ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE
16 במאי 2017
מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד cryo-EM תמונות באמצעות חבילת תוכנה SPHIRE. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם עבור כמעט כל חלקיקים יחיד פרויקטים EM כי היעד ברזולוציה אטומית כמעט.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את המבנה של קומפלקסים מקרומולקולריים על ידי ניתוח חלקיקים בודדים של נתוני קריו-מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות תוכנת עיבוד התמונה SPHIRE. cryo-EM של חלקיק בודד הופך לטכנולוגיה מיינסטרים לחקר מבנים מקרומולקולות ברזולוציה כמעט אטומית. SPHIRE היא חבילת תוכנה חדשנית המאפשרת עיבוד אוטומטי למחצה של נתוני cryo-EM בצורה ידידותית למשתמש.
היתרון העיקרי של SPHIRE הוא מנגנון התיקוף האוטומטי. רוב ההליכים צריכים להיות מופעלים פעם אחת בלבד, והתוצאות הן אובייקטיביות וניתנות לשחזור. ניתן להשתמש ב-cryo-EM ברזולוציה גבוהה כדי למקם שאריות בודדות, ובכך לספק תובנה מכרעת לגבי הארגון והתפקוד של מכונות מיקרו-מולקולריות מורכבות.
אנשים חדשים בשיטה זו צריכים לזכור שהשגת מבנה ברזולוציה גבוהה תלויה מאוד באיכות המדגם ובנתוני הקלט. כדי להתחיל להשתמש ביישום SPHIRE, פתח את ממשק המשתמש הגרפי מהטרמינל. פתח את כלי השירות כדי להציג תמונת מיקרוסקופיה קריו עם e2display.
השתמשו בכלי המדידה המובנה כדי למדוד את ציר החלקיקים הארוך ביותר באנגסטרום לפיקסל. פתח את הגדרות הפרויקט. הגדר את גודל חלון CTF לפחות לגודל תיבת החלקיקים.
הגדר את גודל קופסת החלקיקים למספר זוגי, לפחות פי 1 וחצי מקוטר החלקיקים. הגדר את רדיוס החלקיקים לפחות למחצית מהאורך הנמדד. הזן את הסימטריה של קבוצת הנקודות, אם ידועה, ואת המסה המולקולרית המשוערת.
רשום את ההגדרות. לאחר מכן, בתפריט סרט, פתח את יישור הסרט של מיקרוגרף. הגדר את נתיבי קובץ ההפעלה unblur ו-summovie.
בחרו סרטון מיקרוגרף גולמי לא מיושר, והחליפו את משתנה שם הקובץ בתו כללי לקביעת תבנית נתיב המיקרוגרף הקלט. תן שם לספריית הפלט. מלא את מספר מסגרות הסרט, מתח המיקרוסקופ והחשיפה לכל פריים.
הפעל את התהליך כדי ליצור מיקרוגרפים ממוצעים מתוקנים תנועה משוקללים במינון וללא מינון משוקלל. לאחר מכן, פתח את תפריט CTER ובחר הערכת CTF. הגדר את המיקרוגרפים הלא משוקללים במינון כקלט.
תן שם לספריית הפלט ומלא את פרמטרי איסוף הנתונים. הגדר את התדר הנמוך ביותר ל-0285 אנגסטרומים הפוכים ואת התדר הגבוה ביותר ל-0.285 אנגסטרומים הפוכים. הפעל את התהליך כדי ליצור רשימה של פרמטרים של CTF.
לאחר מכן, פתח את תפריט WINDOW ובחר בחירת חלקיקים. הגדר את המיקרוגרפים המשוקללים במינון כקלט, והפעל את כלי השירות e2boxer. בצע איסוף חלקיקים באופן ידני או אוטומטי.
חלץ את החלקיקים שנבחרו לערימות תמונות, ושלב את הערימות לערימת תמונות וירטואלית אחת במסד נתונים BDB. לאחר איסוף החלקיקים ונערמים, פתח את תפריט ISAC ובחר אשכולות ISAC דו-ממדיים. הגדר את ערימת התמונות הווירטואלית במסד הנתונים BDB כקלט.
העריכו את מספר התמונות בכל מחלקה. מלאו את הפרמטרים הנותרים וצרו את ממוצעי המחלקות הדו-ממדיות. לאחר השלמת הסיווג הדו-ממדי, השתמש בכלי השירות Display Data כדי להציג את ממוצעי המחלקות הניתנים לשחזור המאומתים.
ודא שמיוצגים כיווני חלקיקים מרובים ושממוצעי הכיתה הם באיכות משביעת רצון. צור ערימת תמונות וירטואלית חדשה המכילה רק חלקיקים השייכים לממוצעי המחלקות המאומתים. לאחר מכן, פתח את תפריט VIPER והשתמש בכלי השירות Display Data כדי להציג את ממוצעי המחלקות.
מחק ממוצעי מחלקות באיכות ירודה או המציגים תצוגות זהות של החלקיק. שמור את ממוצעי הכיתה הנותרים בקובץ חדש. לאחר מכן, בחר RVIPER מודל תלת מימד ראשוני, והשתמש במבחר הקטן של ממוצעי מחלקות כקלט.
הפעל את הפקודה כדי ליצור מודל תלת מימד ראשוני הניתן לשחזור של החלבון. בדוק את המודל בתוכנת הגרפיקה המולקולרית Chimera. השווה את המודל למבנה ידוע של חלבון הומולוגי או תחום מהחלבון המבוקש.
חזור לתפריט VIPER ב-SPHIRE, ובחר Create 3D Reference. צרו מודל ייחוס תלת-ממדי ראשוני עם גודל הפיקסלים הנכון ומסיכה תלת-ממדית. פתחו את תפריט MERIDIEN ובחרו 3D Refinement.
מלאו את אוסף תמונות הקלט ואת הנתיבים הראשוניים של קובצי ההפניה התלת-ממדיים. תן שם לספריית הפלט והגדר את המסיכה של דגם הייחוס כמסיכה התלת-ממדית. בחרו Apply hard 2D mask (החל מסיכה דו-ממדית קשה).
קבעו את רזולוציית ההתחלה ל- 20 עד 25 אנגסטרומים, והפעילו את הליטוש התלת-ממדי כדי להפיק את חצאי הכרכים הלא מסוננים. לאחר מכן, צפו בחצי נפח לא מסונן ב-Chimera. קבע סף בינאריזציה שבו כל צפיפויות החלבון מחוברות אך חפצי רעש לא.
חזרו לתפריט MERIDIEN של SPHIRE, ופתחו את Adaptive 3D Mask. הזן את סף הקלט והבינאריזציה של חצי אמצעי האחסון הלא מסוננים. תן שם למסיכת הפלט והפעיל את התהליך ליצירת מסיכה תלת-ממדית עם קצוות רכים.
לאחר מכן, פתח את חידוד ובחר את שני חצאי הכרכים הלא מסוננים. הגדר את המסיכה התלת-ממדית בעלת חצי הנפח הרך כמסיכה המסופקת על ידי המשתמש. הפעל את התהליך הממזג את חצאי הכרכים ולאחר מכן מסנן ומחדד את הנפח הממוזג.
פתח את קובץ יומן הרישום כדי להציג את הערכת הרזולוציה הסופית. צור מפה תלת-ממדית של ההתפלגות הזוויתית של החלקיקים של ערימת תמונות הקלט שנוצרה במהלך עידון תלת-ממדי. פתחו את הדגם התלת-ממדי המושחז והמסונן ב-Chimera.
בדוק את מפת הצפיפות ואת התכונות ברזולוציה הגבוהה שלה. פתח את ההתפלגות הזוויתית בכימרה, וודא שזוויות אוילר מפוזרות איזוטרופית. פתח את התפריט SORT3D ובחר 3D Variability Estimation.
צור מפת שונות תלת מימדית מהערימה הווירטואלית של תמונות חלקיקים השייכות לממוצעי המחלקה המאומתים. צור מסיכת תלת מימד בינארית ממפת שונות זו עבור האשכולות התלת-ממדיים הממוקדים הבאים. לאחר מכן, פתח את 3D Clustering RSORT3D ובחר את הספרייה של חידוד התלת-ממד הקודם כקלט.
תן שם לספריית הפלט והגדר את המסיכות התלת-ממדיות הכלליות והממוקדות. השתמש ב- 5,000 עד 10,000 תמונות לפחות בכל קבוצה עבור ערכות נתונים גדולות. הפעל את תהליך המיון כדי ליצור נפחים של כל קבוצה תלת-ממדית הומוגנית.
השתמשו ב-Chimera כדי לזהות את המבנה בעל הרזולוציה הגבוהה ביותר לכאורה. חזור לתפריט SORT3D ב-SPHIRE, ופתח את Local Subset Refinement. הגדר את נתיב קובץ הטקסט של קבוצת המשנה לקובץ אשכול מזהה החלקיקים המתאים למבנה הרזולוציה הגבוהה ביותר.
הגדר את ספריית המיקוד בתלת-ממד לספרייה המכילה את חצאי אמצעי האחסון הלא מסוננים ואת האיטרציה של ההפעלה מחדש לאיטרציה ברזולוציה הגבוהה ביותר מהעידון התלת-ממדי הקודם. הפעל את הפקודה כדי ליצור חצאי אמצעי אחסון מקומיים לא מסוננים. לאחר מכן, צרו מסיכה תלת-ממדית עם קצוות רכים מאחד מחצאי הנפחים המקומיים.
מזג את חצאי אמצעי האחסון המקומיים וחידד את אמצעי האחסון הממוזג מבלי להחיל מסנן מעביר נמוך. לאחר מכן, פתח את תפריט LOCALRES ולחץ על רזולוציה מקומית. בחר את חצאי הכרכים המקומיים.
לאחר מכן, בחרו במסיכה המקומית עם קצוות רכים. קבעו את הרזולוציה הכוללת לרזולוציה המוחלטת המוערכת בשעת חידוד אמצעי האחסון המקומי הממוזג. חשב את הרזולוציה המקומית של אמצעי האחסון.
לאחר מכן, פתח את המסנן המקומי התלת-ממדי. הגדר את עוצמת הקול המקומית המושחזת והלא מסוננת כקלט. בחרו במפת הרזולוציה המקומית ובמסיכה התלת-ממדית עם קצוות רכים.
החילו את מסנן הרזולוציה המקומית על אמצעי האחסון המושחז כדי להפיק את הדגם התלת-ממדי הסופי. פתח את מפת הנפח והרזולוציה המקומית שהתקבלה ב-Chimera. הפעל את צבע פני השטח כלי, ובחר את עוצמת הקול מהתפריט ואת האפשרות לצבוע את המשטח בהתאם לרזולוציה המקומית.
קומפלקס הרעלן TcdA1 צולם במיקרוסקופיה. כל התמונות הראו בבירור חלקיקים בודדים וטבעות תון המשתרעות לרזולוציה של יותר מארבעה אנגסטרומים בספקטרום ההספק. החלקיקים נבחרו באמצעות e2boxer ולאחר מכן חולצו לערימת תמונות.
ממוצעי מחלקות דו-ממדיים נוצרו על ידי יישור יציב איטרטיבי ואשכולות, או ISAC. ממוצעי מחלקות אלה שימשו לחישוב מודל תלת מימד הניתן לשחזור עם RVIPER. מודל זה הסכים היטב עם מבנה הגביש שנפתר בעבר של TcdA1.
חידוד תלת מימד אוטומטי של מודל זה באמצעות MERIDIEN יצר רזולוציה כמעט אטומית map. 3D ניתוח שונות הצביע על גמישות מקומית של אזור מסוף ה-N המתויג בהיסטידין, תחומי קשירת הקולטנים ותחום קשירת ה-TcB. בוצעו חישובי רזולוציה מקומית.
המודל המושחז סונן מקומית והוחל סולם צבעים המתאים לרזולוציה המקומית, המראה התאמה טופולוגית בין אזורים בעלי שונות גבוהה ואזורים ברזולוציה נמוכה. מבנה ה-cryo-EM הסופי ברזולוציה של 3.5 אנגסטרום של TcdA1 הראה צפיפות ברורה עבור רוב שרשראות הצד. מפת צפיפות עם רמת פירוט זו יכולה לשמש עוד לבניית מודל אטומי דה נובו.
באמצעות גישה זו, ניתן להשיג מבנה ברזולוציה כמעט אטומית תוך שעות או מספר ימים, ללא מידע מבני אפריורי. בעת ניסיון הליך זה, השתמש רק בנתונים באיכות גבוהה ובדוק את תוצאות הביניים. הטרוגניות קומפוזיציונית ומבנית של דגימת ה-cryo-EM עשויה להיות גורם מגביל להשגת רזולוציה כמעט אטומית.
לאחר צפייה בסרטון זה, כעת אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד להשתמש ב-SPHIRE לקביעה מבנית של cryo-EM. כפי שראית, שגרות האשכולות הכלולות ב-SPHIRE יאפשרו לך לא רק לפתור את מבנה החלבון המעניין, אלא גם לחקור דינמיקה קונפורמציונית ולספק תובנה מכניסטית מכרעת לגבי מנגנונים מולקולריים מורכבים.
סקירה כללית
מסמך זה מציג פרוטוקול לעיבוד תמונות cryo-EM באמצעות חבילת התוכנה SPHIRE. שיטה זו חלה על פרויקטים של חלקיקים בודדים EM המכוונים לרזולוציה כמעט אטומית.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה מבנית
- מיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית
- עיבוד תמונה
רקע
- קריו-EM של חלקיק בודד היא טכנולוגיה מרכזית לחקר מבנים מקרומולקולריים.
- SPHIRE מציעה גישה חצי אוטומטית לעיבוד נתונים של קריו-EM.
- הפרוטוקול מדגיש את החשיבות של איכות הדגימה להשגת תוצאות ברזולוציה גבוהה.
- SPHIRE כוללת מנגנון אימות אוטומטי לשחזור.
מטרת המחקר
- לספק פרוטוקול מפורט לעיבוד תמונות קריו-EM.
- להקל על קביעת מבני מתחמי מקרומולקולות.
- לשפר את נגישות טכניקות הקריו-EM לחוקרים.
שיטות בשימוש
- שימוש בתוכנת SPHIRE לעיבוד תמונות.
- הפרדת חלקיקים ידנית ואוטומטית מתמונות קריו-EM.
- סיווג דו-ממדי ויצירת מודל תלת-ממדי.
- חידוד תלת-ממדי והערכת שונויות לרזולוציה משופרת.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של מודלים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה של חלבונים.
- אימות של ממוצעי סיווג וכיווני חלקיקים.
- קביעת פרוטוקול שחזור לעיבוד נתוני קריו-EM.
- זיהוי של מבנים ברזולוציה גבוהה לכאורה.
מסקנות
- הפרוטוקול של SPHIRE מייעל משמעותית את עיבוד תמונות הקריו-EM.
- נתוני קלט באיכות גבוהה הם חיוניים להשגת תוצאות אמינות.
- שיטה זו משפרת את ההבנה של מבנים מקרומולקולריים מורכבים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Cryo-EM enables near-atomic resolution structural determination of macromolecular complexes, providing critical insights for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. SPHIRE streamlines this process through semi-automated workflows and objective validation, reducing barriers for novice users and enhancing reproducibility across teams. This supports predictive confidence in structural biology inputs for lead identification and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving macromolecular structures at near-atomic resolution.
- Operational Value: Provides reproducible 3D models from as few as 9,500 particles, supporting rapid target validation cycles.
- Predictive Value: Facilitates mechanistic de-risking by visualizing side-chain densities and conformational dynamics in toxin complexes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated, noise-free atomic models suitable for structure-based assay design.
- Operational Value: Standardizes particle picking and classification through GUI-controlled, semi-automated pipelines.
- Reproducibility: Automatic validation ensures objective results across users and sites, enabling assay standardization.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical by delivering high-resolution models for docking and mutagenesis studies.
- Mechanistic Insight: Reveals localized flexibility in domains such as receptor-binding regions, informing functional assays.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables evaluation of structural heterogeneity that may impact developability.
Pipeline & Workflow Integration
SPHIRE integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by delivering high-resolution structural data that informs compound design and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via 3D variability analysis and local resolution mapping to assess conformational states.
- Screening: Delivers standardized, dose-weighted micrographs and class averages for reliable particle preparation.
- Analytics: Provides quantitative outputs including resolution estimates, angular distribution, and variability maps for data-driven decisions.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by producing sharpened, locally filtered 3D models suitable for atomic model building.
- Enterprise Reuse: GUI-driven workflow allows reuse across projects with minimal retraining, promoting platform standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Near-atomic resolution models reduce mechanistic ambiguity in target engagement studies.
- Operational Value: Semi-automated processing minimizes user intervention and increases throughput.
- Strategic Value: Objective validation improves go/no-go decisions by reducing structural uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of targets with validated structural models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in structural biology and cryo-EM sample preparation.
- Depends on GPU-accelerated workstations for 3D refinement and variability analysis.
- Necessitates standardized data collection parameters (voltage, exposure, defocus) across teams.
- Performance limited by sample heterogeneity and preferential orientation.
- Relies on external tools like Chimera for visualization and validation.
