השימוש β-lactamase מבוססי ביוסנסור Conductimetric Assay לזהות אינטראקציות למערכות ביולוגיות

המטרה הכוללת של בדיקת חיישנים ביולוגיים מוליכים זו היא לזהות אינטראקציות ביו-מולקולריות, באמצעות טכנולוגיית בטא-לקטמאז ההיברידית. אנו מתארים שיטה לאיתור אינטראקציות אנטיגן נוגדנים, באמצעות חלבון בטא-לקטמז כימרי. העיקרון של שיטה זו מסתמך על איתור קשירה על ידי מדידת שחרור הפרוטונים של פעילות הבטא-לקטמאז.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני חיישנים חיסוניים קונבנציונליים הוא השימוש בבטא-לקטמאז כימרי, הופך בדיקות חושיות זולות ומהירות יותר על ידי שימוש בחלבון היברידי לזיהוי האנליטים. התחל הליך זה עם דגימת חלבון והכנת תמיסה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הכן את האלקטרודה הרב-פעמית על ידי טבילת הקצוות בבארות של צלחת של 96 בארות המכילה 300 מיקרוליטר לבאר של תמיסת הכנת אלקטרודה למשך שתי דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר.

חזור על שלב זה שלוש פעמים. לאחר מכן, שטפו את האלקטרודות על ידי טבילת הקצוות בבארות של צלחת של 96 בארות המכילה 300 מיקרוליטר לבאר מים מזוקקים למשך שתי דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר. כדי לחדש את האלקטרודות, טבלו את הקצוות בבארות של צלחת של 96 בארות המכילה 300 מיקרוליטר לבאר של תמיסת התחדשות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס או שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, בצע שלוש שטיפות של האלקטרודות על ידי טבילת הקצוות לבארות של צלחת 96 בארות המכילות 300 מיקרוליטר לבאר של מי מלח עם חוצץ פוספט. יש לבצע כל שטיפה במשך שתי דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר. מצפים ליזוזים חלבון תרנגולת-ביצת תרנגולת על פני הפוליאנילין של האלקטרודה על ידי הנחת טיפה של 15 מיקרוליטר של 40 מיקרוגרם למיליליטר של HEWL שהוכן במאגר פוספט על פני האלקטרודה.

דגרו את האלקטרודה שעה אחת בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצע שלוש שטיפות של האלקטרודות עם מאגר פוספט על ידי טבילת חלקי האלקטרודות של שבבי החיישן לבאר של צלחת של 96 בארות המכילה 300 מיקרוליטר לבאר של מאגר פוספט. יש לבצע כל שטיפה במשך שתי דקות עם ערבוב עדין בטמפרטורת החדר.

הרווי את האלקטרודות על ידי הוספת טיפה של 30 מיקרוליטר של תמיסת החסימה על פני האלקטרודה. דגירה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לשטוף שלוש פעמים כמו קודם.

יש לדלל את תמיסות BlaP-cAb-Lys3 או BlaP ל-20 מיקרוגרם למיליליטר במאגר קשירה. לאחר מכן, מרחו טיפה של 15 מיקרוליטר מהתמיסה המדוללת הזו על האלקטרודות. דגרו על האלקטרודות למשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר תגובת הננו-גוף של האנטיגן, יש לשטוף את האלקטרודות שלוש פעמים בתמיסת כביסה. לאחר מכן, שטפו את האלקטרודות של החיישן במאגר הזיהוי על ידי טבילת האלקטרודות לבאר של צלחת של 96 בארות המכילה 300 מיקרוליטר לבאר של מאגר גילוי. ודגירה קצרה למשך דקה.

לצורך זיהוי, חבר את המולטימטר הדיגיטלי למחשב. לאחר מכן, חבר את שבב החיישן למולטימטר הדיגיטלי באמצעות חלק מעגל הנחושת. התחל את תגובת החיישן על ידי מריחת טיפה של 50 מיקרוליטר של תמיסת בנזיל פניצילין של ארבעה מילי-מולרית על האלקטרודות המסומנות חיובית.

מרחו טיפה של 50 מיקרוליטר של תמיסת הזיהוי על האלקטרודות המסומנות בשליליות כדי לשמש כבקרה השלילית. עקוב אחר ערכי המוליכות בעזרת המולטימטר הדיגיטלי המחובר למשך 30 דקות. הצג את הנתונים באופן חזותי בזמן אמת ישירות על המסך, או ייצא את הנתונים הדיגיטליים כקובץ טקסט.

ניתן לשרטט נתונים גולמיים אלה על מנת ליצור פלט גרפי המייצג את המדידות של שינויי המוליכות בין הייחוס לאלקטרודות הדגימה כנגד הזמן. כדי לבנות את החלבון הכימרי, בטא-לקטמאז BlaP מסוג A שימש כחלבון הנשא. כאן, השאריות הקטליטיות מוצגות באדום.

אתר ההחדרה הממוקם בלולאה חשופה לממס מסומן בצהוב. מקטע הנוגדן של הגמל בשם cAb-Lys3 הוכנס ל-BlaP. החלבון הכימרי המתקבל, BlaP-cAb-Lyse3, מסוגל לקשור HEWL בזמן שפעילות הבטא-לקטמאז נשמרת.

HEWL היה משותק על אלקטרודה מקודדת פוליאנילין לפני טעינת BlaP-cAb-Lys3. שחרור פרוטונים על הידרוליזה של בנזיל פניצילין על ידי החלבון הכימרי המשותק גורם לשינויי מוליכות שיכולים להתפרש על ידי המשתמש. החיישנים מכילים שמונה שבבים המאורגנים כארבעה זוגות.

כל שבב כולל שלוש אלקטרודות, אלקטרודה אחת מצופה פוליאנילין, אלקטרודת ייחוס אחת ואלקטרודה נגדית אחת. עבור כל זוג, השבב המסומן שלילי מתאים לבקרה שלילית, ואילו השבב המסומן כחיובי מתאים לדגימה שנבדקה. מוצגות כאן מדידות מוליכות המציגות את האינטראקציה הספציפית של BlaP-cAb-Lys3 ל-HEWL.

שינויי המוליכות נובעים משחרור הפרוטונים המושרה על ידי הידרוליזה אנטיביוטית על ידי בטא-לקטמאז הכימרי המשותק. לא ניתן היה לזהות קשר לבקרה שלילית, בטא-לקטמאז BlaP המקורי. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 1/2 ביום אם היא מבוצעת כראוי ותנאי הניסוי מותאמים.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהחדרת מקטע נוגדן ל-BlaP היא מאתגרת. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות הנתונים שנוצרו תהיה תלויה בפונקציונליות של הבטא-לקטמאז הכימרי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות המאפשרות לכמת את האינטראקציה שזוהתה על מנת לקבוע את קבוע שיווי המשקל של אינטראקציה זו.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום החיישנים הביולוגיים החיסוניים לחקור אינטראקציות מולקולריות בדגימות שונות, החל מאורגניזמים חיים ועד לסביבות שונות. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות לקראת זיהוי של ביומולקולות רבות מכיוון שטכנולוגיית הבטא-לקטמז הכימרית היא כלי רב-תכליתי לתפקוד כל נוגדן או מקטע חלבון ברשת החשמל. לכן, ניתן להשתמש בו לפיתוח כלי אבחון זולים ומהירים בתחומים רבים, כגון בריאות האדם ובעלי החיים.