Name: פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: למדו לזהות אפיטופ B-cell לינארי המוכר על ידי נוגדן חד-שבטי באמצעות סריקת פפטידים ו-dot-blot hybridization. שיטה זו פשוטה ויעילה ליישומים תרפואיים ואבחוניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים לגברת צ'ינג-צ'ון לין ולגברת דיאנה לין ממתקן הליבה של המכון לביולוגיה תאית ואורגניזמית (ICOB) של האקדמיה סיניקה על שהציעו את המומחיות שלהם בסינתזה של פפטידים וריצוף DNA, בהתאמה. מחקר זה נתמך על ידי האקדמיה סיניקה.

1. הכנה חד שבטי הנוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים hybridoma חד שבטיים העכבר RG-M56 2 במדיום סרום ללא צלוחיות 175T ב 37 ºC עם 5% CO 2 תוספת. איסוף supernatant כאשר הצבע של המדיום הופך צהוב לאחר חמישה ימים של דגירה. הערה: תאי Hybridoma היו בתרבית בינונית סרום ללא כדי למנוע זיהום נוגדנים בסרום שור עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant ב 4,500 XG במשך 30 דקות ב 4 ºC וזורקים את הכדור פסול תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של agarose חלבון G (כפי שסופק slurry 50%) לעמודה 5 מ&quot;ל ו לאזן עם 10 כרכים שרף (10 מ&quot;ל) של PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 200 מ&quot;ל של supernatant נוגדן (שלב 1.2) על הטור וזורקים את התמסורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של PBS קר כקרח לעמודה לשטוף אותו. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של 50 מ&quot;מ גליצין, pH 2.7 לעמודה כדי elute החלבון G הקשורים נוגדנים. Collect 900 שברים μL בצינור microcentrifuge המכיל 100 μL של 10x חיץ נטרול (1 M טריס, 1.5 M NaCl, ו 1 mM EDTA, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הנוגדן המטוהר גליצרול 50% עם 0.03% NaN 3 ב -20 ºC. </li></ol> 2. בינוי ביטוי של חלבוני סדרה קטועים רקומביננטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת התגובה PCR: 5 μL של 10x חיץ Pfu, 0.2 מ&quot;מ של כל dNTP, 0.2 פריימר 3 מיקרומטר קדימה, 0.2 מיקרומטר פריימר 3 הפוכה, 2 מ&quot;מ MgSO 4, 1 ננוגרם של DNA pET20b-1A59 3 פלסמיד, ו -2.5 U ( היחידה) של DNA פולימרז Pfu; להוסיף DDH 2 O לנפח סופי של 50 μL. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות לרוץ בתוך Cycler תרמית אוטומטית באמצעות הפרמטרים הבאים: מחזור 1 (94 ºC למשך 5 דקות); מחזורים 2-36 (94 ºC למשך 30 שניות, 63 ºC למשך 30 שניות, ו -72 ºC עבור 60 s); מחזור 37 (72 ºC עבור 7 דקות). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מוצרים באמצעות ערכת 5 טיהור PCR כדי להקל על עיכול אנזים ההגבלה הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את שברי DNA PCR מוגבר עם חס&quot;ם אני אנזימי הגבלה Xho שאני ולקשור כל קטעי דנ&quot;א אלה לתוך חס&quot;ם לי ואני Xho-ביקע אנזים PET-20b (+) וקטור. להפוך את המבנים לתאי coli Escherichia DH-5α מוסמך 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת העיכול חיץ העיכול (20 מ&quot;מ טריס-אצטט, 10 Mg מ&quot;מ (COO CH 3) 2, 50 מ&quot;מ KCH 3 COO, ו 1 מ&quot;מ DTT, pH 7.9) עם 1 מיקרוגרם של ה- DNA PCR מוגבר או PET-20b (+) וקטור DNA, ו -2 U של חס&quot;ם אני הגבלה Xho שאני אנזימים בנפח סופי של 20 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התערובת העיכול בעדינות ובמהירות ספין למטה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ח באמבט יבש כדי להבטיח את החיתוך המלא של ההגבלה לשבתes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את שברי DNA אנזים מתעכל הגבלה באמצעות ערכת 5 טיהור PCR כדי להקל על הבנייה פלסמיד הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת קשירת במאגר קשירת (66 מ&quot;מ טריס, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 1 mM ATP, ו -5 מ&quot;מ DTT, pH 7.5) עם 100 ננוגרם של DNA predigested, PCR מוגבר, 10 ng של PET-20b מעוכל מראש (+) DNA וקטור, ו -5 U של T4 האנזים דנ&quot;א בנפח סופי של 10 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת קשירת בעדינות ובמהירות ספין למטה. לדגור על 16 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות בתוך אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 10 μL של דגימות קשירת לתוך 100 μL של תאים DH-5α המוסמכת ומערבבים בעדינות לפני הנחת צינור microcentrifuge על קרח למשך 30 דקות. שים את הצינור microcentrifuge באמבט יבש ב -42 ºC למשך 90 שניות כדי לגרום חום הלם 7. מיד להעביר את הצינור על קרח במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μL של לוריא- Bertani (LB) מרק (1% Bacto tryptone, 0.5% Bacto שמרים extract, ו -0.5% NaCl, pH 7.0) אל הצינור. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 150 סל&quot;ד רעדו במשך 45 דקות. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 x ז במשך 10 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם 50 μL של מרק LB ומרחו על כל שינוי לצלחות מחומם מראש LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. דגירת הצלחות ב 37 ºC עבור 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי מושבה אחת באמצעות טיפ 200 μL ומניחים אותו לתוך 3 מ&quot;ל של מרק LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל כתרים רופף. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 150 סל&quot;ד רעדו במשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את ה- DNA פלסמיד 8 מכל תרבות ורצף אותו באמצעות האמרגן T7 ו פריימרים terminator T7 כדי לאשר את רצף 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אישור רצף, להפוך 10 ng של DNA מ PET-20b אלה (+) פלסמידים עם משתנים אורכי של הגן חלבון מעיל YGNNV לתוך BL-21 (DE3) זן של החיידק על ידינוing השיטה-הלם החום 7. בצע את השלבים 2.3.6-2.3.8 לבצע את השינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מושבה אחת מכל החיידק טרנספורמציה תא BL-21 ל 3 מ&quot;ל של מרק LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ב 15 צינור מ&quot;ל כתרים רופף. דגירת התרבות ב 37 ºC עם 150 סל&quot;ד רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את התרבות ל -25 ºC כאשר OD 600 של התרבות הוא כ 0.6 ולהוסיף IPTG לריכוז סופי של 0.4 מ&quot;מ כדי להשרות את הביטוי של חלבון רקומביננטי. דגירת ההתרבות עבור ג 4 תוספת של 25 ºC עם 200 סל&quot;ד רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1 מ&quot;ל של תרבות לתוך צינור microcentrifuge. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 1 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 100 μL של חיץ denaturation (8 אוריאה M, סודיום פוספט 20 מ&quot;מ, ו 0.5 M NaCl, pH 7.4) על ידי pipetting למעלה ולמטה עם micropipette. מערבבים על ידי vortexing נמרץ. הערה: סול המדגםutions צריך להיות עכשיו שקוף למחצה, קצת דביק, ומוכן עבור assay כלת dot-הכתם. </li></ol> 3. עיצוב וסינתזה של פפטידים חופפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב וסינתזה 3 פפטידים סדרתי 20-mer שכל חפיפה עם מחליפו ב -10 שאריות aa מאזור 195-338 aa של חלבון מעיל YGNNV כדי לצמצם את האזור אפיטופ של מב RG-M56 ידי סופג נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב וסינתזה 3 שלושה פפטידים 8-mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204, ו -199 VLCRWSVR 206) עם חפיפה של 6 שאריות aa על פפטיד סינתטי הבא כדי לצמצם את האזור אפיטופ של 195-206 aa על ידי סופג נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב וסינתזה 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 ו 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, ו 197 VSVLCR 202), ו -5 mer פפטידים (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, ו 198 SVLCR 202) עם חפיפה של 6, 5, ו -4 שאריות aa, בהתאמה, על פפטידים השכנות שלהם כדי למזער את באזור epitope על ידי סופג נקודה. </li></ol> כלת Dot-כתם 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים פפטיד מסונתז sulfoxide דימתיל (DMSO) לריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הערה: כדי להתגבר על מסיסות מגוונת של פפטידים סינתטיים, כל פפטידים סינתטיים צריך להיות מומס DMSO. DMSO הוא ממיס טוב לפזר פפטידים הידרופובי או הידרופילי לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום עם מתנול למשך 2 דקות. הערה: קרום PVDF הוא עד 100% עמידים בפני DMSO; אחרים עשויים שלא להיות כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הממברנה PVDF עם חיץ-טובין שונה (25 מ&quot;מ טריס, 192 מ&quot;מ גליצין, ו -0.1% SDS, pH 8.3) עבור2 דקות. הערה: 10-20% (v / v) של מתנול ניתן להוסיף למאגר טובין שונה כדי לשפר את תוצאות ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פיסת נייר כרומטוגרפיה עם חיץ-טובין שונה. מניחים את קרום PVDF לנייר כרומטוגרפיה. המתן עד חיץ-טובין שונה נעלם מפני השטח קרום PVDF לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של כל דגימה פפטיד הממברנה עם טיפ 10 μL. אוויר יבש הממברנה PVDF על נייר כרומטוגרפיה במשך 10 דקות. להוסיף כל דגימה פפטיד לאט ובהדרגה על הממברנה כדי למנוע דיפוזיה יותר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה במאגר TBST (0.05% (v / v) Tween-20, 20 מ&quot;מ טריס, ו -150 מ&quot;מ NaCl, pH 7.4) עם חלב ללא שומן 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מב RG-M56 בדילול סופי של 1: 1,000 במאגר TBST עם חלב ללא שומן 5% עד הממברנה. דגירה הממברנה ב 37 ºC עבור H 1 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן כךlution. לשטוף את הממברנה במאגר TBST במשך 5 דקות עם רעד עדין. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נוגדנים משני (עז נגד העכבר IgG, Fc, phosphatase אלקליין מצומדות) בדילול סופי של 1: 5,000 במאגר TBST עם חלב ללא שומן 5% עד הממברנה. דגירה הממברנה ב 37 ºC עבור H 1 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את פתרון הנוגדן. לשטוף את הממברנה במאגר TBST במשך 5 דקות עם רעד עדין. חזור על השלב לשטוף פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את הממברנה עם פתרון המצע BCIP / NBT בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בחושך. עצור את הפיתוח על ידי שטיפת הממברנה עם DDH 2 O כאשר האות מופיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש הממברנה ללכוד את תמונת dot-הכתם באמצעות מערכת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את העוצמה של כל כתם נקודה באמצעות ניתוח תמונה תוכנה 3. </li></ol> סריקת אלנין 5. חילוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב לסנתז 3 אלאנין ו methiפפטידים החלפה onine. החלף כל שאריות aa עם אלאנין לייצור הפפטיד 8-mer 195 VNVSVLCR 202 לסנתז פפטידים 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202, ו -195 VNVSVLCA 202 . החלף aa שאריות לאוצין 200 עד מתיונין ליצור הפפטיד epitope גנוטיפ SJNNV 195 VNVSVMCR 202. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב סעיף 4 כדי לבצע סריקת אלאנין ו mutagenesis החלפת dot סופגים. </li></ol>

<ol><li>Milstein, C., Kohler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+variations+of+myelomatous+cells+%28proceedings%29%5BTitle%5D)+AND+%22Minerva+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal variations of myelomatous cells (proceedings).</a> Minerva Med. 68 (50), 3453(1977).</li>
<li>Lai, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2761.2001.00293.x/abstract">In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel).</a> J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).</li>
<li>Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+Linear+B-Cell+Epitope+of+Betanodavirus+Coat+Protein+by+RG-M18+Neutralizing+mAB+Inhibits+Giant+Grouper+Nervous+Necrosis+Virus+%28GGNNV%29+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection.</a> PLoS One. 10 (5), 0126121(2015).</li>
<li>Lai, Y. -S., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2761.2001.00303.x/abstract">Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue.</a> J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).</li>
<li>Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+HLA+typing+designed+for+solid+organ+transplantation%3A+epityping+and+its+application+to+the+HLA-A+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Immunogenet%22%5BJournal%5D)">A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus.</a> Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).</li>
<li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre%2Flox+based+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnol. 11, 24(2011).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Miraprep%3A+A+Protocol+that+Uses+a+Miniprep+Kit+and+Provides+Maxiprep+Yields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields.</a> PLoS One. 11 (8), e0160509(2016).</li>
<li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+in+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies in DNA sequencing.</a> Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).</li>
<li>Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+ayu+%28Plecoglossus+altivelis%29+Pit-1+in+Escherichia+coli%3A+its+purification+and+immunohistochemical+detection+using+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody.</a> Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).</li>
<li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+structures+of+proteins.+Their+determination+has+revealed+important+aspects+of+immune+recognition+and+generated+strategies+for+synthetic+mimicking+of+protein+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites.</a> Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).</li>
<li>Opuni, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+epitope+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric epitope mapping.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li>
<li>Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. <a target="_blank" href="http://library.wur.nl/WebQuery/clc/1931063">The Aquaculture of Groupers</a>. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).</li>
<li>Conti-Tronconi, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-bungarotoxin+and+the+competing+antibody+WF6+interact+with+different+amino+acids+within+the+same+cholinergic+subsite%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite.</a> Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).</li>
<li>Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+antibody+recognition+of+carcinoma-associated+epithelial+mucins%3A+antibody+binding+to+synthetic+peptide+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes.</a> Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).</li>
<li>Chen, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+Structures+of+a+Piscine+Betanodavirus%3A+Mechanisms+of+Capsid+Assembly+and+Viral+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (10), e1005203(2015).</li>
<li>Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+entry+inhibitors+of+enveloped+viruses%3A+The+importance+of+interfacial+hydrophobicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity.</a> Biochim Biophys Acta. , (2014).</li>
<li>Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+putative+cellular+receptor+for+HIV-1+transmembrane+glycoprotein+using+synthetic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides.</a> AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים הקשורים לדו"ח זה.

פרוטוקול זה מציע טכניקה מהירה וישירה לזהות epitope ליניארי מוכר-מב. אם ניקח בחשבון את העלות של סינתזה פפטיד ואת יעילות הייצור של פפטידים וסינתזה, באזור אנטיגני של חלבון מעיל וירוס הופחת על ידי הבעת חלבונים רקומביננטיים קטום סדרתי לפני ניתוח סריקה פפטיד. ככזה, מערכת הביטוי האמינה ויעילה E. coli PET שמשה לייצר באופן סדרתי אלה חלבונים רקומביננטיים הקטומים, חלבונים רקומביננטיים עם משקל מולקולרי בין 10 עד 50 kDa יכול לבוא לידי הביטוי בקלות דרך מערכת זו. בדרך זו, את epitope נית...

במערכת החיסונית, רקומבינציה של V, D, ומגזרי J מאפשרת נוגדנים ליצור מגוון גדול של אזורים בקביעת מידת השלמה (CDRs) לכריכה לאנטיגנים שונים שנועד להגן על המארח מזיהום פתוגניים. הגנת הנטרול של נוגדנים נגד אנטיגנים תלוי ההשלמה מרחבית בין CDRs של נוגדנים ואת אפיטופים של אנטיגנים. לכן, הבנה של אינטראקציה מולקולרית זה תסייע עיצוב חיסון מניעתי ופיתוח תרופות פפטיד טיפולי. עם זאת, אינטראקצית נטרול זה עשוי להיות מושפע הוא על ידי תחומים אנטיגני מרובים אנטיגן אחד ועל ידי מספר CDRs של נוגדנים, אשר כתוצאה מכך להפוך את תהליך קביעת epitope מורכב יותר. למרבה המזל, את הפיתוח של טכנולוגיית hybridoma, ממזגת תאי מייצרי נוגדני פרט עם תאי מיאלומה, מאפשר לאפיית חלוקת זמן של תאים שניים<html> rete אחד נוגדן ספציפי, המכונה נוגדן חד-שבטי (מב) 1. תאי Hybridoma לייצר זיקה גבוהה טהור, אלה מבז להיקשר תחום אנטיגני יחיד של אנטיגן ספציפי. עם היחס של הנוגדן לאנטיגן הוקמה, מספר גישות, כולל סריקה פפטיד, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את epitope של אנטיגן באמצעות מב המתאימה לו. ההתפתחויות האחרונות בתחום הטכנולוגיה פפטיד סינתטי הפכו את טכניקת הסריקה פפטיד נגיש יותר ונוח יותר לבצע. בקצרה, קבוצה של פפטידים סינתטיים חופפים מיוצרים על פי רצף אנטיגן היעד והן קשורות אל קרום מוצק נתמך הכלאה מב. סריקת פפטיד לא רק מציעה דרך פשוטה כדי למפות את הנוגדן מחייב באזור, אלא גם הופכת לפשוט חומצות אמיניות (AA) mutagenesis באמצעות סריקת שאריות או החלפה כדי להעריך את האינטראקציה מחייבת בין כל שאריות aa של הפפטיד epitope ואת CDRs של הנוגדן. = ילדה &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לזיהוי יעיל של epitope ליניארי של הנגיף נמק צהוב לוקוס עצבים (YGNNV) חלבון מעיל באמצעות מב נטרול 2, 3, 4. הפרוטוקול כולל הכנת מב, בניית ביטוי של חלבונים רקומביננטיים קטומים סדרתי, עיצוב פפטיד סינטטי חופף, כלת dot-כתם, סריקת אלאנין, ו mutagenesis חילוף. בהתחשב בעלות הגבוהה של סינתזת פפטיד, הצעד של מקצץ את החלבונים רקומביננטי הסדרה של חלבון מטרה רצויה שונה, ואזור אנטיגני הצטמצם סביב 100 עד 200 שאריות aa לפני ניתוח dot-כתם מערך פפטיד הסינטטי בוצע.

<table><tbody><tr><td>Hybrid-SFM בינוני</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos's Phophate-Buffered Salt (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Pfu DNA פולימראז&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק&nbsp;</td><td>EP0502&nbsp;</td><td>כולל מאגרים</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>כולל מאגרים</td></tr><tr><td>NdeI&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0111S</td><td>כולל חוצצים</td></tr><tr><td>XhoI&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>R0146S</td><td>כולל חוצצים</td></tr><tr><td>pET-20b(+) וקטור</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH-5&alpha; תא מוכשר</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td>E. coli BL-21(DE3) תא מוכשר</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>מרק LB&nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופילתיו-&בטא;-D-תיוגלקטוזיד (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>פוליאוקסיאתילן 20 סורביטן מונולאורט (Tween-20)</td> <td>J.T.Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>אמרסקו</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>אמרסקו</td><td>0241-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>אמרסקו</td><td>0105-1 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>אמרסקו</td><td>0854-1 ליטר</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG, נוגדן שבר Fc</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (פוליווינילידן פלואוריד, PVDF)</td> <td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>חלבון G אגרוז זרימה מהירה</td><td>Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR ערכת טיהור</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP BioSpectrum 600 מערכת תמונה</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>מחזורי האופניים התרמיים של MyCycler</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope b-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

הזיהוי של אפיטופ אנטיגני על ידי המערכת החיסונית מאפשרת הבנה של מנגנון הגנה של נוגדנים מנטרלים שעשויים להקל על פיתוח של חיסונים ותרופות פפטיד. סריקת פפטיד היא שיטה פשוטה ויעילה הממפה את epitope ליניארי המוכר בצורה ישירה על ידי נוגדן חד-שבטי (מב). הנה, המחברים מציגים מתודולוגיה נחישות epitope המעורבת חלבונים רקומביננטיים קטומים סדרתי, עיצוב פפטיד סינטטי, כלת dot-כתם להכרה אנטיגני של חלבון מעייל וירוס עצבים נימקו באמצעות מב נטרול. טכניקה זו מסתמכת על הכלאה dot-כתם של פפטידים סינתטיים מבז על פלואוריד polyvinylidene הממברנה (PVDF). האזור אנטיגני מינימום של חלבון מעיל ויראלי מוכר על ידי מב RG-M56 יכול להיות הצטמצם אחר צעד-אחר-צעד גזוז מיפוי פפטיד גבי epitope פפטיד 6-mer. בנוסף, סריקה אלאנין תת mutagenesis שאריותstitution ניתן לבצע כדי לאפיין את המשמעות המחייבת של כל שאריות חומצת אמינו המרכיבות את epitope. שאריות איגוף באתר epitope נמצאו לשחק תפקידים קריטיים בתקנה קונפורמציה פפטיד. הפפטיד epitope זיהה ניתן להשתמש כדי ליצור גבישים של מתחמי פפטיד-נוגדן epitope עבור מחקר עקיף של קרני רנטגן ותחרות פונקציונלית, או רפוי.

מטרת ניסוי זה הייתה לזהות אפיטופ דרך נקודה סופגת באמצעות מב. כדי במהירות וביעילות לצמצם באזור אנטיגני מוכר על ידי מב, אורך-מלא מקוצץ סדרתי חלבונים מעיל YGNNV רקומביננטי עם תג היתוך 6xHis בבית C- הסופית באו לידי ביטוי מתוך מערכת ביטוי E. coli PET 10 (איור 1 א). החלבונים רקומביננטי וכתוצאה נראו על הממברנה PVDF באמצעות RG-M56 מב ואנטי 6xHis נוגדן עבור הכלאה dot-כתם. סופג נקודה גילה אותות חיוביים נגד 1-...

כאן, המחברים מציגים פרוטוקול פשוט ויעיל להגדרת אפיטופ אנטיגני ליניארי באמצעות נוגדן חד שבטי מטוהר וסריקת פפטידים באמצעות הכלאה של כתמי נקודות. לאחר מכן ניתן להשתמש באפיטופ שזוהה ביישומים טיפוליים ואבחנתיים.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לזהות אפיטופ ליניארי של תא B המוכר על ידי נוגדן מונוקלונלי, באמצעות חלבונים רקומביננטיים קטועים בסדרה וסריקת פפטידים באמצעות היברידיזציית dot-blot. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לאינטראקציה המולקולרית בין האנטיגן לבין הנוגדן. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הפשטות והיעילות שלה.ניתן להשתמש לאחר מכן באפיטופ המזהה במחקרי המשך מקיפים יותר, כגון ביישומים טיפוליים ואבחנתיים. את הפרוצדורה תדגים Chien-Wen Chen, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, גדלו תאי היברידומה מונוקלונליים של עכבר מסוג RGM56 במצע היברידי נטול סרום.יש לתחזק את תרביות התאים בבקבוקי T של 175 בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. לאחר חמישה ימי דגירה, יש לאסוף את מצע התרבית לאחר שהפך לצהוב ולסובב את העילוי בצנטריפוגה ב-4,500 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C. לאחר מכן, יש להשליך את משקע פסולת התאים כדי לקבל את הנוגדן בתמיסה.בשלב הבא, הוסף שני מיליליטר של 50% protein G agro slurry לעמודה של חמישה מיליליטר והשג את שיווי המשקל של הסף (resin) באמצעות 10 מיליליטר של PBS קר מאוד, שווה ל-10 נפחים של סף טעון מראש. טען 200 מיליליטר של תמיסת הנוגדנים שהוכנה קודם לכן על העמודה שנמצאת בשיווי משקל והסר את הפракציה שעוברת דרך העמודה. שטוף את העמודה פעמיים באמצעות 10 מיליליטר

peptide-scanning-assisted-identification-monoclonal-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין...

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

סרטון זה מדגים בדיקה לזיהוי אלונוגדנים HLA נגד תורמים אצל מושתלי איברים. מערך פפטידים מסונתז כדי לייצג אפיטופים פוטנציאליים לדחיית איברים בתיווך נוגדנים. המערך מודגר עם נסיוב הנמען, המכיל אלונוגדנים הנקשרים לאפיטופים של המטרה שלהם. קשירת נוגדנים מזוהה באמצעות כימילומינסנציה כדי לזהות אפיטופים ספציפיים של HLA לתורם המעוררים תגובתיות של אלואנטיבנים.

זיהוי מבוסס פפטיד של אלונוגדנים HLA נגד תורמים אצל מושתלי איברים

סרטון זה מדגים טכניקה המיישמת טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי כדי לאפיין את הספציפיות של נוגדנים המזהים שינויים לאחר תרגום (PTM) על פפטידי היסטון. שקופית מיקרו-מערך המכילה פפטידים מצומדים פלואורופורים משותקים עם שילובי PTM ידועים מטופלת בנוגדנים ספציפיים ל-PTM מטרה. תהליך זה מסייע לזהות את הספציפיות של הנוגדן למטרה ואת התגובתיות הצולבת הפוטנציאלית שלו עם PTM שאינם מטרה.

טכנולוגיית מיקרו-מערך פפטידי לפרופיל ספציפיות של נוגדנים

מבחני ביוכימיים עם מולקולות MHC II רקומביננטי אדם יכולים לספק תובנות מהירים, כמותיים לזיהוי אפיטופ immunogenic, מחיקה, או עיצוב. הנה, assay מחייב פפטיד-MHC השני טיפס לצלחות 384 גם הוא תאר. פורמט חסכוני זה צריך להיות שימושי בתחומי deimmunization חלבון ועיצוב חיסון ופיתוח.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

פרוטוקול זה מתאר את התפתחותם של שני נוגדנים חד-שבטיים מסוג IgG (mAbs) המגיבים חזק למיוגלובין של יונקים ימיים. mAbs אלה מיושמים על רצועת בדיקה אימונוכרומטוגרפית זהב קולואידית המבוססת על פורמט הסנדוויץ' כדי להבדיל בין ה-Mb של יונקים ימיים לבין כלבי ים ובעלי חיים אחרים.

פיתוח של קולואיד זהב מבוסס Immunochromatographic מבחן ברצועה עבור איתור של מיוגלובין cetacean

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning היא טכניקה מוכחת על גילוי של פפטיד זיקה ריאגנטים, אלטרנטיבה איתנה נוגדנים. בשיטת המיון האוטומטי למחצה בזאת יש יעיל biopanning כדי להקטין את המופע של תוצאות חיוביות שגויות. כאן אנו ממחישים את התהליך המחשבתי וטכניקות מתבצעת הערכת המועמדים וצמצום ניתוח במורד הזרם.

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

אי-התאמות לויקוציטים אנושיים רצפים אנטיגן (הלע) בין תורם איברים זוגות הנמענים הם הגורם העיקרי של דחיות בתיווך נוגדנים השתלת איברים. כאן אנו מציגים את השימוש מערכים אנטיגן מותאמות אישית המבוססות על רצפים התורמים הבודדים הלע כדי לחקור התורם אנטי alloantibodies הלע ב עוגב נמענים.

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצה של מולקולות מורכבות 1b histocompatibility הגדולות-קלאסי. חיסון Qa-1-איגוד epitopes הוכח להגדיל ויסות מערכת החיסון רקמות ספציפיות, דהוא במספר מחלות אוטואימוניות. במסמך זה אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד חופפים לצורך זיהוי Qa-1 epitopes של חלבון.

ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון

אנו מתארים שיטה לייצור נוגדנים אנושי ספציפי אנטיגן של עניין, מתחיל מתאי B נדיר במחזור דם אנושי. דור של נוגדנים טבעיים אלה הוא יעיל ומהיר, הנוגדנים שהושג יכול להפלות בין אנטיגנים מאוד קשורות.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

שיטת BSelex כדי לזהות ולשחזר נוגדנים ספציפיים אנטיגן ספציפי של הדם היקפיים היקפי תאים מונמונומנט משלבת הזרימה cy, לנסות עם תא בודד PCR ו שיבוט.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

למדו לזהות אפיטופ B-cell לינארי המוכר על ידי נוגדן חד-שבטי באמצעות סריקת פפטידים ו-dot-blot hybridization. שיטה זו פשוטה ויעילה ליישומים תרפואיים ואבחוניים.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

גלה סרטונים נוספים