באמצעות חיישנים ביולוגיים מבוססי Enzyme למדוד טוניק ו phasic גלוטמט בעכברי מודל אלצהיימר
3 במאי 2017
כאן, אנו מתארים את ההתקנה, תוכנת ניווט, וניתוח נתונים עבור שיטה מרחבית מדויקת ובזמן של מדידת טוניק ושינויי גלוטמט תאי פאזית in vivo באמצעות מערכי microelectrode enzyme-linked (MEA).
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד שינויים בגלוטמט חוץ-תאי טוניק ופאזי in vivo באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודות המקושרים לאנזים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום מדעי המוח, כגון האם רמות נוירוטרנסמיטורים חוץ-תאיים והדינמיקה המהירה של שחרור ופינוי נוירוטרנסמיטורים משתנות במצבי מחלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שמערכי המיקרו-אלקטרודות יכולים למדוד שינויים ספציפיים במוליכים עצביים בתוך אזורי מוח בדידים, מה שהופך אותה לגישה מדויקת מבחינה מרחבית וזמנית תוך היותה זעיר פולשנית.
ידגימו את ההליך הולי הנסברגר וריאן הסלין מהמעבדה שלי. כדי להתחיל בהליך זה, יש לצפות זוג אתרי הקלטה ב-MEA באנזים הרצוי וזוג אחר של אתרי הקלטה במטריצת החלבון הלא פעילה. לאחר מכן, צייר את הגלוטמט אוקסידאז או מטריצת החלבון באמצעות מזרק המילטון של 10 מיקרוליטר.
לחץ בעדינות על הבוכנה כדי להוציא חרוז קטן של תמיסה בקצה המזרק. כדי למקד את אתרי ההקלטה של MEA, תחת מיקרוסקופ מנתח, החל את התמיסה על אתרי ההקלטה המתאימים על ידי יצירת קשר קצר עם אתרי ההקלטה עם טיפת התמיסה, המייצגת שכבה אחת. הגדר טיימר לדקה אחת בין יישומי ציפוי לאתרי ההקלטה.
כעת, הנח את אלקטרודת הייחוס דרך הפתח בזרוע הפלסטיק. הורד את אלקטרודת הייחוס לכוס המכילה PBS וודא שהיא לא תיגע בתחתית הכוס. לאחר מכן, חבר את אלקטרודת הייחוס ל-head stage וחבר את ה-MEA ל-mPD המצופה ל-head stage.
הורד את ה-MEA לכוס התמיסה כך שרק קצה ה-MEA שקוע בתמיסה. אין לטבול את קצה ה-MEA בנוזל מעבר לבועה השחורה. פעולה זו עלולה לפגוע ב-MEA.
לאחר מכן, בחר בסמל הציפוי בשולחן העבודה. בתפריט כלי הציפוי, ודא שההגדרות הנכונות הוזנו. לאחר מכן, בחר תוכנת יציאה כדי לסיים את הציפוי.
שטפו את קצות האלקטרודות המצופות mPD במי DI ואחסנו למשך 24 שעות לפני הכיול. בהליך זה, הפעל כרית חימום ב-37 מעלות צלזיוס וחבר את ראש ה-stage למערכת בקרת ההקלטה. לאחר מכן, הכנס את קצה ה-MEA ל-40 מיליליטר של PBS מודולרי מעורבב.
לאחר מכן, חבר את אלקטרודת הייחוס לשלב הראש. החלק את קצה אלקטרודת הייחוס כדי לוודא שאין בועות אוויר. לאחר מכן, פתח את תוכנית ההקלטה, ודא שההגדרות נכונות, בחר את מספר ה-MEA ולחץ על כיול ולחץ על התחל.
אפשר חמש עד 10 דקות לשיווי משקל והתחל בכיול לאחר שקו הבסיס התייצב. לאחר מכן, בחר Baseline והוסף 500 מיקרוליטר של חומצה אסקורבית. לאחר מכן, בחר מפריע לאחר שהזרם הגיע לרמה יציבה חדשה.
אם ה-MEA מצופה כראוי, אין להבחין בשינוי. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר של 20 מילי-מולרי L-גלוטמט. ברגע שהזרם הגיע לרמה יציבה חדשה, סמן את התוספת הראשונה כאנליט.
חזרו על הפעולה שלוש פעמים עד לשלוש תוספות גלוטמט. לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר דופמין. ובחר חומר בדיקה.
לאחר מכן, הוסף 40 מיקרוליטר מי חמצן. בחר Test Substance ולחץ על לחצן העצירה לאחר סיום הכיול. בשלב זה, מקם את המיקרופיפטה במרכז בין כל ארבעת אתרי הקלטת הפלטינה והרכיב אותה 50 עד 100 מיקרומטר מעל המזרח התיכון באמצעות שעווה דביקה וחימר דוגמנות.
בעזרת מתאם DC, clamp את החוט החיובי האדום לחוט הכסף המוכן בצד סיכת הזהב, ו-clamp החוט השלילי השחור לקתודה של אמבט הפלטינה. לאחר מכן, חבר את מתאם ה-DC וחפש את תהליך הציפוי הנכון. בועות צריכות להופיע באלקטרודת האמבטיה, ואלקטרודת הייחוס צריכה להפוך לצבע אפור כסוף.
בהליך זה, הנח את החיה במכשיר הסטריאוטקסי והשתמש בסרגלי האוזניים כדי לייצב את ראשה. ודא שהחיה מאובטחת והראש אינו זז. לאחר מכן, מרחו משחת עיניים באמצעות מוליך כותנה סטרילי.
לאחר מכן, יש לגלח את הראש בעזרת גוזם. והסר את הפרווה ליד האוזניים בעזרת מספריים כירורגיות קטנות. לאחר מכן, מרחו יוד ולאחר מכן אלכוהול על הקרקפת שלוש פעמים לסירוגין.
לאחר מכן, בצע חתך באמצע הקרקפת ופזר את העור. ספגו כל דם עם קצה כותנה סטרילי ומרחו מי חמצן כדי להקל על הופעת ברגמה ולמבדה. ודא שהראש ממוקם כראוי על ידי מדידת הגב-גחון והמדיאלי-לטרלי של ברגמה ולמבדה.
הגדר את הקואורדינטות בברגמה לאפס וסמן את קואורדינטות היעד. לאחר מכן, קדחו סביב הסימן. לאחר מכן, חבר את ה-MEA לשלב הראש.
מלאו את הפיפטה בחזרה בתמיסה הרצויה הראשונה. הקפידו להשאיר פער בפיפטה ללא תמיסה כדי שניתן יהיה לבחון את התמיסה שנפלטת. לאחר מכן, חבר את הצינור למיקרופיפטת הזכוכית.
מצא ברגמה עם ה-MEA מצורף והגדר את הקואורדינטות לאפס. הזיזו את ה-MEA לקואורדינטות הרצויות והורידו לאט את ה-MEA עד שהקצה נוגע במוח. לאחר מכן, אפס את הקואורדינטה הגבית-גחונית ואז הורד לאט את ה-MEA לתוך המוח.
מקם את אלקטרודת הייחוס במיקום מרוחק מה-MEA כך שהיא עדיין במגע נוזלי עם המוח כדי להשלים את המעגל. בתוכנית ההקלטה, לחץ על האלקטרודה המכוילת הרצויה ולאחר מכן לחץ על בצע ניסוי כדי להתחיל בהקלטה. לאחר השגת קו בסיס יציב, הגדר את מפלט הלחץ ל-0.6 שניות ו-0.5 psi ולחץ על הכפתור האדום במפלט הלחץ כדי להוציא
.רשום את הזמן והלחץ כמו גם את תקתוקי הנפח שהועברו על גיליון ההזרקה ורשום הערות במידת הצורך. לאחר מכן, הסר את ה-MEA כשהמיקרו-פיפטה מחוברת, שטוף אותו במי DI והשרו אותו ב-PBS למשך הלילה עד שכל הדם נעלם. באזורי CA3 ו-CA1 של ההיפוקמפוס, רמות הגלוטמט הטוניק עלו באופן משמעותי בעכברי TauP301L שטופלו ברכב, השפעה שהוחלשה על ידי טיפול ברילוזול.
כאן, ההקלטות המייצגות התואמות של אשלגן כלורי שעוררו שחרור גלוטמט ב-CA3 הראו שטיפול ברילוזול החליש את העלייה המשמעותית במשרעת שחרור הגלוטמט שנצפתה בעכברי Vehicle-TauP301L. יישום מקומי של אשלגן כלורי הביא לעלייה חזקה בגלוטמט חוץ-תאי שחזר במהירות לרמות טוניק. העלייה המשמעותית באשלגן כלורי עוררה שחרור גלוטמט ב-DG, CA3 ו-CA1 שנצפה בעכברי TauP301L שטופלו ברכב לאחר יישום מקומי של אשלגן כלורי מוחלש עם טיפול ברילוזול.
קטע זה של ההיפוקמפוס המוכתם בסגול קרסיל מאשר את מיקומם של מסלולי MEA ב-CA3 ו-CA1. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור את שלבי פתרון הבעיות המפורטים בכתב היד. לדוגמה, כדי להפחית אותות רועשים, זכור לקרקע את המערכת ולבצע את השלבים בזמן.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוטוקול למדידת שינויים טוניים ופאזיים של גלוטמט חוץ-תאי in vivo באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרודות (MEAs) מקושרים לאנזימים. השיטה מאפשרת זיהוי מדויק מרחבית וזמנית של דינמיקה של מוליכים עצביים באזורי מוח מובחנים, עם התמקדות בשיבושים בהיפוקמפוס במודל עכבר טרנסגני של מחלת אלצהיימר. הגישה היא זעיר-פולשנית ומאפשרת ניטור בזמן אמת של שינויים בגלוטמט הרלוונטיים לפתולוגיה של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- נוירוכימיה
- חישוש אלקטרוכימי
רקע
- הפרעה במוליכים עצביים מעורבת במחלות של מערכת העצבים המרכזית (CNS) כגון אלצהיימר, פרקינסון, דיכאון וחרדה.
- מיקרודיאליזה מסורתית היא פולשנית וחסרה דיוק זמני ומרחבי.
- מערכי מיקרו-אלקטרודות (MEAs) מציעים מדידה בזמן אמת, עם פולשנות מינימלית, של שינויים במוליכים עצביים באזורים ספציפיים במוח.
- חוסר ויסות של גלוטמט קשור לפתולוגיה של מחלת אלצהיימר.
מטרת המחקר
- להערכת הדינמיקה של גלוטמט חוץ-תאי בהיפוקמפוס של מודל עכבר טרנסגני למחלת אלצהיימר.
- להערכת ההשפעות של טיפול ברילוזול (riluzole) על רמות הגלוטמט ושחרורו בתתי-אזורים ספציפיים של ההיפוקמפוס.
- להדגמת היתרונות של טכנולוגיית MEA למדידת מוליכים עצביים in vivo.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ציפוי אתרי ההקלטה של ה-MEA באנזים סלקטיבי לגלוטמט ובמטריצת חלבון לא פעילה עבור ייחוס עצמי.
- אלקטרוליזה וכיול של MEAs באמצעות תמיסות סטנדרטיות (חומצה אסקורבית, גלוטמט, דופמין, פרוקסיד).
- ניתוח סטריאוטקסי למטרת התמקדות בתתי-אזורים של ההיפוקמפוס (DG, CA1, CA3) בעכברי rTg(TauP301L)4510 תחת הרדמה.
- הקלטה in vivo של רמות גלוטמט ושחרור מעורר לאחר יישום מקומי של פוטשיום כלוריד.
תוצאות עיקריות
- רמות גלוטמט טוניות היו גבוהות באופן משמעותי באזורי ה-CA3 וה-CA1 של עכברי TauP301L שקיבלו vehicle.
- טיפול ברילוזול (Riluzole) הפחית את רמות הגלוטמט הטוניות המוגברות באזורים אלו.
- שחרור גלוטמט שגורם עבורו אשלגן כלורי (Potassium chloride) היה מוגבר באופן ניכר בעכברי TauP301L שקיבלו vehicle, והופחת על ידי רילוזול.
- ניתוח היסטולוגי אישר מיקום מדויק של ה-MEA בתתי-אזורים מטרים של ההיפוקמפוס.
מסקנות
- טכנולוגיית MEA מאפשרת מדידה מדויקת ובמינימליזציה של פלישה (minimally invasive) של דינמיקת מוליכים עצביים in vivo.
- דיסרגולציה של גלוטמט בהיפוקמפוס ניכרת במודל עכברים למחלת אלצהיימר וניתנת לוויסות באמצעות riluzole.
- שיטה זו מספקת תובנות בעלות ערך לגבי שינויים במוליכי עצב העומדים בבסיס הפתולוגיה של מחלות ניווניות של מערכת העצבים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מערכי מיקרו-אלקטרודות (MEAs) מבוססי אנזימים מאפשרים מדידה מדויקת ובמינימליזציה של פולשנות של דינמיקת גלוטמט טונית ופאזית באזורי מוח מובחנים, ובכך הם נותנים מענה לצורך קריטי ברזולוציה מרחבית וזמנית בגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS). יכולת זו תומכת בהורדת סיכונים מכניסטית ובתיקוף מטרות במודלים של מחלות נוירודגנרטיביות, ומספקת מידע ישיר לקבלת החלטות בשלבים מוקדמים של ניהול פורטפוליו התרופות. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי עבור תוכניות נוירו-מדע תרגומיות על ידי כך שהיא מאפשרת הערכה כמותית ובזמן אמת של שינויים במוליכים עצביים הרלוונטיים לפתולוגיה של מחלת אלצהיימר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של הפרעות בוויסות מוליכים עצביים במעגלי מוח רלוונטיים למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות כימות דינמיקת גלוטמט in vivo.
- מסייע בהערכת סיכונים מכניסטית עבור היפותזות טיפוליות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- מספק נתונים כמותיים המשמשים למיון ותיעדוף של פורטפוליו פיתוחים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין מערכות מאושרות ורלוונטיות פיזיולוגית להערכת תרכובות.
- מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של שינויים במוליכים עצביים.
- תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה וב可השוואה בין מחקרים שונים.
- מאפשר סריקה של מודולטורים פרמקולוגיים בזמן אמת.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם נקודות קצה רלוונטיות למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מבטיח רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני במודלים של ניוורו-דגנרציה.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות-סיכון המבוססות על נתוני מוליכים עצביים in vivo.
- מספק תובנה מכניסטית לגבי השפעות התרופה על מעגלי ה-CNS.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו, המבוססת על MEA, משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ומאפשרת בדיקת היפותזות, תיקוף מטרות והתאמה של סממנים ביולוגיים תרגומיים בפיתוח תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של הגילוי: מכמתה את הדינמיקה של מוליכים עצביים כדי להבהיר מנגנוני מחלה ולתקף מטרות טיפוליות.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך הערכת תרכובות במערכות רלוונטיות פיזיולוגית.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות בזמן אמת, חסונות סטטיסטית, לצורך השוואת תנאים ותמיכה בקבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי התאמת מדדים in vivo לפתולוגיה של המחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר למדידת מוליכים עצביים במערכת העצבים המרכזית (CNS) על פני תוכניות מרובות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה סטנדרטיים, ניתנים להרחבה ולשחזור למדידות in vivo.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go ואת יעילות ההון על ידי אספקת נתונים נוירוכימיים ברי-ביצוע.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף וקידום של נכסי CNS מותאמי סיכון על בסיס תוצאות פונקציונליות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בכימיה של מערכת העצבים (נוירוכימיה), בניתוח סטריאוטקסי ובניתוח אלקטרוכימי.
- דורש מכשור ייעודי לייצור MEA, כיול והקלטה in vivo.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך השוואת נתונים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור אזורי מוח שונים או מודלים של מחלות.
- איכות האות תלויה בהארקה נכונה ובהקפדה על לוחות הזמנים של הפרוטוקול.
שאלות נפוצות בתחום הביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:50
Coating the MEA
1:40
Electroplating the Electrode
2:46
Preparing the Solutions Needed for Calibration
4:48
Assemble the Micropipette
5:46
General Animal Surgery for MEA Recordings
9:01
Results: Extracellular Tonic and Potassium Chloride-evoked Release of Glutamate in Hippocampus
10:18
Conclusion
