שימוש במבחנה לחיות תאים הדמיה כדי לחקור Chemotherapeutics מועברת על ידי חלקיקים המבוססת על שומנים בדם
1 בנובמבר 2017
הדמיה לחיות תאים הוא כלי רב עוצמה כדי לחזות תהליכים דינאמיים. הבחינה של תאים קבוע מספק רק תמונות סטטיות, אשר יכול להוביל פירוש מוטעה ובלבול לגבי התהליך. עבודה זו מציגה שיטה ללמוד ספיגת התרופה שחרור, לוקליזציה תאיים של חלקיקים liposomal בתאים חיים.
המטרה הכוללת של טכניקת דימות תאיים חיים זו היא לעקוב אחר תהליכים תאיים, כגון ספיגה והפצה של חומרים כימותרפויטיים, ללא צורך בקיבוע. שיטות אלו יכולות לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הסרטן, כגון: כיצד חומרים כימותרפויטיים, הן בצורה חופשית והן כאשר הם encapsulated בננו-חלקיקים, נספגים על ידי תאי גידול. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא העובדה שאנו מדמים תאים חיים, ובכך מונעים ארטיפקטים של קיבוע ומאפשרים הערכה דינמית בזמן אמת.
הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבחנו שננו-חלקיקים התפרקו במהלך הקיבוע, דבר שהוביל לפרשנות שגויה של הולכת התרופה. כדי להרכיב את תא ההדמיה, מקמו זכוכית כיסוי במידה של 25 מילימטר בחלק התחתון של התא והבריגו את החלק העליון אל החלק התחתון. אין להדק חזק מדי, שכן הזכוכית עלולה להישבר.
בצעו עיקור באוטוקלבה לתא כולו. לצורך זריעת התאים, הוציאו את תא ההדמיה משקית הסטריליזציה בתוך מCabin Laminar Flow. הידקו בזהירות את התא והניחו אותו בתוך Petri Dish.
צפו את זכוכית תא ההדמיה במיליליטר אחד של ג'לטין סטרילי בריכוז 0.1% למשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 °C וב-5% Carbon Dioxide. לאחר הסרת המצע מבקבוקי תרבית התאים, שטפו את התאים פעם אחת עם 1x PBS ונתקו את התאים באמצעות Trypsin בריכוז 0.25%. נטרלו את ה-Trypsin על ידי הוספת מצע לתרבית תאים.
לאחר מכן, אספו את התאים וסובבו אותם ב-1,100 Gs למשך חמש דקות. השביו את המשקע ב-5 mL של מצע לתרבית תאים. לאחר ספירת התאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, שאבו את הג'לטין והעבירו את התאים לצלוחית בדילול המאפשר כיסוי מקסימלי של 70% תוך 24 שעות.
אפשרו לתאים להיקשר ב-5% Carbon Dioxide ובטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. בצעו הערכה של התאים תחת מיקרוסקופ כדי לבדוק התלכדות (confluency), מורפולוגיה תאית וזיהום. לאחר מכן, הפעילו את המיקרוסקופ הקונפוקאלי, את התאורה הפלואורסצנטית ואת המחשב.
חברו את מחמם העדשה לעדשה וחממו אותה ל-35 מעלות. הכינו את יחידת האינקובציה כפי שמוצג בפרוטוקול הכתוב. הניחו את יחידת האינקובציה על במת המיקרוסקופ וחברו את צינורות הכניסה והיציאה של ה-Carbon Dioxide.
פתחו את שסתום הפחמימה הראשי והפעילו את בקר הפחמימה. ודאו שהבקר מוגדר לחמישה אחוזים של Carbon Dioxide. תנאי תרבית תאים נאותים כגון טמפרטורה, CO2, pH, לחות וסטריליות הם קריטיים להדמיית תאים לטווח ארוך.
לכן, יש לבחון כראוי כל אינקובטור. הגדירו את טמפרטורת הבמה ל-37 °C. המתינו עד שיחידת האינקובציה תגיע לטמפרטורה ולאחוז ה-Carbon Dioxide שנבחרו.
הוציאו את תא הדימוג מהאינקובטור הראשי של פחמן דו-חמצני והעבירו את התא בתוך צלחת פטרי לחדר המיקרוסקופיה. הניחו את תא הדימוג במחזיק במה ייעודי בעל קוטר של 35 millimeter וסגרו את התא בעזרת מכסה איטום ייעודי. פתחו את יחידת האינקובציה, ובצעו את הפעולות במהירות רבה ככל האפשר כדי למנוע קירור של התאים; החליפו את הרפידה האדומה בתא הדימוג ולאחר מכן סגרו את היחידה.
וודאו שאין כבלים שנתקעו בין הבמה לבין המיקרוסקופ. השאירו את היחידה להסתגל לטמפרטורה למשך 30 דקות. לאחר מכן, פתחו את התוכנה והפעילו את הלייזר.
צור מסד נתונים חדש על ידי לחיצה על "New" תחת לשונית File. תן שם למסד הנתונים ושמור אותו. הגדר את הקונפיגורציה על ידי לחיצה על "Config" תחת לשונית Acquire.
בחר ב-Channel Mode "וב-Single Track" כדי להעריך פלואורופור בודד. בחר ב-Multi Track עבור מספר פלואורופורים. לאחר מכן, בחר את מסנני ה-band-pass המתאימים, התואמים לפלואורופור.
בחר את ערוץ השדה בהיר (bright field) באחד המסלולים. הסריקה נפגעת מהאיזון בין האות הפלואורסצנטי של התרכובות לבין איכות התמונה. חשיפת יתר, פוטובליצ'ינג (photobleaching), יחס אות לרעש, איכות התאים והתרכובות שהתוספו הם כולם גורמים שיכולים להשפיע על התוצאות ויש לבחון אותם כראוי.
הגדירו את בקרת הסריקה על ידי לחיצה על "Scan" תחת לשונית ה-Acquire. לאחר מכן, לחצו על "Mode" כדי להגדיר את גודל הפריים, מהירות הסריקה, כיוון הסריקה וממוצע הסריקה. לחצו על "Channels" כדי להגדיר את ה-Pinhole, את ה-Gain וה-Offset, ואת הספק הלייזר.
שמרו הגדרות אלו על ידי לחיצה על "Config" בלשונית ה-Configuration ושמרו אותן במסד נתוני ה-Configuration. הגדירו את צילום השזרירה (time-lapse) על ידי לחיצה על "Muti TimeX" בלשונית ה-Macro. לחצו על Single Location.
החיל את התצורה השמורה על ידי לחיצה על Single Track וגלול לתצורה הדרושה במסד נתוני התצורות (Configuration database). הגדר את מרווח הזמן ואת מספר הסריקות. טען את התצורה על ידי לחיצה על Load Conf.
נקוב בשם עבור סדרת הצילומים (time-lapse) בשדה שם קובץ הבסיס (Base File Name) ובחר את מסד הנתונים על ידי לחיצה על "Image Data Base" כדי לשמור את סדרת הצילומים. הגדר תיקייה זמנית על ידי לחיצה על "Temporary Image Folder". לאחר מכן, פתח את יחידת האינקובציה, הרם את טבעת הדימות, הוסף טיפה של שמן טבילה (Immersion Oil) לעדשה, וסגור את היחידה במהירות האפשרית. בצע פוקוס ובחר מיקום בתא הדימות.
בתוך תא הזרימה הלמינרית, דללו תרופה חופשית או ננו-חלקיקים בריכוז של 5 µg/mL של התרופה או 0.05 µmol של ליפידים במצע לתרביות תאים. סננו באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרון אם התרופה או הננו-חלקיקים אינם סטריליים. פתחו את תא הדגירה והרימו את המכסה העליון.
לאחר מכן, הסירו את המצע מהתאים, הוסיפו 1 mL של תרופה מדוללת או ננו-חלקיקים, וסגרו את היחידה במהירות המרבית. התמקדו בתאים ובצעו סריקה מהירה על ידי לחיצה על "Single" בלשונית Scan Control. כאשר תמונת השדה המואר (bright field) מראה תאים ממוקדים, התחילו את צילום הש czasie (time-lapse) על ידי לחיצה על "Start Time" במאקרו Multi TimeX.
מספר החזרות והזמן שנותר מוצגים במקרו ובבתמונות. יש לבדוק באופן סדיר אם התאים עדיין נמצאים במיקוד, או להשתמש באוטופוקוס (Autofocus). התוכנה שומרת באופן אוטומטי את סרטון ה-time-lapse במסד הנתונים.
אין לסגור את מסד הנתונים בעוד התוכנית פועלת. זהו סרטון Time-lapse של שלוש שעות של תאים שנחשפו ל-Doxorubicin חופשי. שימו לב לספיגה ולמעבר המיידי של Doxorubicin פלואורסצנטי אדום לגרעין.
כאן, התאים מדגגרים למשך שלוש שעות עם Doxorubicin encapsulated. האות הפלואורסצנטי נמוך בהרבה וממוקם בציטופלזמה. האות בקושי נראה בגרעין התא.
בעקביות עם העברת סרטי Time-lapse אלו ל-Image J, ניתן לסמן אזור עניין (ROI) סביב הגרעין ולמדוד את צפיפות הפיקסלים. הגרף המוצג כאן מראה את ההבדל בספיגה הגרעינית לאורך זמן בתאים שדגרו עם Doxorubicin חופשי או כזה העטוף בקפסולות. מוצגים כאן תאים שדגרו עם Doxorubicin עטוף, המסומנים בצבע אדום.
האות הסגולה מייצגת את הנשא, והליזוזומים צבועים במסמן ירוק לתאי חיים. השוואה בין שני סוגי התאים מראה הבדל בפיזור הליזוזומי. הליזוזומים בתאי B16BL6 מפוזרים ברחבי הציטופלזמה.
בעוד שליזוזומים בתאי BLM ממוקמים קרוב לגרעין, שניים מסלולי התאים מראים קולוקליזציה גבוהה של סיגנל אדום וסגול בליזוזומים, המעידה על כך ש-Doxorubicin והנשא שלו כלואים באברונים אלה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לדמות את הספיגה של סוכני כימותרפיה ומרקרים פלואורסצנטיים אחרים בתאים חיים למשך מספר שעות או אפילו ימים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקה של דימיון תאים חיים לוויזואליזציה של ספיגה והפצה של חומרי כימותרפיה בזמן אמת. על ידי מניעת ארטיפקטים של קיבוע, השיטה מאפשרת תצפית מדויקת על תהליכי הולכת תרופות בתאים חיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- מחקר סרטן
רקע
- דימות תאים חיים מספק תובנות דינמיות לגבי תהליכים תאיים.
- דימיון של תאים מקובעים עלול להוביל לפרשנות שגויה של מנגנוני הולכת תרופות.
- חלקיקים ננומטריים עשויים להתפרק במהלך הקיבוע, דבר המסבך את הניתוח.
- דימיון בזמן אמת הוא חיוני להבנת אינטראקציות של תרופות בטיפול בסרטן.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה למעקב אחר ספיגת סוכני כימותרפיה בתאים חיים.
- הערכת התפלגות של ננו-חלקיקים ללא ארטיפקטים של קיבוע.
- שיפור ההבנה של מנגנוני הובלת תרופות בתאי גידול.
שיטות שהשתמשו בהן
- הכנה של תא דימות לצפייה בתאים חיים.
- תרבית תאים תחת תנאים מבוקרים (טמפרטורה, CO2, לחות).
- שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית למעקב אחר תהליכים תאיים.
- דימות במרווחי זמן (Time-lapse) ללכידה של שינויים דינמיים לאורך זמן.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של ספיגת תרופה והפצתה בזמן אמת.
- הדגמה של היתרונות של דימוי תאים חיים על פני שיטות של תאים מקובעים.
- אספקת תובנות לגבי התנהגותן של ננו-חלקיקים בתאים חיים.
- אפשרות לצפייה בתגובות תאיות לחשיפה לתרופה.
מסקנות
- דימות תאים חיים הוא כלי בעל ערך לחקר מנגנוני הולכת תרופות.
- השיטה מפחיתה את הסיכון לטעויות בפירוש התוצאות הקשורות לקיבוע (fixation).
- יישומים עתידיים עשויים לשפר אסטרטגיות לטיפול בסרטן.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי תאים חיים מאפשר מעקב בזמן אמת אחר ספיגה ותנועה תוך-תאית של ננו-חלקיקים כימותרפויטיים, ובכך נותן מענה לפער קריטי בפיתוח תרופות אונקולוגיות, שבו ארטיפקטים של קיבוע מסתירים אירועים דינמיים של שחרור תרופות ותעתוע גרעיני. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי אספקת נתונים כמותיים בעלי רזולוציית זמן על קינטיקה של שחרור התרופה ומיקום תת-תאי, המנחים ישירות את אופטימיזציית המולקולות המובילות ואת בחירת המועמדים הפרה-קליניים. באמצעות ויזואליזציה של גורלם של נשאי ננו תבסוסי-שומן בתאי גידול חיים, השיטה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים, ובכך מפחיתה את שיעור הנשירה בשלבים מאוחרים עקב הבנה שגויה של מנגנוני הפעולה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר תצפית ישירה על שחרור של חומרים כימותרפיים מנשאי ננו ועל התעתוק הגרעיני העוקב, ובכך מבהיר את הקשר המכניסטי בין המסירה לבין הפעילות הביולוגית.
- ערך תפעולי: מבטל ארטיפקטים הנגרמים מקשירה (fixation) המעוותים את שלמות הננוחלקיקים ואת התפלגות התרופה, ובכך מבטיח פרשנות מדויקת של פרופילי הספיגה והשחרור.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדידות כמותיות של עוצמת פלואורסצנציה לאורך זמן, מה שמאפשר השוואה בין קינטיקה של תרופה חופשית לעומת תרופה encapsulated בהקשר פיזיולוגי רלוונטי.
- ערך תפעולי: מקים פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכת מערכות הובלת תרופות מבוססות ננו-חלקיקים בתנאי תאי חיים, ובכך תומך ביכולת הרחבה של הבדיקה ובשימוש חוזר במספר פרויקטים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין פירוק נשאי הננו-חלקיקים ושחרור התרופה לבין קולוקליזציה ליזוזומלית והצטברות גרעינית, ובכך מספק סמן ביולוגי תרגומי לזמינות התרופה התוך-תאית.
- ערך תפעולי: מסייע בקבלת החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) באמצעות ויזואליזציה של השאלה האם תרופות encapsulated מגיעות בכמות מספיקה לגרעין כדי לעורר את ההשפעות הפרמקולוגיות המצופות, ובכך מפחית אי-ודאות מכניסטית במודלים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מוקדם של המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), כאשר ויזואליזציה בזמן אמת של שחרור התרופה וההפצה התת-תאית מספקת מידע על קשרי מבנה-פעילות ואופטימיזציה של עיצוב נשאי הננו לפני בדיקות יעילות פרה-קליניות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי יציבות נשאים ננומטריים, קינטיקה של שחרור תרופות ומסלולי תעתוע תוך-תאיים, על ידי אפשור תצפית ישירה על מעבר של doxorubicin מהציטופלזמה לגרעין.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות ומוכנות לבדיקה של ספיגת תרופות והצטברות גרעינית לאורך זמן, מה שמאפשר השוואה זה לצד זה של משתני פורמולציה בתנאי תאיים חיים זהים.
- אנליטיקה: מספקת נתוני עוצמת פלואורסצנציה בשיטת time-lapse מאזורים מוגדרים של עניין (למשל, גרעין, ליזוזומים), המאפשרים השוואה סטטיסטית של יעילות הולכת התרופה בין חומרים חופשיים לחומרים encapsulated בננו-חלקיקים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין התנהגות הנשא הננומטרי בתאים חיים לבין תוצאות פרמקולוגיות המשכיות, על ידי קורלציה בין דפוסי תעתוע ליזוזומליים לזמינות התרופה בגרעין, ובכך תומכת בהחלטות קידום המותאמות לסממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצגת יכולת דימות מודולרית הניתנת ליישום על פני פלטפורמות ננו-חלקיקים וחומרי כימותרפיה מרובים, ובכך מפחיתה פיתוח שיטות כפול ומאפשרת סריקה מכניסטית של כל תיק הפיתוח.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במנגנון התרופה על ידי חשיפת שחרור התרופה ותעתוק גרעיני בזמן אמת, ובכך מפחית עמימות בנוגע למעורבות המטרה ולהפעלת המסלול.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות הכנה סטנדרטית של התא, בקרות סביבתיות ופרמטרי דימות, תוך מזעור השונות במחקרי תאים חיים לאורך זמן.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי זיהוי מוקדם של נשאי ננו שאינם תפקודיים, ובכך מונע השקעה במערכות הולכה שאינן משחררות תרופה פעילה באתר הפעולה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לנשאי ננו בהתבסס על שחרור תרופות תוך-תאי והולכה גרעינית מוכחות, ובכך מסנכרן את קידום הפיתוח עם התקפות המכניסטית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדימות תאים חיים, מיקרוסקופיה קונפוקלית ורכישת תמונות בשיטת time-lapse כדי לשמר את חיוניות התאים ואת שלמות האות לאורך תקופות ממושכות.
- תלוי בציוד ייעודי הכולל יחידות אינקובציה עם בקרה על טמפרטורה ו-CO2, לייזרים קונפוקליים וגלאים רגישים למעקב אחר ננו-חלקיקים בעלי אות חלש.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת התאים, מינון התרופות ופרוטוקולי הדימות כדי להבטיח השוואה בין מחקרים ואתרים שונים.
- כולל שיקולי התאמה עבור סוגי תאים שונים, גדלי ננו-חלקיקים ותיוגים פלואורסצנטיים, שכן יחסי אות-רע וספי Phototoxicity משתנים בהתאם לתנאי הניסוי.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכונים ל-photobleaching במהלך דימוי לטווח ארוך ואת הצורך באופטימיזציה קפדנית של עוצמת הלייזר ומהירות הסריקה כדי לאזן בין איכות האות לבין בריאות התאים.
