לצורך מיקרוסקופיית אלקטרונים.
- לשפר את חקר המבנים הסינפטיים בנוירואנטומיה.
שיטות ששימשו
- העברת קטעים בעובי 50 מיקרון של רקמת מוח קבועה באקרוליין ל-PBS.
- שטיפת הקטעים ב-PBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
- דגירת הקטעים בתמיסת נתרן בורוהידריד למשך 30 דקות.
- נענוע עדין של הקטעים ללא מכסה במהלך הדגירה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר תיוג יעיל של חיבורים פנימיים ספציפיים.
- מתאפשר שימור לטווח ארוך של רקמת מוח.
- אושרה התאימות למיקרוסקופיית אלקטרונים.
- השיטה חסכונית בעלות ויעילה מבחינת זמן.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק גישה אמינה לתיקון רקמת מוח.
- הוא תומך במחקרים מתקדמים בנוירואנטומיה ובמבנים סינפטיים.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל שיטה זו ליישומים שונים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This protocol enables cost-effective preservation of non-human primate brain tissue for ultrastructural analysis, supporting target validation in neuroscience drug discovery. By combining chemical fixation with pre-embedding immunohistochemistry, it provides a scalable approach to study synaptic connectivity and neuronal morphology relevant to neuropsychiatric and neurodegenerative disease models. The method reduces reliance on expensive cryo-fixation while maintaining compatibility with electron microscopy, facilitating mechanistic de-risking in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through ultrastructural visualization of synaptic contacts in defined brain circuits.
- Operational Value: Supports biological de-risking by confirming target engagement and neuronal pathway integrity at the ultrastructural level.
- Predictive Value: Enhances confidence in target selection by providing direct evidence of neuroanatomical specificity and connectivity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by preserving antigenicity and ultrastructure for correlative light and electron microscopy.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation for reproducible immunohistochemical labeling, reducing variability in target validation assays.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple brain regions and antibody panels due to low cost and minimal equipment requirements.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant system integrity by preserving neuronal ultrastructure in non-human primate models, aligning with translational biomarker studies.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing consistent ultrastructural readouts across study phases.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling detailed morphological assessment of potential off-target effects on neural circuitry.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing to preclinical validation, enabling ultrastructural confirmation of mechanistic hypotheses in neuropsychiatric and neurodegenerative disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing synaptic incidence of specific innervations in precise brain structures.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, reproducible pre-embedding immunostaining suitable for quantitative electron microscopy analysis.
- Analytics: Generates quantitative ultrastructural measurements (e.g., synaptic density, axon varicosity frequency) that help teams compare experimental conditions and assess target specificity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by preserving disease-relevant neuronal architecture in primate models, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable histology platform rather than a single-use technique, adaptable across multiple targets and brain regions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence through direct visualization of target-specific synaptic connections, reducing mechanistic ambiguity in neuroanatomy.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via well-defined chemical fixation and immunostaining steps, minimizing inter-lab variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of ultrastructural off-target effects, reducing late-stage biological risk in CNS drug development.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by delivering ultrastructural data that informs target validation and lead optimization strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, immunohistochemistry, and electron microscopy sample preparation.
- Needs access to standard laboratory equipment including centrifuges, incubators, ultramicrotomes, and transmission electron microscopes.
- Demands cross-team standardization between histology, imaging, and data analysis groups to ensure consistent sectioning, staining, and quantification.
- Involves adaptation considerations for different brain regions, antibody penetration, and antigen retrieval efficiency across species and fixation conditions.
- Practical limitations include longer processing times compared to frozen sections and the need for optimization of antibody concentrations and DAB development times to avoid over-staining.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:43
Pre-embedding Immunohistochemistry
3:11
Osmification and Embedding for Electron Microscopy Observation
6:23
Sample Preparation for Ultrathin Sectioning and Observation Using a Transmission Electron Microscope
9:05
Results: Immunolabeling of the Squirrel Monkey Globus Pallidus for ChAT, SERT and TH
11:08
Conclusion
