ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לסייע בקביעת הגודל של קצפים או נשאי-מיקרו שאינם מקושרים כימית, המופקים ממטריצה חוץ-תאית (ECM) ספציפית לרקמה, עבור יישומים במודלים של תרביות תאים תלת-ממדיות במערכת vitro-in, או כפיגומים פרו-רגנרטיביים במערכות להעברת תאים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי הביולוגיה התאית היישומית והנדסת רקמות, כגון האופן שבו הסביבה המיקרו-תאית התלת-ממדית מתווכת את תפקוד התא ואת התחדשות הרקמה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ייצור של פיגומים בעלי גיאומטריה ניתנת לכיוונון, המדמים את הרכב ה-ECM הטבעי הספציפי לרקמה ויציבים לתרבית לטווח ארוך ללא צורך בקשירה כימית נוספת.

לאחר ליופיליזציה של ה-ECM המופק מהרקמה בהתאם לפרוטוקול הכתוב, השתמש במספריים כירורגיים חדים כדי לקצוץ דק את הרקמה שעברה דסלולריזציה. כדי לבצע טחינה בקיריו-מיל (cryomill) לרקמה המעובדת, מלא תא טחינה מנירוסטה בנפח 25 milliliter עבור מערכת טחינה בכדורים למעבדה ב-ECM ליופיליזי וקצוץ, והוסף שני כדורי טחינה מנירוסטה בנפח 10 milliliter. סגור את תא הטחינה הטעון ושקע אותו לחלוטין בחנקן נוזלי למשך שלוש דקות.

לאחר מכן, טחנו את הדגימה הקפואה ב-30 Hertz למשך שלוש דקות. חזרו על הטבילה בחנקן נוזלי ועל הטחינה עד שה-ECM ייטחן לאבקה דקה. שקלו 250 milligrams של ECM קצוץ או טחון בקירור והעבירו אותו למבחנת צנטריפוגה בנפח 15 milliliter.

הוסיפו חמישה מיליליטרים של בופר NaH2PO4 בריכוז 22 מולרי למבחנה הצנטריפוגית וסמנו את מפלס הנוזל על המבחנה. לאחר מכן, הכינו תמיסת סטוק של alpha amylase על ידי הוספה של 7.5 מיליגרם של alpha amylase למיליליטר אחד של בופר NaH2PO4 בריכוז 22 מולרי. לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת הסטוק של alpha amylase לדגימה.

לאחר מכן, הוסיפו NaH2PO4 בריכוז 22 molar כדי להגיע לנפח סופי של 10 milliliters. ערבבו את התוךה באופן רציף במהירות של 300 RPM ובטמפרטורת החדר למשך 72 שעות. סבבו את התוכה בצנטריפוגה במהירות של 1500 times G למשך 10 דקות.

אספו בזהירות והשליכו את העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע ה-ECM שעבר עיכול. לאחר מכן, השתמשו ב-10 milliliters של NaCl בריכוז חמישה אחוזים המדולל במים מזוקקים פעמיים כדי לתלה מחדש את החומר שהשקיע, וערבבו ברציפות במשך 10 דקות ב-300 RPM. חזרו על השטיפה פעמיים נוספות לפני השימוש ב-10 milliliters של מים מזוקקים פעמיים לתליית המשקע מחדש.

לאחר מכן, ערבב את התוך תלוי באופן רציף ב-300 RPM בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר צנטריפוגה חוזרת של הדגימה, אסוף בזהירות והשלך את עלומית הנוזל (supernatant) מבלי להפריע למשקע ה-ECM שעבר עיכול. הוסף חומצה אצטית בריכוז 2 molar עד לסימון של חמישה מיליליטר.

ולסבב במערבל (vortex). לאחר מכן, ערבבו את התרחיף ברצף במהירות של 120 RPM ובטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך לילה. למחרת, בעזרת הומוגניзатор ידני המצויד בראש מסננת (saw tooth probe) ברוחב 10 millimeter, הומוגניזו את תרחיף ה-ECM בטמפרטורת החדר במרווחי זמן של 10 שניות, עד שלא יישארו שברים גלויים.

הניחו את התוך השהויה בכלי זכוכית (beaker) עם מים קרים בין מרווחי ההומוגניזציה כדי למנוע התחממות יתר. דגרו את תוך השהיית ה-ECM בטמפרטורה של 37 מעלות צלסיוס עם ערבוב רציף במהירות של 120 RPM עד שתוך השהויה יתחמם. לאחר מכן, השתמשו בחומצה אצטית בריכוז 2 molar כדי לדלל את תוך השהיית הדגימה לריכוז הרצוי.

באמצעות מזרק של שלושה מיליליטר עם מחט בכיול 18, מלאו את התבנית הרצויה בת сусפנסיית ה-ECM. ניתן לייצר ספוגים במגוון גיאומטריות, בהתאם לצורת התבנית. כסו והקפיאו את התבניות בטמפרטורה של 20- או 80- מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, הניחו את התבניות בתוך בקבוק לליופיליזטור. חברו את הבקבוק למערכת לייבש-הקפאה (freeze drier) של המעבדה וייבשו את התבניות למשך 24 שעות או עד לייבוש מלא. דגרו את תChatItem ה-ECM שעבר טחינה בקירור (cryomilled) תחת ערבוב רציף במהירות של 100 RPM למשך הלילה.

טענו שלושה מיליליטרים של תרחף ECM למזרק בעל חיבור luer lock של שלושה מיליליטרים, וחברו סט עירוי עם כנפיים (winged infusion set) לפיה של המזרק. אחרו את המזרק בתוך משאבת המזרקים. לאחר מכן, קבעו את המחט למעמד מעבדה (retort stand) ומקמו את קצה המחט באופן אנכי במרחק של ארבעה עד שישה סנטימטרים מהחלק העליון של בקבוק דאוואר (Dewar flask) בעל דפנות נמוכות.

בשלב הבא, חברו אלקטרודה של תפס תנימים לקצה המחט, וודאו כי תפס התנימים מחובר להדק החיובי של ספק הכוח למתח גבוה. קפלו רצועת נייר אלומיניום מעל דופן בקבוק הוואקום. לאחר מכן, חברו אלקטרודה שנייה של תפס תנימים לקצה החיצוני של רדיד האלומיניום.

חברו אותו להדק ההארקה של ספק הכוח. מלאו את בקבוק הדיוואר בחנקן נוזלי עד לגובה של כסנטימטר אחד מהחלק העליון, כך ששלושה רבעים מהרדיד יהיו טבולים. לאחר מכן, הגדירו במשאבת המזרק קצב עירוי של 30 milliliters per hour ובצעו התזהה חשמלית לדגימות בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

עם השלמת ההזרקה, שפכו בזהירות את עודפי החנקן הנוזלי מהדיוואר (Dewar), והשאירו את המיקרו-נשאים תלויים בכ-25 milliliters של חנקן נוזלי כדי להבטיח שיישארו קפואים. העבירו מיד את המיקרו-נשאים עם החנקן הנוזלי לפִיפֵטָה צנטריפוגית של 50 milliliter על ידי שפיכה בתנועה אחת חלקה. לאחר מכן, השתמשו בסקופולה (Scoopula) כדי לאסוף את כל המיקרו-נשאים הקפואים שנותרו בדיוואר.

הוסיפו גם אותם לצנטריפוגה. כדי להכין את הדגימות לליופיליזציה (הקפאה ויובש), כסו את מבחנת הצנטריפוגה בנייר אלומינום עם חורים קטנים. הכניסו את מבחנות הצנטריפוגה המכוסות לבקרא של הליופיליזר.

לאחר מכן, חברו מיד את הבקבוק לליופיליזטור (מקפיא-מייבש) ויבשו את הדגימות למשך הלילה. העבירו בעדינות את הקצף הלופיליז) למבחנת צנטריפוגה של 50 מיליליטר המכילה עודף של אתנול מוחלט. באופן דומה, השעו שוב את המיקרו-נשאיים הלופיליזים בעודף של אתנול מוחלט בתוך מבחנת הצנטריפוגה המקורית ששימשה לאיסוף.

בעזרת פיפטה סרולוגית, סננו את נשאי המיקרו דרך נפה מנירוסטה בעלת גודל רשת מוגדר אל תוך מבחנה לצנטריפוגה חדשה בנפח 50 מיליליטר, כדי להסיר אגרגטים ולבחור את טווחי הגדלים הרצויים. דגרו את הדגימה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות, או עד שהקצף או נשאי המיקרו ישקעו לתחתית מבחנת הצנטריפוגה. לאחר מכן, תחת מ 빠르게 מזרקת אוויר (Laminar flow hood) תוך שימוש בטכניקה אספטית, השתמשו בפיפטה סרולוגית כדי להסיר את האתנול המוחלט מהפיגומים והוסיפו עודף של 95% ethanol המדולל ב-PBS סטרילי.

הדגרימו את הפיגומים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות, או עד שהפיגומים שקעו לתחתית כלי ההידרציה. בצעו הידרציה הדרגתית של הפיגומים באמצעות סדרת אתנול. בכל שלב, הדגרימו את הפיגומים בארבע מעלות צלזיוס עד שהם שוקעים לתחתית הכלי, לפני החלפת התמיסה.

החליפו את ה-PBS הסטרילי בשני שטיפות נוספות כדי להסיר את האתנול השארי. אחסנו את הדגימות ב-100% sterile PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד השימוש בתרבית תאים. השתמשו בפיגומים בתוך שבוע עד שבועיים לאחר ההידרציה מחדש.

מוצגים כאן דוגמאות לסוגי קצפים ונשאי מיקרו המופקים מ-ECM אשר יוצרו באמצעות רקמת שומן לאחר הסרת תאים (decellularized). רקמה עורית של חזיר לאחר הסרת תאים, וחדר שמאל של חזיר לאחר הסרת תאים. הדוגמאות מדגימות כי ניתן להחיל את הטכניקות הללו ליצירת פיגומים ביולוגיים (bio-scaffolds) ספציפיים לרקמה, תוך שימוש במגוון רקמות לאחר הסרת תאים כמקורות ל-ECM.

בעקבות טחינה בקירור (cryomilling) או קיצוץ, עיכול אנזימטי והומוגניזציה, ניתן להעביר את הדגימות לקערה לפני ההקפאה והליופיליזציה. איור זה מציג קצף רטוב (rehydrated) של DAT, DDT ו-DLV טחונים, שסונטזו בתבנית של פלטת תרבית רקמות בעלת 48 בארות. קצפי DAT, DDT ו-DLV אלו יוצרו עם ECM שעבר טחינה בקירור בריכוז של 35 mg/mL ובטמפרטורת הקפאה של 80°C-.

כדי לייצר מיקרו-נשאיות (micro carriers) המופקות מ-ECM באמצעות טכניקת התזת אלקטרונים (electro spraying), ניתן לכוון עבור כל ריכוז של תרחיף מקור ECM את קוטר המחט, קצב ההזרקה והמתח, כדי ליצור מיקרו-נשאיות כדוריות נפרדות שקוטרן נע בין 350 ל-500 מיקרומטרים לאחר רהידרטציה מבוקרת. לבסוף, מיקרו-נשאיות ה-DAT, DDT ו-DLV המוצגות כאן ב-SEM חושפות כי המבנה העל-מיקרוסקופי בגודלן יכול להשתנות בהתאם למקור ה-ECM שעבר דה-צלולריזציה. ניתן להשתמש בשיטות המוצגות בסרטון זה כדי לייצר מגוון רחב של מיקרו-נשאיות וקצפים ספציפיים לרקמה, המורכבים מ-ECM טהור שאינו מקושר כימית, תוך שימוש ברקמה שעברה דה-צלולריזציה כמקור למטריקס.

בעקבות פרוצדורות אלו, ניתן לזרוע תאים על הקצף ועל נשאי המיקרו בתנאים סטטיים או דינמיים, ולהשתמש בהם כתשתית מכוונת-תאים עבור תרביות תאים in vitro ויישומים in vivo.