ניתוח של הפסקת תמלול שימוש BrUTP גדיל ספציפי התמלול Run-על (TRO) גישה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את סיום השעתוק על ידי RNA פולימראז לשמרים ניצנים בתנאי in vivo על ידי השעתוק הספציפי לגדיל הפועל בגישה. שיטה זו עוזרת לענות על שאלת המפתח האם הפולימראז הפעיל מבחינה שעתוק שזוהה מעבר לשלושת הקצוות הראשוניים של הגן הוא זה שנוצר מאזור המקדם. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא יכולה להבחין בין פולימראז המתעתק של MRNA לבין פולימראז המתעתק באופן נרחב שיזם שעתוקים ויהיה בשלושת הקצה הראשוני של הגן.

ניתן להרחיב טכניקה זו כדי לחקור את סיום השעתוק על ידי RNA פולימראז ושמרים אחרים בשל אופי השימור של סיום על ידי פולימראזים שונים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התפקיד המדויק של גורמי סיום במחזור שעתוק השמרים, ניתן להרחיב אותה גם לחקר סיום באיקריוטים גבוהים יותר. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם חדירות תאים ושעתוק הפועלים על עצירות, מכיוון שהם דורשים ביצוע זהיר, וגם תעתיקים מתהווים יכולים להיות קשים לטיהור.

לראשונה קיבלנו את הרעיון לשיטה זו מגישת חיפוש GRO שנותנת תמונת מצב רחבה של הגנום של המיקום של פולימראזים פעילים שעתוק באופן ספציפי לגדיל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה לבצע את ריצת השעתוק וטיהור ה-RNA בשל הכמות הנמוכה והאופי הלא יציב של התעתיקים המתהווים. לפני תחילת השעתוק הפעל על תגובה, גדל, קצור וחלחל תאי שמרים הגדלים באופן אקספוננציאלי, כדי להשיג פלטת תאים חדירה.

כדי להתחיל את התגובה, הוסף 150 מיקרוליטר של שעתוק הפועל על מאגר לפלטת התאים החדירה. בעזרת קצה P-200 קטום מערבבים בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הניחו את הדגימה על קרח.

לאחר שכל הדגימות הושעו מחדש בהפעלת השעתוק על חוצץ, דגרו את הדגימות למשך חמש דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באמבט מים. עצור את התגובה על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של מגיב בידוד RNA קר מוכן לשימוש לכל דגימה. דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

התחל את הליך מיצוי ה-RNA על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של חרוזי זכוכית שטופים בחומצה לכל תרחיף תא וניעור נמרץ במיקסר מערבולת למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 20 דקות, השתמש במחט חמה בגודל 22 כדי לנקב את החלק התחתון של כל צינור מיקרו-צנטריפוגה ולהניח את הצינור על גבי צינור חרוטי סטרילי של 15 מיליליטר. צנטריפוגה ב-300 פעמים G למשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס ולהעביר את הליזאט של התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

הוסף 500 מיקרוליטר של מגיב בידוד RNA קר, ו -200 מיקרוליטר כלורופורם לליזאט התא. מערבבים את התוכן על מערבל המערבולת ואז צנטריפוגה בחום של 16, 168 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את השלב המימי העליון לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.

הוסף נפח שווה של אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם קר. מנערים במרץ על מערבל המערבולת ואז צנטריפוגה ב -16, 168 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את השלב המימי העליון המכיל RNA לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.

הוסף שוב נפח שווה של אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם קר, מערבולת וצנטריפוגה. ל-RNA הסופי המכיל פאזה מימית הוסף נפח מתאים של מלאי נתרן כלורי חמש מולארי כדי לקבל ריכוז סופי של 0.3 טוחנת. הוסף פי שלושה מנפח האתנול הקר כדי לזרז את ה-RNA.

דוגרים למשך שעה, או לילה, בחום של 20 מעלות צלזיוס. כאשר משקעי ה-RNA מסתיימתים, צנטריפוגה ב-16, 168 פעמים G למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את פלטת ה-RNA ב-100 מיקרוליטר מי DEPC.

השתמש בערכת בידוד RNA כדי להפריד את ה-RNA מהנוקלאוטידים הלא משולבים של ברומורידין טריפוספט ולסלק את ה-RNA מהעמודה עם 100 מיקרוליטר של מים נטולי RNAse. דגרו את ה-RNA באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. ואז מעבירים לקרח למשך שתי דקות לפחות.

התחל הליך זה על ידי הכנת חרוזי ה-DU האנטי-ברומו בזמן שה-RNA משקע. עבור כל דגימה הוסף 500 מיקרוליטר של 0.25 X נתרן מלח פוספט EDTA מחייב מאגר ל-25 מיקרוליטר של חרוזים מיושבים. צנטריפוגה בטמפרטורה של 200 פעמים G למשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס, והסר את הסופרנטנט.

שוטפים את החרוזים שלוש פעמים עם מאגר הכריכה. לאחר הוצאת הסופרנטנט מהכביסה השלישית, הוסיפו לחרוזים 500 מיקרוליטר של חיץ חוסם ונערו בעדינות במשך שעה עד שעתיים בארבע מעלות צלזיוס על שייקר פלטפורמה. שוטפים את החרוזים פעמיים נוספות עם 500 מיקרוליטר של מאגר כריכה.

הסר את הסופרנטנט מהכביסה השנייה והוסף 400 מיקרוליטר של מאגר מחייב לחרוזים. העבירו 100 מיקרוליטר RNA ישירות לחרוזים. דגירה עם טלטול עדין במשך שעה עד שעתיים בארבע מעלות צלזיוס על שייקר פלטפורמה.

סובבו ב-200 פעמים G למשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס ואז הסירו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מאגר קשירה לחרוזים. סובב ב-200 פעמים G למשך 30 שניות בארבע מעלות צלזיוס והסר את הסופרנטנט.

באופן זה, שטפו את החרוזים ברצף עם מאגר קשירה, מאגר מלח נמוך, מאגר מלח גבוה ופעמיים עם מאגר TET. כדי לסלק את הברומורידין, טריפוספט המסומן RNA מהחרוזים, הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר פליטה ודגירה במשך ארבע דקות ב-42 מעלות צלזיוס באמבט מים. סובב לזמן קצר ואסוף את הסופרנטנט.

באופן זה, יש לשטוף פעמיים ברצף עם 150 מיקרוליטר ופעם אחת עם 200 מיקרוליטר של מאגר פליטה. יש להשיג כ-500 מיקרוליטר של RNA מטוהר ברומורידין טריפוספט המסומן בכל דגימה. כדי לזרז את הזיקה המטוהרת ברומורידין טריפוספט המסומנת RNA הוסף 500 מיקרוליטר של אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם קר לכל דגימה.

מערבולת וצנטריפוגה ב-16, 168 פעמים G למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. העבירו את השלב המימי העליון לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש. הוסף את הנפח המתאים של מלאי נתרן כלורי חמש מולארי כדי לקבל ריכוז סופי של 0.3 טוחנת.

לאחר מכן מוסיפים פי שלושה מנפח האתנול הקר. דגירה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לזרז את ה-RNA. למחרת, אספו את ה-RNA המשקע על ידי צנטריפוגה ב-16, 168 פעמים G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

הסירו את ה-supernatant והניחו לפלטה להתייבש באוויר למשך 10 דקות. השעו מחדש את לוח ה-RNA ב-26 מיקרוליטר מי DEPC. קבע את ריכוז ה-RNA הסופי על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.

אחסן את דגימות ה-RNA והמינוטים ב-80 מעלות צלזיוס עד שיהיה צורך בסינתזת cDNA. השעתוק הספציפי של גדיל הברומורידין טריפוספט שימש לבדיקת הדרישה של RNA 14 להפסקת השעתוק של הגן ASC1 בשמרים ניצנים. ברומורידין טריפוספט שסומן ב-RNA ממוטנט RNA 14-1 ותאי הבר האיזוגניים שלו טוהרו ותועתק הפוך עם פריימרים C, D, E, F ו-G.ה-cDNA המקביל הוגבר PCR באמצעות זוגות פריימרים B ו-C, B ו-D, B ו-E, B ו-F, ו-B ו-G, וחולק על ג'ל אגרוז.

נוכחותם של תוצרי PCR מוגברים מזוגות הפריימר B ו-E, B ו-F, ו-B ו-G במוטנט, משקפת פנוטיפ קריאת סיום. בתאים מסוג פרא, לעומת זאת, ריצת השעתוק על האות הייתה מוגבלת עד לאלמנט הטרמינטור ולא הייתה ריצת שעתוק ניתנת לזיהוי על אות מעבר לאזור הטרמינטור. גרף זה מציג את כימות הג'לים עם חמישה S RNA כבקרת הנורמליזציה.

הזיהוי של תעתיקים מתפתחים שיזמו את המקדם שקוראים את אות הסיום בתאים המוטנטיים אך לא בתאים מסוג הבר מאשר ש-RNA 14 הוא גורם סיום. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלושה ימים. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור כי הפעלת התמלול על התגובה היא קריטית להשגת תוצאה מוצלחת.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כגון חיפוש GRO על מנת לענות על שאלות נוספות כמו התפקיד הרחב של הגנום של גורם בסיום. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום השעתוק לחקור סיום על ידי RNA פולימראז אחר בשמרים ובמערכות איקריוטיות גבוהות יותר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע תמלול, לרוץ על תגובות ולטהר תמלילים מתויגים מתהווים.

אל תשכח שה-RNA יכול להיות מאוד לא יציב ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כמו לבישת כפפות, שמירה על הטמפרטורה סביב ארבע מעלות צלזיוס ושימוש בחומרים נטולי RNAse בעת ביצוע הליך זה.