ניתוח מורפולוגיה דנדריטים ב עמודות שכבות
23 במרץ 2017
כאן, אנו מראים כיצד לנתח ניתוב הדנדריטים של נוירונים לשד תסיסנית בעמודות ושכבות. זרימת העבודה כוללת טכניקת דימות כפול במטרה לשפר את איכות התמונה ואת בכלים חישוביים לאיתור, רישום סוכות דנדריטים למערך טור התייחסות לניתוח מבנים הדנדריטים בחלל 3D.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנתח ניתוב דנדרי של נוירונים בוגרים של דרוזופילה מדולה בעמודות ובשכבות כדי לאפיין דפוסים דנדריים, לקבוע סוגי תאים על סמך מורפולוגיה ולזהות מוטציות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כולל מיפוי מעגלי המוח, והבנת מנגנון החיווט של הדנדריטים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מעבירה את התכונות הדנדריטיות במרחב תלת מימדי, ובכך משפרת את ההבנה של לוגיקה ופונקציות חיווט דנדריטיות.
מטרת הליך זה היא לרכוש שתי ערימות תמונות של הנוירונים המעניינים בשני כיוונים אורתוגונליים, אופקיים וחזיתיים. באמצעות הטכניקות הסטנדרטיות, מכתימים מוחות זבובים מנותחים עם אנטי-GFP של ארנב ונוגדנים ראשוניים המסמנים את הנוגדנים הראשוניים של אקסוני קולטני האור. לאחר מכן סמנו את הנוגדנים העיקריים בנוגדנים משניים פלואורסצנטיים ונקו את המוח ב-70% גליצרול ו-1X PBS.
כדי להרכיב את המוח בכיוון האופקי, העבירו מוח נקי גליצרול לתוך טיפה של 20 מיקרוליטר של מדיום הרכבה אנטי-דהייה המופקד במרכז שקופית המיקרוסקופ. לאחר מכן, חברו טלאים קטנים של חימר בארבע הפינות כדי למנוע מהכיסוי לרסק את המוח. כעת תחת מיקרוסקופ מנתח, מקם את המוח במצב הגחון למעלה.
השתמש במשטח הגבי הקמור של המוח כנקודת ציון לזיהוי הכיוון של דגימת המוח. זה יספק תצוגה אופקית של הנוירון. ואז חבר את הכיסוי.
באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, המצויד באופן אידיאלי בגלאי GaAsP, השג את ערימת התמונות התצוגה האופקית עם מטרת צמצם מספרית גבוהה וזום דיגיטלי של 2.5. רכוש לפחות 180 קטעים אופטיים, יש 512 פיקסלים מרובעים וגודל מדרגה של 2 מיקרון. לאחר לקיחת ערימת התמונות הראשונה, הסר את הכיסוי מהשקף ומקם מחדש את המוח במצב הקדמי למעלה המספק מבט חזיתי.
לאחר מכן, באמצעות אותה טכניקה, צור ערימת תמונות חדשה של התצוגה הקדמית של אותם נוירונים שצולמו בתצוגה האופקית. הקפד לרשום גם את מיקום הנוירון המעניין ביחס לנוירופל המדולה. זיהוי אותם נוירונים אפשרי בהגדלה נמוכה יותר.
עם זאת, אם האות אובד מכיוון שהרקמה עמוקה, פשוט דמיין את החצי הגחוני של המוח שלך. בדוק גם אם הדגימה זזה בעת רכישת תמונות על-ידי בחינת ערימות התמונות. קונבולוציה של תמונה ושילוב תמונות מפורטים בפרוטוקול הטקסט.
מטרת הליך זה היא להתחקות אחר נויריטים ולהקצות נקודות ייחוס לרישום. תחילה פתח את קובץ התמונה המשולב מחדש. לאחר מכן עבור אל עריכה.
לאחר מכן הצג את התאמת התצוגה וכבה את ערוץ קולטני האור, שהוא אדום. לאחר מכן, דמיין את התמונה במצב עלייה. אם המחשב מצויד במערכת סטריאוגרף, הפעל את הסטריאו והשתמש במצב המאגר המרובע כדי להמחיש תמונות תלת-ממדיות.
הוסף חוטים חדשים, עבור למעבר ואז חוטים, ולחץ על הכרטיסייה שכותרתה דלג על יצירה אוטומטית, ערוך ידנית. לאחר מכן לחץ על לשונית הציור ובחר עומק אוטומטי. לאחר מכן, בחר הגדרות.
החלף את אפשרות הקו והזן את מספר הפיקסלים המתאים לתצוגה חזותית טובה יותר. לאחר מכן החלף את הצג דנדריטים, נקודת התחלה ונקודת הסתעפות, והגדר את איכות העיבוד ל-100%כעת בחר את כרטיסיית הציור והתחל לעקוב אחר נויריטים. התחילו עם האקסון, ואז עברו לדנדריטים.
האקסון והדנדריטים של נוירוני הטרנס מדולה צריכים להיות קלים להבדלה. לאחר מעקב אחר העצבים, חזור להגדרות, והחלף גם את נקודת ההתחלה וגם את נקודת ההסתעפות. לאחר מכן עבור להתעלות ואז לייצא.
בחר אובייקט ושמור את החוט כקובץ ממציא. השלב הבא הוא הקצאת נקודות התייחסות. כדי להתחיל, בחר הצג התאמת תצוגה והפעל את שני ערוצי ההדמיה.
ואז לכו להתעלות, ואז למדידה. ותחת לשונית העריכה, החלף ערוץ ספציפי ובחר את ערוץ קולטני האור במקרה זה. כעת הקצו נקודות התייחסות לשכבה העליונה.
בחר מעבר ולאחר מכן נקודות מדידה, וסמן את תחילת שכבת m1 כשכבה עליונה. השתמש בפונקציית מישור החיתוך כדי להקל על הקצאת הנקודה. סדר הנקודות הוא קו המשווה, קו המשווה הקדמי, הקדמי, הגחוני הקדמי, הגחון, הגחון האחורי, האחורי, המשווני האחורי והמרכז.
כדי למצוא את קולטן האור המרכזי, הוא זה הקשור לתהליכים הדנדריטיים ביותר. לאחר מכן, הקצה את נקודות הייחוס לשכבות R8 ו-R7 באותה טכניקה. לאחר הגדרת כל קבוצה של נקודות ייחוס, ייצא את הקואורדינטות.
בחר סטטיסטיקה, ולאחר מכן פירוט, ערכים ספציפיים ומיקום. לאחר מכן בחר ייצוא סטטיסטיקה בתצוגת כרטיסייה לקובץ, ושמור את הקואורדינטות כקובץ CSV. לאחר מכן, פתח את שלושת קבצי ה- CSV בעורך גיליונות אלקטרוניים.
העתק והדבק את הקואורדינטות של 27 נקודות ההתייחסות לקובץ חדש, לפי הסדר של החלק העליון, R8 ולאחר מכן R7. המשך על ידי ביצוע פרוטוקול טקסט לסטנדרטיזציה של גוף קשיח ורישום לא ליניארי TPS לתצורת הגחון הימני בחישוב הסתעפות דנדריטית ותדרי סיום. בסופו של דבר, הנתונים משמשים ליצירת עלילות אינפורמטיביות שונות. באמצעות הליך ההדמיה הכפול המוצג כאן, מוח זבוב המכיל נוירונים TM 20 מתויגים בדלילות צולם בשני כיוונים אורתוגונליים.
רקומבינציה של תמונה משפרת את הרזולוציה הצירית. לתמונה המשולבת יש רזולוציה טובה יותר מאלה של תמונות התצוגה האופקית והתצוגה הקדמית. לאחר התייעצות עם מודלים תלת-ממדיים, עקבות דנדריטיות נאספו מתאי עצב של 15 TM 20 והושוו לעקבות דנדריים מתאי עצב של 15 TM 2.
נותחוהסתברויות ההסתעפות והסיום של נוירונים אלה. שני הסוגים היו דומים עבור מקטעים של פחות מ-4 מיקרון. ניתוח ספציפי לשכבה של סיום דנדריטי הראה ששני סוגי הנוירונים מתפלגים באופנים ספציפיים לשכבה מובחנת.
דנדריטים Tm 2 מקבלים כניסות ב-m2 וב-m5. בעוד דנדריטים tm 20 מסתיימים בשכבת m1 עד m3. ניתוח מישורי מראה כי דנדריטים tm 2 מקרינים מלפנים, בעוד שדנדריטים tm 20 מקרינים מאחור.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לרכוש שתיים מהתמונות הקונפוקליות שלך. קרא את סימני המחקר שלך בקבצי ההדמיה וחלץ את המאפיינים הדנדריטיים מתמונות אלה. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לסמן את הדגימה כראוי לפני הדמיה קונפוקלית.
מכיוון ששילוב ההדמיה ייכשל אם הדגימה תזוז במהלך ההדמיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לניתוח הניתוב הדנדריטי של נוירונים במדולה של זבוב Drosophila בוגר בתוך עמודים ושכבות. הוא עושה שימוש בטכניקות דימוי בעלות מבט כפול (dual-view) ובכלים חישוביים לשיפור איכות התמונה ולניתוח מבנים דנדריטיים במרחב תלת-ממדי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- נוירו-אנטומיה
- טכניקות דימות
רקע
- ניתוב דנדריטי הוא חיוני להבנת המעגלים המוחיים.
- אפיון דפוסי דנדריטים מסייע בקביעת סוגי תאים.
- זיהוי מוטנטים יכול לספק תובנות לגבי תפקוד עצבי.
- ניתוח תלת-ממדי משפר את ההבנה של לוגיקת החיווט הדנדריטית.
מטרת המחקר
- לניתוח ניתוב דנדריטי בנוירוני המדולה של Drosophila.
- לאפיון תבניות דנדריטיות ולקביעת סוגי תאים.
- לזיהוי מוטנטים המשפיעים על המורפולוגיה הדנדריטית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- רכשו שני ערימות תמונות של נוירונים באוריינטציות אורתוגונליות.
- צבעו מוחות של זבובים שבוצע להם ניתוח באמצעות נוגדנים ספציפיים.
- סמנו את הנוגדנים הראשוניים באמצעות נוגדנים משניים פלואורסצנטיים.
- בצעו הבהרה של המוח באמצעות glycerol ו-PBS לצורך הדמיה.
תוצאות עיקריות
- טכניקות דימות משופרות מחזקות את ניתוח המבנה הדנדריטי.
- מיפוי בתלת-ממד חושף את החיווט המורכב של הדנדריטים.
- מתבצע אפיון של סוגי תאים על בסיס מורפולוגיה.
- זיהוי מוטנטים מספק תובנות לגבי התפתחות עצבית.
מסקנות
- שיטה זו מקדמת באופן משמעותי את ההבנה של ניתוב דנדריטי.
- היא מקלה על מיפוי מעגלי המוח ב-Drosophila.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל טכניקה זו ליישומים רחבים יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר ניתוח תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של ארכיטקטורה דנדריטית במעגלים עצביים מוגדרים, ובכך תומך בתיקוף מטרות בנורו-פרמקולוגיה על ידי קישור פנוטיפים מבניים להפרעות גנטיות. באמצעות כימות של סיומות ספציפיות לשכבות והקרנה מישורית של עצי דנדריטים, הוא מספק הפחתת סיכונים מכניסטית לגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS) באמצעות שיפור הביטחון החזוי במודלים של מעגלים עצביים. תהליך העבודה מקל על זיהוי פגמים ספציפיים לסוגי תאים, ומסייע בהלימה של ביומרקרים תרגומיים ובזיקוק מודלים פרה-קליניים עבור אינדיקציות נוירו-פסיכיאטריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי מתאם בין מורפולוגיה דנדריטית לבין מניפולציות גנטיות או פרמקולוגיות בתתי-סוגים עצביים מוגדרים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות הערכה כמותית של תדירויות הסתעפות וסיום של דנדריטים כמדדים תפקודיים.
- ערך חיזוי: מגביר את רמת הביטחון במטרה על ידי ביסוס קשרי מבנה-תפקוד במעגלים של נוירונים במומאללה (medulla) הרלוונטיים למסלולים עקביים של התפתחות עצבית.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר שרטוטי דנדריטים תלת-ממדיים סטנדרטיים וניתנים לשחזור, הרשומים למסגרת עמודית של ייחוס לצורך דירוג מורפולוגי עקבי.
- פלט כמותי: מספק תדרי סיומיים ספציפיים לשכבות ומדדי היטל מישורי המאפשרים ניתוח בעל תוכן גבוה של תבניות דנדריטיות.
- תועלת הפלטפורמה: עושה שימוש בערכות כלים של MIPAV ו-MATLAB בקוד פתוח, התומכות ביכולת הרחבה ובשחזור בין מעבדות במסעות סריקה ממוקדי נוירו-אנাটোמיה.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: ממפה פגמים דנדריטיים לשכבות ספציפיות (למשל, m1–m3 עבור tm20 לעומת m2/m5 עבור tm2), מה שמאפשר התאמה לסמנים ביולוגיים תרגומיים של תפקוד לקוי במעגלים עצביים.
- המשכיות פרה-קלינית: מספק מערכת רלוונטית למחלה להערכת מוטציות גנטיות המשפיעות על החיווט העצבי, ובכך תומך בקבלת החלטות מבוססות סיכונים לגבי קידום המחקר.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהיר פגמים בלוגיקת החיווט במודלים של התפתחות נוירולוגית, ובכך מפחית עמימות במחקרי מעורבות של מטרות טיפוליות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי המרת נתוני דימוי למאפיינים דנדריטיים מדידים, המסייעים בשלבי זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) ובשלבי תיקוף פרה-קליני.
- ביולוגיה של תגליות: תומכת בבדיקת היפותזות באמצעות מעקב דנדריטי בתלת-ממד וניתוח ספציפי לשכבות כדי להבהיר את הזהות הנוירונלית ואת לוגיקת המעגל.
- סריקה: מאפשרת סטנדרטיזציה של בדיקות באמצעות רישום מבוסס-ייחוס ומעקב אוטומטי של ענפי דנדריטים ברקעים גנטיים שונים.
- אנליטיקה: גוזרת תדירויות של התפצלות וסיום כמדדים כמותיים להשוואת תנאים בניתוחים של מוטנטים לעומת סוג בר.
- מחקר תרגומי: מקשרת העדפות של שכבות דנדריטיות להומולוגים משוערים בקליפת המוח של חוליתיים, ובכך תומכת ברציפות תרגומית בין מינים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תהליך (pipeline) של דימוי וניתוח הניתן לשימוש חוזר לצורך פנוטיפינג שיטתי של מוטנטים נוירונליים בתוכניות גילוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית באפיון פנוטיפי של נוירונים על ידי אספקת נתונים בעלי רזולוציה מרחבית של ארכיטקטורת הדנדריטים.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות שחזור תמונות במבט כפול והקצאת נקודות ייחוס סטנדרטיות בין השכבות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי מתן אפשרות לסטרטיפיקציה אובייקטיבית של תתי-סוגי נוירונים המבוססת על מורפולוגיה.
- השפעה על הפורטפוליו: מקל על תעדוף מטרות מותאם-סיכון על בסיס נאמנות מבנית של מודלים דנדריטיים במערכות הרלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית, רישום תמונות תלת-ממדיות וניתוח מורפולוגיה נוירונלית.
- תלוי בעדשות עם NA גבוה, גלאי GaAsP ופלטפורמות חישוביות התומכות ב-MIPAV ובמעקב מבוסס MATLAB.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית לצורך פרוטוקולי צביעה, הבהרה ודימות עקביים בין המעבדות.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש שינוי של מסגרות הייחוס והגדרות השכבות.
- מגבלות מעשיות כוללות אובדן אות ברקמות עמוקות ורגישות לתזוזת הדגימה במהלך רכישת תמונות במבט כפול (dual-view).
