פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לזהות אפיטופ ליניארי של תא B המוכר על ידי נוגדן מונוקלונלי, באמצעות חלבונים רקומביננטיים קטועים בסדרה וסריקת פפטידים באמצעות היברידיזציית dot-blot. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לאינטראקציה המולקולרית בין האנטיגן לבין הנוגדן. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הפשטות והיעילות שלה.

ניתן להשתמש לאחר מכן באפיטופ המזהה במחקרי המשך מקיפים יותר, כגון ביישומים טיפוליים ואבחנתיים. את הפרוצדורה תדגים Chien-Wen Chen, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, גדלו תאי היברידומה מונוקלונליים של עכבר מסוג RGM56 במצע היברידי נטול סרום.

יש לתחזק את תרביות התאים בבקבוקי T של 175 בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר חמישה ימי דגירה, יש לאסוף את מצע התרבית לאחר שהפך לצהוב ולסובב את העילוי בצנטריפוגה ב-4,500 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, יש להשליך את משקע פסולת התאים כדי לקבל את הנוגדן בתמיסה.

בשלב הבא, הוסף שני מיליליטר של 50% protein G agro slurry לעמודה של חמישה מיליליטר והשג את שיווי המשקל של הסף (resin) באמצעות 10 מיליליטר של PBS קר מאוד, שווה ל-10 נפחים של סף טעון מראש. טען 200 מיליליטר של תמיסת הנוגדנים שהוכנה קודם לכן על העמודה שנמצאת בשיווי משקל והסר את הפракציה שעוברת דרך העמודה. שטוף את העמודה פעמיים באמצעות 10 מיליליטר של PBS קר מאוד.

לבסוף, כדי לשחרר את הנוגדן מהשרף, הוסף לעמודה 10 milliliters של תמיסת גליצרין מילימולרית ב-pH 2.7. אסוף פראקציות של 900 microliter לשפופרות מיקרוצנטריפוגה שמולאו מראש ב-100 microliters של בופר ניטרול 10X. אחסן את הנוגדן המופרש בתמיסת 50% glycerol בתוספת סודיום אזיד בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius.

הכינו את הקונסטרוקטים והעבירו אותם לתאי E.coli BL21 כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, העבירו מושבה בודדת לשפור של 15 מיליליטר המכיל שלושה מיליליטר של מצע LB מועשר ב-100 micrograms per milliliter ampicillin, וסגרו את הפקק של השפור באופן רפוי. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם ניעור של 150 RPM.

עקבו אחר הצפיפות האופטית של התרבית ב-600 ננומטר. כאשר היא מגיעה לכ-0.6, קררו את התרבית ל-25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו IPTG בריכוז סופי של 0.4 מילימולר כדי להשרות את ביטוי החלבון הרקומביננטי.

דגרו את התרבית למשך ארבע שעות נוספות ב-25 °C עם ניעור ב-200 RPM. לאחר הדגירה, העבירו מיליליטר אחד של תרבית החיידקים למבחנת מיקרוצנטריפוגה. צנטריפוגו את התאים ב-12,000 ×g למשך דקה אחת והשליכו את הנוזל העליון (supernatant).

בצעו שאיבה ופליטה (pipetting up and down) באמצעות מיקרופיפט, כדי לתלות מחדש את משקע התאים ב-100 microliters של denaturation buffer. ערבבו את התוצאה באמצעות vortexing נמרץ כדי לקבל דגימת חלבון רקומביננטי מוכנה לשימוש. כדי להמשיך בהיברידיזציה בשיטת dot-blot, המסו כל פפטיד סינתטי ב-DMSO כדי לקבל תמיסות בריכוז של 10 milligram per milliliter.

לאחר מכן, הפעילו את ממבצת ה-PVDF במתנול למשך שתי דקות והשרו אותה בבופר Towbin משופר למשך שתי דקות נוספות. שטפו פיסת נייר כרומטוגרפיה בבופר Towbin משופר והניחו עליה את ממבצת ה-PVDF המושרית. המתינו עד שהבופר ייעלם מפני השטח של הממבצת.

באמצעות טיפ של 10 µL, הוסיפו 2 µL מכל דגימת פפטיד או חלבון רקומביננטי על גבי הממברנה והניחו לה להתייבש באוויר במשך 10 דקות. הנחת הנקודות על הממברנה היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. טעינת כמות מדויקת של דגימה על שטח קטן של ממברנת PVDF דורשת תשומת לב קפדנית.

בשלב הבא, חסמו את הממברנה בבופר TBST המועשר ב-5%nonfat milk למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תוך끔 ניעור עדין. דללו את הנוגדן המונוקלונלי RGM56 בבופר TBST המועשר ב-5%nonfat milk. והוסיפו את תמיסת הנוגדנים לממברנה.

דגרו את הממברנה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת עם ניעור עדין. לאחר הדגירה, הסירו את תמיסת הנוגדנים. שטפו את הממברנה פעמיים בבופר TBST למשך חמש דקות עם ניעור עדין.

לאחר מכן, הוסף לממברנה את תמיסת הנוגדן המשני המדולל בבופר TBST עם 5% חלב דל שומן. הדגר את הממברנה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 degrees Celsius תוך써 ניעור עדין. עם סיום ההדגרה, השלך את תמיסת הנוגדן ושטוף את הממברנה בבופר TBST פעמיים למשך חמש דקות תוך ניעור עדין.

לאחר מכן, פתחו את הממברנה באמצעות תמיסת הסובסטרט בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בחושך. כאשר מופיע האות, עצרו את התגובה על ידי שטיפת הממברנה במים מזוקקים פעמיים. לאחר ייבוש הממברנה באוויר, צלמו את תמונת ה-dot-blot באמצעות מערכת דימוי.

לבסוף, באמצעות תוכנה לניתוח תמונות, מדדו את העוצמה של כל dot-blot. מוצג כאן חלבון הקוד של נגיף הנמק העצבי (nervous necrosis virus) באורכו המלא, הכולל את חומצות האמינו 1 עד 338, יחד עם וריאנטים קטועים שלו באופן סדרתי. כדי לאשר את ביטוי החלבונים בתאי החיידקים המותמרים, בוצע ניתוח dot-blot באמצעות נוגדן anti-6XHis, אשר הראה את נוכחותם של כל החלבונים הנבדקים.

לאחר מכן, החלבונים הרקומיננטיים נותחו באמצעות היברידיזציה של dot-blot, שבה נעשה שימוש בנוגדן המונוקלונלי RG-M56. הניתוח העלה כי האפיטופ החלבוני שזוהה על ידי הנוגדן נמצא בפפטיד 195 עד 338. לבסוף, אפיטופ המורכב מ-20 או שמונה שאריות חומצות אמינו זוהה באמצעות סריקת פפטידים.

סריקת אלנין הראתה כי החלפות של שאריות ואלין בעמדות 197 ו-199, כמו גם ציסטין בעמדה 201, ביטלו את יכולת הקישור של האפיטופ ואת ההיברידיזציה ב-dot-blot. באופן דומה, נצפתה ירידה באפיניות הקישור בניתוח עוצמת הקישור, מה שמאשר כי השאריות שזוהו חיוניות לקישור של האפיטופ לנוגדן המונוקלונלי RGM56. ניתן להשתמש בטכניקה זו לזיהוי פפטידים כדי לפתח תרופות פפטידיות טיפוליות.