ההערכה הראשונית של נוגדן-conjugates שונה עם פפטידים ויראלי-derived הגדלת לצבירה התאית ושיפור הגידול מיקוד

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא להעריך את הספציפיות והיעילות של צימודי נוגדנים להצטברות בתוך תאי מטרה וגידולים בשלבי הפיתוח הראשוניים, כך שניתן יהיה להשתמש בהם בסופו של דבר במרפאה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתשובה לשדות המצומדים, כגון יעילות הלוקליזציה הגרעינית והצטברות הבין-תאית הכוללת. היתרון של טכניקה זו הוא שבאמצעות הדמיית PET, חוקרים יכולים להעריך את היעילות והסלקטיביות של צימודי נוגדנים מועמדים.

ההשלכות של טכניקות אלה משתרעות על טיפול ואבחון סרטן, מכיוון שהצטברות לא יעילה של תאי גידול היא מגבלה מרכזית ביישומים אלה עבור צימודי נוגדנים. לאחר סינתזה של נוגדן מצומד לרצף לוקליזציה גרעינית של חומצה קולית על פי פרוטוקול הטקסט, יש לטפל בתאי יעד TF1A עם 200 נוגדנים ננו-מולאריים 7G3 חומצה קולית MLS מצומדים. כלול תאים שטופלו בנוגדנים חד שבטיים בקרה שונה.

דגרו חמש פעמים 10 עד התאים החיוביים לאנטיגן השישי כשהמצומדים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר מכן הסר את הסופרנטנט, והשתמש במיליליטר אחד של PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים. מוסיפים מדיום טרי, ומדגרים את התאים בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה נוספת.

לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר PBS, המכילים 0.25% טריפסין ו-EDTA, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך עד 30 דקות. לאחר מכן השתמש ב -1.5 מיליליטר של מדיום RPMI1640 עם 10% FBS כדי לנטרל את הטריפסין. צנטריפוגה של התאים בעוצמה של 500 פעמים G למשך חמש דקות, הסירו את הסופרנטנט והשתמשו ב-0.5 מיליליטר PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים שוב.

הוסף לתאים 0.5 מיליליטר של 1% PFA ו-1% סוכרוז ו-PBS, והניח אותם על קרח למשך 30 דקות כדי לתקן אותם. לאחר מכן השתמש ב-0.5 מיליליטר PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים, וצנטריפוגה את הדגימות ב-250 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 0.15% טריטון X-100 ו-PBS לתאים, וחלחלו אותם על קרח למשך חמש דקות.

לאחר מכן, עם PBS קר כקרח, שטפו את התאים וחזרו על הצנטריפוגה. השעו את התאים ב-0.1 מיליליטר PBS, המכילים שני מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן רב-שבטי משני FC המצומד ל-Alexa Fluor 647, ודגרו על הדגימות בחושך בטמפרטורת החדר למשך שעה. צנטריפוגה של התאים ב-250 פעמים G למשך חמש דקות, והשתמש ב-0.5 מיליליטר PBS קר כקרח כדי לשטוף את התאים שלוש פעמים.

ואז השעו את התאים ב 0.5 מיליליטר PBS. הוסף 10 מיקרוגרם למיליליטר של פרופידיום יודיד לתאים. לאחר מכן השתמש במדיום הרכבה כדי להרכיב פעם אחת 10 עד התאים החמישיים על שקופיות זכוכית לפני כיסוי הדגימה בהחלקת כיסוי זכוכית.

בחן את התאים עם יעד טבילת שמן Plan APO 60X, צמצם מספרי 1.42, במיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר הפוך. זהה פלואורסצנטיות PI באמצעות לייזר ארגון 488 ננומטר ומנסרת הסריקה הספקטרלית המוגדרת ל-600 עד 650 ננומטר. עבור פלואורסצנציה AF 647, השתמש בלייזר הליום-ניאון בגודל 633 ננומטר ובמנסרת סריקת הספקטרום המוגדרת ל-650 עד 700 ננומטר.

אסוף תמונות מ-PI ו-AF 647 ברצף, 1024 על 1024 פיקסלים, עם ממוצע קו פי 2, שצולמו במרווחים של 0.5 מיקרון לאורך כל עובי התא. הצג תמונות כהקרנות Z. לנתח את התאים, להעריך ולתעד האם הקרינה התוך-תאית בציטופלזמה מקובצת וקרובה לפני התא או מפוזרת והומוגנית.

העריכו גם את עוצמת הקרינה היחסית לתא. לאחר הכנה וריכוז של נוגדן NLS מצומד חומצה קולית עם תווית רדיו על פי פרוטוקול הטקסט, קבע את יעילות תיוג הרדיו על ידי מריחת 0.5 מיקרוליטר של 0.1 מולרית נתרן ציטראט PH5.5, או חומר ניקוי ITLC, על רצועת ITLC. צור צילום אוטו-רדיוגרף של הרצועה, וקבל תמונה דיגיטלית.

בצע צפיפות כדי להשיג את היחס של נחושת-64 כבול וחופשי. אם תכולת הנחושת-64 החופשית גדולה מ-5%, יש לרכז את הדגימה עוד יותר. עבור מחקרי הצטברות תאים של נחושת-64, טפל בתאים עם 100 ננו-מולרית של מצומדים A14 המסומנים בנחושת-64 ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה, שש ו-24 שעות, כפי שתואר קודם לכן.

טפל בתאים עם A14 לא שונה כדי לחסום אלפאציטים IL5R ובארבע מעלות צלזיוס כדי לחסום הפנמה בתיווך קולטנים. לאחר שטיפת התאים והדגירה במדיום טרי, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, הוסיפו 0.5 מיליליטר PBS המכיל 0.25% טריפסין ו-EDTA, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, לאחר נטרול ושטיפת התאים כמו קודם, הוסף מאגר ליזה של קרום פלזמה לתאים, ודגר אותם על קרח למשך 10 דקות.

צנטריפוגה של התאים הליזים בקרום הפלזמה ב-90 פעמים G למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והעביר אותו לצינור טרי. זה מייצג את השבר הציטופלזמי.

לאחר מכן השתמש ב- PBS קר כקרח כדי לשטוף את הגרעינים שלוש פעמים, והוסף את השטיפות לשבר הציטופלזמי. ודא שהבקבוקונים המכילים את השברים הגרעיניים והציטופלזמיים אטומים, ולאחר מכן הנח אותם במונה גמא מכויל לנחושת-64 על מנת להמיר ספירות גולמיות למגה-בקריל. לקבוע את איכות בידוד הגרעינים על ידי ביצוע ניתוח כתם מערבי עבור lamin AC, חלבון גרעיני מוגבל; ו-Rab-7, חלבון ציטופלזמי בשפע, על שברים סיטונאיים של ליזאט, גרעין וציטופלזמה.

טפל חמש פעמים 10 עד ששת התאים עם 500 מיקרוליטר של בדיקת משקעים רדיו-אמינו, או מאגר RIPA, ומאגר ליזה של ממברנת פלזמה המכיל 1%2% ו-4% NP-40. יתר על כן, טפל בגרעינים המבודדים עם 500 מיקרוליטר של מאגר RIPA כדי להשיג חלבונים גרעיניים מבודדים. הוסף פי ארבעה מנפח הדגימה של אצטון קר לחלבונים הגרעיניים, הציטופלזמיים והסיטונאיים המבודדים, ודגר במשך 60 דקות במינוס 20 מעלות צלזיוס.

צנטריפוגה את הדגימות ב 13, 000 פעמים G למשך 10 דקות. לשפוך את הסופרנטנט, להיזהר לא לעקור את כדור החלבון. לאחר מכן הוסף 100 מיקרוליטר PBS כדי להמיס את החלבונים.

לאחר ביצוע Western Blotting כפי שתואר קודם לכן, חתכו את הממברנה לשניים בסמן המשקל המולקולרי של 40 קילו-דלטון. השתמש בנוגדנים ספציפיים ל-lamin-AC כדי לחקור את הכתם המכיל את החלבונים בעלי המשקל המולקולרי הגבוה יותר, והשתמש בנוגדנים ספציפיים ל-Rab-7 כדי לחקור את החצי התחתון של הממברנה. בקבוצות המכילות ארבעה עכברי nodskit, יש להזריק לווריד הזנב 20 עד 30 מיקרוגרם של נוגדן NLS מצומד A14 חומצה קוליקית, A14 NLS עם תווית רדיו ו-A14 עם תווית רדיו.

באותו יום, הנח פנטום גלילי המכיל חמישה מגה-בקריל של נחושת-64 לסורק ה-PET כדי להמיר את הספירה הרדיואקטיבית בשנייה למינון מוזרק לגרם רקמה. 48 שעות לאחר מכן, לאחר הרדמת העכברים על פי פרוטוקול הטקסט, העבירו במהירות עכבר לשולחן סורק PET במצב נוטה לראש עם אף לאיזופלורן. התחל את רכישת נתוני ה-PET באמצעות הגדרת אופן דגימה רגילה וחלון אנרגיה של 250 עד 650 קילו-אלקטרון וולט.

לאחר הסריקה, הסר את העכבר מהסורק והחזר אותו לכלוב. כפי שמוצג באיור זה, החיצים מראים את ההבדל בעת הערכת הצטברות נוגדנים מצומדת עם ובלי טריפסיניזציה. בתאים שאינם טריפסינים, קשה להעריך הצטברות ופיזור תוך תאיים בגלל ביטוי יתר של קולטני פני השטח של תא המטרה.

החצים מראים את ההבדל בהצטברות תוך תאית ובהתפלגות של שני מועמדים מצומדים לנוגדנים כאשר התאים עוברים טריפסין כראוי. נוגדן NLS עם חומצה קולית A14 המצומד מראה זיקה ננו-מולרית ל-IL5R אלפא. עם ריכוזים הולכים וגדלים של נוגדני NLS מצומדים של חומצה קולית A14, קשירה ספציפית של נוגדן NLS מצומד חומצה קולית A14 התקרבה לרוויה בריכוזים של 3.5 ננו-מולרי הן בתאי HT-1376 והן בתאי HT-B9.

ספירת גמא מגלה כי העלייה ברדיואקטיביות בגרעין ובציטופלזמה מצומד נוגדני NLS של חומצה קולית A14 היא ספציפית ועולה עם הזמן. תאי HT-1376 ו-HT-B9 הודגרו עם מאגר ליזה של ממברנת פלזמה המכיל 1%2% או 4% NP-40. עבור תאי HT-1376 ו-HT-B9, מאגר הליזיס המכיל אחד או 2% NP-40 Rap-7 לא זוהה בשבר הגרעיני, ולמין AC לא זוהה בשבר הציטופלזמי.

הדמיית PET מאפשרת להעריך את מצומדי הנוגדנים המועמדים ליכולתם להתמקד בגידולים חיוביים לאנטיגן, חיצים אדומים וכחולים, ותכונות ההפצה הביולוגית הקשורות אליהם בהשוואה לנוגדנים הוריים שאינם מותאמים לפפטיד. ניתן לראות את הצטברות האותות בגידול כדי לעזור לבחור את הפוטנציאל למצומד נוגדנים מפותח. הדמיית PET מאפשרת גם להעריך את ספיגת הנוגדנים המועמדים ברקמות בריאות כמו הכבד.

לאחר שליטה בטכניקות אלה, חוקרים בתחום העברת גידול ממוקדת של מטענים מולקולריים יוכלו לחקור גורמים נוספים שבהם הצטברות תאי גידול מונעת עקב לכידת אנדוזום.