Name: ניתוח של הפסקת תמלול שימוש BrUTP גדיל ספציפי התמלול Run-על (TRO) גישה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: למדו לנתח הפסקת תמלול על ידי RNA polymerase II בשמרים תוך שימוש בגישת TRO ספציפית לגדיל ו-BrUTP. שיטה זו מאפשרת להבחין בין פולימראזים שונים ולחקור גורמי סיום בתמלול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחקר במעבדת אנסארי נתמך על ידי מענק המחקר (No. MCB 1020911) מהקרן הלאומית למדע.

הערה: שיטה זו שימשה במאמר במחקר דיווחו Medler, S ו- אנסארי, א 2. 1. Culturing ו קציר תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל תרבות 5 מ&quot;ל של תאים במדיום YPD (תמצית שמרים 10 גר &#39;/ ל, 20 גר&#39; / ל peptone, 2 דקסטרוז%) מתוך צלחת cerevisiae Saccharomyces טרי מפוספס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את התאים לילה ב שייקר מסלולית ב 30 ° C ו 250 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תרבות מבוגר לילה 100 פעמים לנפח סופי של 100 מ&quot;ל במדיום YPD בבקבוק 250 מ&quot;ל מבולבל. הערה: סך של 100 מ&quot;ל של התרבות נדרשת לכל תגובה TRO; אם תגובות מרובות נדרשות, נפח גדול יותר של התרבות חייב לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל את תאי צפיפות אופטית של 0.8 - 1.0 ב 600 ננומטר (600 ~ 0.8 - 1.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 820 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C בצינור 50 מ&quot;ל חרוטי סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 10 מ&quot;ל של bu TMN קר קרחffer (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 מ&quot;מ 2 MgCl, 100 מ&quot;מ NaCl) ו דגירה על קרח למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 820 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת התאים. בעדינות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. </li></ol> 2. Permeabilizing תאי הכנות לקראת Run-על Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 1 מ&quot;ל של תמיסת 0.6% sarkosyl ידי pipetting למעלה ולמטה בעדינות בעזרת טיפ P 1000 קטום. מעבירים את ההשעיה לתא צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge צונן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנער את התאים בעדינות על 4 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות על שייקר פלטפורמה. הערה: צינורות Microcentrifuge צריכים להיות ארוזים לתוך צינור חרוטים 50 מיליליטר עם קרח כדי לשמור על טמפרטורה קרה, הימנעות את האפשרות של כל אירועי ייזום חדשים המתרחשים האמרגן בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים ב 1200 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגות בקירור שולחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לשאוב supernatant להסיר את הנוזלים העודפים מן לכלתא גלול meabilized. </li></ol> תגובת 3. תמלול Run-על <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 150 μL של שעתוק ריצה על חיץ (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ MgCl 2, 2 מ&quot;מ DTT (dithiothreitol), 0.75 מ&quot;מ כל אחד ATP, CTP, GTP, ו BrUTP, 200 U RNase מעכב) אל תא גלולה permeabilized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה באמצעות קצה P 200 קטום. הערה: אם עיבוד דגימות מרובות, לשמור הכל על קרח עד שכל הדגימות מוכנות ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 5 דקות ב 30 מעלות צלזיוס באמבט מים. הערה: כוונן את זמן הדגירה בין 1 ל 5 דקות כדי להבטיח שילוב אופטימלי של BrUTP לתוך RNA המתהווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה על ידי הוספת 500 μL של מגיב בידוד RNA קר מוכן לשימוש. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li></ol> 4. RNA הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של חרוזי זכוכית חומצה שטף לתא suspensiעל (שלב 3.4), ולנער במרץ למשך 20 דקות ב 4 ° C במיקסר מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנקב את החלק התחתון של הצינור microcentrifuge באמצעות מחט 22 G חם ומניחים אותו על גבי צינור חרוטי סטרילי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 דקות 1 ב 4 ° C כדי לאסוף את lysate התא. מעבירים את lysate לתא צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של מגיב בידוד RNA קר 200 μL של כלורופורם אל lysate התא. מערבבים את התוכן על מערבל מערבולת צנטריפוגות ב 16,168 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית העליון לצינור microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף נפח שווה של פנול / כלורופורם קר / isoamyl אלכוהול (125: 24: 1) pH 4-5. לנער במרץ על מערבל מערבולת צנטריפוגות ב 16,168 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את RNA המכיל בשלב מהימי העליון לצינור microcentrifuge חדש. חזור על שלב 4.6 פעמים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל השלב מהימי הסופי המכיל RNA, להוסיף 5 M NaCl stock כדי לקבל ריכוז סופי של 0.3 מ &#39;להוסיף 3 פעמים את הנפח של אתנול קר לזרז את הרנ&quot;א. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 1 ש &#39;או לילה ב -20 ° C. הערה: בצע את שלבי 4.9 - 4.11 בעוד החרוזים אנטי BrdU שמתבצעים וטופחו לחסימה (ראה שלב 5.3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 16,168 XG במשך 20 דקות ב 4 °. הסר את supernatant ו resuspend גלולה רנ&quot;א 100 μL של מים DEPC (diethylpyrocarbonate). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ערכת מיני בידוד RNA להפריד בין RNA מן נוקלאוטידים BrUTP מאוגדים. Elute רנ&quot;א מהעמודה עם 100 μL של מים RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה RNA באמבט מים C ° 65 במשך 5 דקות ולאחר מכן להעביר קרח דק 2 לפחות. </li></ol> טיהור זיקה 5. RNA BrUTP שכותרתו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי 25 μL של אנטי BrdU התיישבו חרוזים, להוסיף 500 μL של 0.25x SSPE (נתרן מלוחים פוספט EDTA) במאגר מחייב (20x SSPE: 3 M NaCl, 0.2 M לאא 2 PO 4 </sub&gt;, 0.02 M EDTA, pH 7.4, 1 mM EDTA, 0.05% Tween, 37.5 מ&quot;מ NaCl). צנטריפוגה ב XG 200 עבור 30 s ב 4 ° C ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.1 שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של חיץ חסימת (1x חיץ מחייב, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 1 מ&quot;ג אלבומין אולטרה-טהור שור (BSA)) על חרוזים ולנער בעדינות במשך 1 - 2 שעות ב 4 ° C על שייקר פלטפורמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את החרוזים פעמיים נוספות עם 500 μL של חיץ מחייב, כפי שמתואר בשלב 5.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 400 μL של חיץ מחייב את החרוזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μL של RNA (משלב 4.11) ישירות חרוזים. דגירה עם רעד עדין במשך 1 - 2 שעות ב 4 ° C על שייקר פלטפורמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את ברצף החרוזים עם 500 μL של חיץ מחייב, 500 μL של חיץ מלח נמוך (SSPE 0.2X, 1 mM EDTA, 0.05% Tween), 500 μL של חיץ מלח גבוה (0.25x SSPE, 1 mM EDTA, 0.05% Tween, 100 מ&quot;מ NaCl), ופעמיים עם 500 μL של חיץ TET (1x TE, 0.05% Tween), מסתובב בביתXG 200 למשך 30 שניות ב 4 מעלות צלזיוס בין כל שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute רנ&quot;א BrUTP שכותרתו אמנות עשויים חרוזים ברצף, פעמיים עם 150 μl ופעם עם 200 μl של חיץ elution (20 מ&quot;מ DTT, 150 מ&quot;מ NaCl, 50 mM Tris-HCl 7.5 pH, 1 mM EDTA, 0.1% SDS), על ידי דוגרים עבור 4 דקות ב 42 מעלות צלזיוס באמבט מים ואחריו סיבוב קצר להפריד חרוזים מן supernatant. </li></ol> רטיבות 6. RNA שכותרתו BrUTP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL של פנול / כלורופורם קר / isoamyl אלכוהול (125: 24: 1) pH 4 - 5 עד הזיקה המטוהרת BrUTP שכותרתו RNA. מערבבים על מערבל מערבולת צנטריפוגות ב 16,168 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השלב מימית העליון לצינור microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מניות M NaCl כדי לקבל ריכוז סופי של פעמים 0.3 M ו -3 היקף אתנול קר לזרז את הרנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור לילה -20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הרנ&quot;א זירז ידי צנטריפוגה ב 16,168 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ולאפשר גלולה לייבוש באוויר במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה רנ&quot;א 26 μL של מים DEPC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז RNA הסופי על ידי מדידת הספיגה ב 260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. כמו כן, קבע את היחס 260/280. יחס ~ 2 מעיד על מדגם RNA טהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את דגימות רנ&quot;א aliquots ב -80 ° C עד הצורך לסינתזה cDNA. </li></ol> 7. שעתוק לאחור של רנ&quot;א שכותרתו BrUTP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז RNA ל 100 ng / μL באמצעות מים DEPC. השתמש 0.5 מיקרוגרם של רנ&quot;א עבור כל תגובה סינתזה cDNA. הערה: ריכוז תבנית RNA עשוי לנוע בין 0.5 ל 1.0 מיקרוגרם להשיג סינתזת cDNA אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך לתמלל את RNA באמצעות פריימרים הפוכים מרובים שנועדו במורד זרם של (אתר הסיום) פולי (א) אתר כפי שמוצג באיור 3 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתגובה כל שעתוק לאחור, להוסיף 5 μl RNA templatדואר (0.5 מיקרוגרם), 1 μL תמהיל dNTP (10 מ&quot;מ כל אחד), 2 μL של C פריימר הפוכה, D, E, F או G (50 מיקרומטר אחד) (ראה איור 3 א) ומים חינם nuclease. היקף התגובה האחרון בצינור אחד הוא 13 μL. הערה: מספר התגובות שעתוק לאחור יהיה תלוי במספר פריימרים הפוך המשמש לסינתזת cDNA. לדוגמא, עבור ASC1 חמישה פריימרים הפוכים שמשו ולכן חמש תגובות שעתוק לאחור הוקמו. לייבל הצינורות כמו C, D, E, F ו- G על בסיס של פריימר הפוכה המשמש לסינתזת cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצינורות המכילים תבנית RNA, תמהיל dNTP ו פריימרים ב thermocycler על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להסיר כל קונפורמציה מבני משני, ולאחר מכן לצנן עד 4 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 μL הפוכה transcriptase (200 U / μL), 4 μL חיץ 2 μL של 0.1 M DTT צינור אחד המכיל את תבנית רנ&quot;א פריימר (שלב 7.4). מערבבים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שעתוק לאחור על ידי דוגר את תערובת התגובה ב thermocycler על 42 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית transcriptase הפוכה על 65 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את cDNA ב -20 ° C או להמשיך לשלב הבא. </li></ol> הגברת 8. של cDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את תגובת PCR עבור הגברה של כל הכנה cDNA (שכותרתו C, D, E, F ו- G עבור ASC1) משלב 7.8 כדלקמן: 3.0 תבנית cDNA μL משלב 7.8, 1.0 B פריימר קדימה μL (10 מיקרומטר), 1.0 מיקרוליטר C פריימר הפוכה או D או E או F או G (10 מיקרומטר), 2.5 μL 10x פולימראז חיץ PCR, 0.5 μL תמהיל dNTP (10 מ&quot;מ כל אחד), 1.0 מיקרוליטר MgCl 2 (2.5 מ&quot;מ), 15.5 מים כיתה μL PCR, ו -0.5 אנזים פולימראז thermostable μL. הערה: דילולים שונים של תבנית cDNA הנעה בין 1: 5 ל -1: 100 צריכים להיבדק כדי לייעל את תשואת מוצר PCR. פריימר קדימה יחיד האמרגן-הפרוקסימלי ישמש כדי להגביר cDNAשהושג באמצעות פריימרים הפוך שונה. לדוגמא, ב פריימר קדימה יחיד הממוקם ליד האמרגן שמש בשילוב עם חמישה פריימרים הפוכים מ C ל G טוב ASC1. BC, BD, BE, BF ו BG שימשו צינורות שכותרתו כמו C, D, E, F ו- G בהתאמה כמוצג באיור 3 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את ה- PCR באמצעות פרמטרי רכיבת התרמית הבאות: 1 מחזור 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (להתחיל חם עבור הפעלה של פולימראז), 30 - 40 מחזורים 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (denaturation), 54 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות (חישול) , 68 מעלות צלזיוס במשך דקות 1 (הארכה), מחזור 1 68 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות (הארכה הסופית). הערה: טמפרטורת החישול תשתנה בהתאם פריימרים הספציפיים בשימוש והזמן הרחב ישתנה בהתאם לגודל התוצר הצפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את מוצר ה- PCR על ידי אלקטרופורזה על 0.8%, 1.5%, או 2 ג&#39;לים agarose% בהתאם לגודל הצפוי של המוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את מוצר ה- PCR, כמתואר El Kaderi et al. , 2012 11. הערה: לחילופין, להשתמש בזמן אמת אסטרטגיה RT-qPCR כדי לכמת את כמות תמלילי המתהווה. </li></ol>

<ol><li>Birse, C. E., Minvielle-Sebastia, L., Lee, B. A., Keller, W., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+termination+of+transcription+to+messenger+RNA+maturation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Coupling termination of transcription to messenger RNA maturation in yeast.</a> Science. 280 (5361), 298-301 (1998).</li>
<li>Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+looping+facilitates+TFIIH+kinase-mediated+termination+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gene looping facilitates TFIIH kinase-mediated termination of transcription.</a> Sci Rep. 5, 12586(2015).</li>
<li>Richard, P., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+by+nuclear+RNA+polymerases%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcription termination by nuclear RNA polymerases.</a> Genes Dev. 23 (11), 1247-1269 (2009).</li>
<li>Mischo, H. E., Proudfoot, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disengaging+polymerase%3A+terminating+RNA+polymerase+II+transcription+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Disengaging polymerase: terminating RNA polymerase II transcription in budding yeast.</a> Biochim Biophys Acta. 1829 (1), 174-185 (2013).</li>
<li>Porrua, O., Libri, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+termination+and+the+control+of+the+transcriptome%3A+why%2C+where+and+how+to+stop%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcription termination and the control of the transcriptome: why, where and how to stop.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (3), 190-202 (2015).</li>
<li>Jacquier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+eukaryotic+transcriptome%3A+unexpected+pervasive+transcription+and+novel+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The complex eukaryotic transcriptome: unexpected pervasive transcription and novel small RNAs.</a> Nat Rev Genet. 10 (12), 833-844 (2009).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+promoters+generate+pervasive+transcription+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional promoters generate pervasive transcription in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1033-1037 (2009).</li>
<li>Neil, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+bidirectional+promoters+are+the+major+source+of+cryptic+transcripts+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread bidirectional promoters are the major source of cryptic transcripts in yeast.</a> Nature. 457 (7232), 1038-1042 (2009).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+reality+of+pervasive+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The reality of pervasive transcription.</a> PLoS Biol. 9 (7), e1000625(2011).</li>
<li>Goodman, A. J., Daugharthy, E. R., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pervasive+antisense+transcription+is+evolutionarily+conserved+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Pervasive antisense transcription is evolutionarily conserved in budding yeast.</a> Mol Biol Evol. 30 (2), 409-421 (2013).</li>
<li>El Kaderi, B., Medler, S., Ansari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+interactions+between+genomic+loci+through+Chromosome+Conformation+Capture+%283C%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of interactions between genomic loci through Chromosome Conformation Capture (3C).</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 22, Unit22 15(2012).</li>
<li>Core, L. J., Waterfall, J. J., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+RNA+sequencing+reveals+widespread+pausing+and+divergent+initiation+at+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nascent RNA sequencing reveals widespread pausing and divergent initiation at human promoters.</a> Science. 322 (5909), 1845-1848 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול TRO ספציפי הגדיל משמש כאן הותאם מן הפרוטוקול המשמש GRO-Seq (Global לרוץ על-רצף) ניתוח בתאי יונקים 12. אנחנו בהצלחה שונה בפרוטוקול ללמוד שעתוק המתהווה ב ניצני שמרים. כדי לנתח את פגם סיום שעתוק במיוחד, מתאמנים את הפרוטוקול נוסף על ידי להיפטר צעד הידרוליזה RNA. זה מאפשר לנו לזהות את התמלילים המתהווים באורך מלא במיוחד שיזמה מאתר תחילת השעתוק ליד אזור האמרגן. ישנם מספר שלבים קריטיים בפ...

מחזור שעתוק איקריוטיים מורכב משלושה שלבים עיקריים; ייזום, התארכות והפסקה. סיומו של שעתוק על ידי RNA פולימראז II מורכב משני שלבים ברורים, תלויים זה בזה 3. השלב הראשון כולל מחשוף, polyadenylation ושחרור mRNA מהתבנית, והוא ומיד אחריו את השלב השני, בסימן ההתנתקות של פולימראז מהתבנית. סיום נכון הוא קריטי עבור המחזור של פולימראז במהלך חניכה / reinitiation של שעתוק, למניעת הפרעה עם השעתוק של גנים במורד זרם, ולשמירתו שעתוק סוטה לבדוק על ידי הגבלת השעתוק של מתפשט ללא קידוד RNA 4, 5. למרות ההתקדמות שחלה באחרונה, סיום הוא ללא ספק צעד הבין לפחות של מחזור שעתוק RNA פולימראז II. Assay סיום אמין חיוני ללימוד מנגנון underlyinסיום שעתוק g ידי RNA פולימראז II in vivo. מספר גישות ניסיוניות המשמשים לאיתור פגם הסיום ב גן transcribing פעיל בתנאים פיסיולוגיים. אלה כוללים כתם הצפון, שבב גורם סיום (הכרומטין immunoprecipitation) ואת assay TRO המסורתית. כל הטכניקות האלה יש כמה יתרונות וחסרונות. את assay TRO המסורתי היה אמור להיות הגישה האמינה והרגישה ביותר לגילוי פגם סיום שעתוק vivo 1. assay זה localizes מולקולות פולימראז הפעילות יעתיק על אזורים שונים של גן בתוך התא. בתנאים רגילים, assay תערוכות מולקולות פולימראז מעורב תעתיק מופץ אך ורק בין אזור האמרגן terminator של (איור 1 א) הגן. עם הסיום פגום, לעומת זאת, פולימראז הוא לא יודע לקרוא את אות הסיוםוהוא זוהה באזור במורד הזרם של 3 &#39;בסוף של הגן (איור 1B). פגם סיום שעתוק מתבטא בנוכחות פולימראז חוש-בהעתקה שיזמה מאזור האמרגן-הפרוקסימלי, ולהיות מסוגל לקרוא את אות הסיום, ממשיך transcribing באזור במורד הזרם של סוף &#39;3 של גן כפי שמוצג באיור 2A. עם ההכרה כי הגנום האיקריוטים מפגין שעתוק מתפשט המכריע במובן וכן כיוונים אנטי תחושה בתוך ומסביב גן 6, 7, 8, 9, 10, עד מהרה התברר כי assay TRO המסורתי אינו יכול לזהות אם האות פולימראז במורד הזרם של גן מייצג תעתיק ביוזמת האמרגן (איור 2 א) או RNA סוטה שיזמה סוםewhere באמצע הגן או במורד הזרם של אלמנט terminator (איור 2 ב), או בהעתקת פולימראז בכיוון אנטי תחושה מסוף &#39;3 של הגן (איור 2 ג). את assay TRO ספציפי גדיל באמצעות BrUTP המתואר כאן ניתן להבחין אם האות פולימראז readthrough ציין מייצג mRNA במשמעות הרחבה ביוזמת האמרגן או תמליל אנטי במובן זה יזם במורד הזרם של הגן תחת בחינה. השתמשנו בהצלחה את הגישה הזאת כדי להדגים את התפקיד של קינאז Kin28 לסיום שעתוק ניצני שמרים 2. תוך שימוש בגישה כאן אנו מראים כי Rna14 נדרשת להפסקת השעתוק של ASC1 ב ניצני שמרים.

<table><tbody><tr><td>תערובת אלכוהול פנול-כלורופורם-איזואמיל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>77619</td><td>pH 4-5</td></tr><tr><td>מגיב טריזול</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNase, שליה אנושית</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0307S</td><td></td></tr><tr><td>חרוזים נגד BrdU</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-32323AC</td><td></td></tr><tr><td>Protoscript II</td><td>ניו אינגלנד מעבדות</td> <td>ביולוגיותM03368L</td><td>או אנזים שווה ערך</td></tr><tr><td>Advantage 2 פולימראז Mix</td><td>Clontech</td><td>639201</td><td>או אנזים שווה ערך</td></tr><tr><td>5-Bromouridine 5' triphosphate מלח נתרן</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-214314A</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0451AA</td><td></td></tr><tr><td>CTP</td><td></td><td>N0454AA</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td></td><td>N0452AA</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין בסרום בקר טהור במיוחד (BSA)</td><td>MC Labs</td><td>UBSA-100</td><td></td></tr><tr><td>Asc1 B</td><td></td><td></td><td>AGATTCGTCGGTCACAAGTCC</td></tr><tr><td>Asc1 C</td><td></td><td></td><td>GAACTTTATACATATTTAGTT AGCAGTC</td></tr><tr><td>Asc1 D</td><td></td><td></td><td>TGTACATATGTATTTTTTCCAGCA</td></tr><tr><td>Asc1 E</td><td></td><td></td><td>GCCAAGGAGACTGAATTTAATG</td></tr><tr><td>Asc1 F</td><td></td><td></td><td>CTATGGAATGGGGGTTTTAAG</td></tr><tr><td>Asc1 G</td><td></td><td></td><td>GGTTATGGCAGACATGCCAC</td></tr><tr><td>5s cDNA</td><td></td><td></td><td>AGATTGCAGCACCTGAGT</td></tr><tr><td>5' 5s הפוך</td><td></td><td></td><td>GGTTGCGGCCATATCTAC</td></tr><tr><td>3' 5s הפוך</td><td></td><td></td><td>TGAGTTTCGCGTATGGTC</td></tr></tbody></table>

ניתוח של הפסקת תמלול שימוש brutp גדיל ספציפי התמלול run-על (tro) גישה

Analysis of Termination of Transcription Using BrUTP-strand-specific Transcription Run-on (TRO) Approach

כתב יד זה מתאר פרוטוקול לאיתור פגם סיום שעתוק in vivo. פרוטוקול TRO ספציפי הגדיל באמצעות BrUTP המתואר כאן הוא גישה ניסויית עצמה לניתוח פגם סיום שעתוק בתנאים פיסיולוגיים. כמו assay TRO המסורתי, היא מסתמכת על הנוכחות של פולימראז תעתיק פעיל מעבר סוף &#39;3 של גן כאינדיקטור פגם סיום שעתוק 1. זה מתגבר שתי בעיות עיקריות נתקלו עם assay TRO המסורתי. ראשית, הוא יכול לזהות אם פולימראז שקרא את אות הסיום הוא זה שיזם שעתוק מאזור האמרגן-הפרוקסימלי, או אם זה פשוט מייצג פולימראז transcribing pervasively שיזם הלא במיוחד מאיפשהו בגוף או &#39;3 סוף הגן. שנית, הוא יכול להבחין אם אות פולימראז הפעילה תעתיק מעברבאזור terminator הוא באמת mRNA תחושה readthrough transcribing פולימראז או אות רנ&quot;א אנטי במובן הלא קידוד terminator ביוזמת. בקצרה, פרוטוקול כרוך permeabilizing התאים שמרים גדל באופן אקספוננציאלי, מה שמאפשר את תמלילי כי יזם in vivo כדי להאריך בנוכחות של נוקלאוטיד BrUTP, טיהור RNA שכותרתו BrUTP לפי הגישה זיקה, הפוכה טרח להכין את RNA המתהווה מטוהרים הגברה cDNA באמצעות פריימרים גדיל ספציפי איגוף האמרגן ואת אזורי terminator של הגן 2.

כדי להדגים את תחולת הנוהל TRO BrUTP גדיל ספציפי באיתור מום סיום שעתוק, השתמשנו מוטציה סיום-פגום, רגיש בטמפרטורה של RNA14 שנקרא rna14-1. תפקידו של Rna14 לסיום שעתוק על ידי RNA פולימראז II הודגם באמצעות assay TRO המסורתי שמזוהה RNA באזור terminator-הפרוקסימלי של גנים נבחרים 1. הגילוי של אותות RNA מעבר לאזור terminator של מוטצית rna14-1 בטמפרטורת אוֹסְרָנִי נתפרש פגם הסיום. האות ציינה, עם זאת, הייתה ל...

אנו מתארים גישה ניסויית בסיסית לניתוח סיום השעתוק על ידי RNA פולימראז II in vivo באמצעות BrUTP על ידי גישת השעתוק הספציפי לגדיל (TRO) בשמרים ניצנים. ניתן להרחיב פרוטוקול זה לחקר סיום שעתוק על ידי פולימראזות RNA אחרות הן בשמרים והן באיקריוטים גבוהים יותר.

ניתוח של הפסקת תמלול שימוש BrUTP גדיל ספציפי התמלול Run-על (TRO) גישה

This manuscript describes a protocol for detecting transcription termination defect in vivo. The strand-specific TRO protocol using BrUTP described here ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור את סיום השעתוק על ידי RNA פולימראז לשמרים ניצנים בתנאי in vivo על ידי השעתוק הספציפי לגדיל הפועל בגישה. שיטה זו עוזרת לענות על שאלת המפתח האם הפולימראז הפעיל מבחינה שעתוק שזוהה מעבר לשלושת הקצוות הראשוניים של הגן הוא זה שנוצר מאזור המקדם. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא יכולה להבחין בין פולימראז המתעתק של MRNA לבין פולימראז המתעתק באופן נרחב שיזם שעתוקים ויהיה בשלושת הקצה הראשוני של הגן.ניתן להרחיב טכניקה זו כדי לחקור את סיום השעתוק על ידי RNA פולימראז ושמרים אחרים בשל אופי השימור של סיום על ידי פולימראזים שונים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי התפקיד המדויק של גורמי סיום במחזור שעתוק השמרים, ניתן להרחיב אותה גם לחקר סיום באיקריוטים גבוהים יותר. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם חדירות תאים ושעתוק הפועלים על עצירות, מכיוון שהם דורשים ביצוע זהיר, וגם תעתיקים מתהווים יכולים להיות קשים לטיהור.לראשונה קיבלנו את הרעיון לשיטה זו מגישת חיפוש GRO שנותנת תמונת מצב רחבה של הגנום של המיקום של פולימראזים פעילים שעתוק באופן ספציפי לגדיל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שקשה לבצע את ריצת השעתוק וטיהור ה-RNA בשל הכמות הנמוכה והאופי הלא יציב של התעתיקים המתהווים. לפני תחילת השעתוק הפעל על תגובה, גדל, קצור וחלחל תאי שמרים הגדלים באופן אקספונ

analysis-termination-transcription-using-brutp-strand-specific

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

הטלומרים חיוניים יציבות הכרומוזום ואת מבנה הטלומרים G-הסככה חיוני תחזוקה telomerase בתיווך הטלומרים. אימצנו לאחרונה שתי שיטות לאיתור מבנה הטלומרים G-הסככה...

בחינת מבנה ה-G-הסככה הטלומרים ב Trypanosoma brucei</em

RNA פולימראז II מסנתז RNA מבשר שמשתרע מעבר לקצה '3 של ה-mRNA הבוגרת. סוף RNA הבוגר מופק cotranscriptionally, באתר מוכתב על ידי רצפי הרנ"א, באמצעות פעילות endonuclease של מתחם המחשוף. הנה, אנחנו פירוט את השיטה ללמוד תגובות מחשוף במבחנה.

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

אנו מתארים כאן שיטת הארכת פריימר מבוססת פלואורסצנטיות לקביעת נקודות התחלה של שעתוק מתעתיקי חיידקים ועיבוד RNA in vivo באמצעות רצף ג'ל אוטומטי.

טכניקת הארכת פריימר בהתבסס הקרינה לקביעת נקודות התחלת תעתיק ומחשוף אתרים של RNases In vivo

פרוטוקול זה משתמש במכלול שער הזהב ובפלסמיד pGR-blue כדי לכמת במהירות את חוזק הטרמינטורים הנמצאים בסיליקו.

אימות של Terminators ראפיד שימוש פלסמיד PGR-כחול גולדן גייט האסיפה

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

אנו מציגים אסטרטגיה מבוססת RT-PCR על-ידי שילוב מעגלי RT-PCR, כמותי RT-PCR, RNA 5 ' פוליפהוספטאז-טיפול, ואת הכתם הצפוני. פרוטוקול זה כולל שלב נורמליזציה כדי למזער את השפעתה של 5 ' טריפוספט לא יציב, והוא מתאים להפלות ולמיפוי התעתיקים הראשוניים והמעובדים שהצטברו באופן בלתי נשכח במיטוכונמיטוייז.

דיסקציה ומיפוי של התעתיקים הראשוניים והמעובדים בתירס מיטוכונטריון שימוש באסטרטגיה מעגלית-PCR המבוססת על מעגלי

פרוטוקול זה מנחה ביואינפורמטיקה מתחילים באמצעות צינור ניתוח CUT&amp;RUN מבוא המאפשר למשתמשים להשלים ניתוח ראשוני ואימות של נתוני רצף CUT&amp;RUN. השלמת שלבי הניתוח המתוארים כאן, בשילוב עם ביאור שיא במורד הזרם, תאפשר למשתמשים להסיק תובנות מכניסטיות לגבי ויסות הכרומטין.

ניתוח מבוא ותיקוף של נתוני רצף CUT&#38;RUN

בכתב יד זה, אנו מתארים פרוטוקול לבחינה תפקודית של שעתוק ופעילות מעכבת של חומרים אנטיבקטריאליים המכוונים לשעתוק חיידקים.

במבחנת תמלול מבחנים ויישומם ותרופות דיסקברי

Metagenomics שימש לחקירת המיקרוביום של מזון בקר תחמיץ. הניתוח בוצע על ידי ריצוף רובה ציד. גישה זו שימשה לאפיון הרכב הקהילה המיקרוביאלית בתוך מזון הבקר.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

למדו לנתח הפסקת תמלול על ידי RNA polymerase II בשמרים תוך שימוש בגישת TRO ספציפית לגדיל ו-BrUTP. שיטה זו מאפשרת להבחין בין פולימראזים שונים ולחקור גורמי סיום בתמלול.

ניתוח של הפסקת תמלול שימוש BrUTP גדיל ספציפי התמלול Run-על (TRO) גישה

גלה סרטונים נוספים