Name: ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: למד לעבד תמונות cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות תוכנת SPHIRE לניתוח חלקיקים יחידים. שיטה זו מאפשרת לקבוע מבנים מולקולריים מורכבים בדיוק אטומי ולחקור דינמיקה קונפורמציונלית של חלבונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ד רודרר על מתן לנו microdraphs TcdA1. אנו מודים לסטיב לודקה על תמיכתו המתמשכת בתשתית EMAN2. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות של החברה מקס פלנק (ל SR) לבין המועצה האירופית במסגרת תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7 / 2007-2013) (מענק מס &#39;615984) (ל SR) ומענק של המכונים הלאומיים של בריאות R01 GM60635 ל PAP).

<ol><li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li>
<li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).</li>
<li>Bai, X. -C., Yan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+structure+of+human+%CE%B3-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An atomic structure of human γ-secretase.</a> Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).</li>
<li>Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+a+human+cytoplasmic+actomyosin+complex+at+near-atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution.</a> Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).</li>
<li>von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+F-actin-tropomyosin+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the F-actin-tropomyosin complex.</a> Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).</li>
<li>Tang, G., Peng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+the+IMAGIC+image+processing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new generation of the IMAGIC image processing system.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Shaikh, T. R., Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).</li>
<li>Hohn, M., Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPARX%2C+a+new+environment+for+Cryo-EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).</li>
<li>Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+an+integrated%2C+database-driven+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).</li>
<li>de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>Grant, T., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+optimal+exposure+for+single+particle+cryo-EM+using+a+2.6+%C3%85+reconstruction+of+rotavirus+VP6%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6.</a> eLife. 4, 06980(2015).</li>
<li>Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera%3FA+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).</li>
<li>Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTER-rapid+estimation+of+CTF+parameters+with+error+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment.</a> Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).</li>
<li>Frank, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrank%2C+J+%22Three-Dimensional+Electron+Microscopy+of+Macromolecular+Assemblies%22">Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies</a>. , Oxford University Press. (2006).</li>
<li>Woolford, D., Ericksson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwarmPS%3A+rapid%2C+semi-automated+single+particle+selection+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).</li>
<li>Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iterative+Stable+Alignment+and+Clustering+of+2D+Transmission+Electron+Microscope+Images%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%2FFolding+and+Design%22%5BJournal%5D)">Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images.</a> Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+insertion+of+a+Tc+toxin+in+near-atomic+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail.</a> Nature Publishing Group. , (2016).</li>
<li>Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syringe-like+injection+mechanism+in+Photorhabdus+luminescens+toxins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins.</a> Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).</li>
<li>Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Tc+toxin+action+revealed+in+molecular+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail.</a> Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).</li>
<li>Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+focused+classification%2C+based+on+the+bootstrap+3D+variance+analysis%2C+and+its+application+to+EF-G-dependent+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation.</a> Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).</li>
<li>Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+revolution+will+not+be+crystallized%3A+a+new+method+sweeps+through+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology.</a> Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

חלקיק יחיד cryo-EM הראו התפתחות מהירה בשנים האחרונות ומסירת מבנים ברזולוציה אטומית רבים של קומפלקסים macromolecular של משמעות ביולוגית גדולה 25 . כדי לתמוך במספר גדול של משתמשים מתחילים, כי כרגע הם נכנסים לשדה, פיתחנו את החלקיקים תמונה אחת ניתוח פלטפורמת SPHIRE ולהציג כאן פרוטוקול דרך לאורך כל העבודה כולל יישור הסרט, בחירת החלקיקים, הערכה CTF, המודל הראשוני חישוב, 2D ו 3D ניתוח הטרוגניות, ברזולוציה גבוהה 3D חידוד ואומדן ברזולוציה המקומית וסינון. הפרוטוקול המתואר כאן נועד כמדריך קצר לקביעת מבנה 3D באמצעות microoraphs cryo-EM של החלבון של עניין ועם עזרה של כלי חישוב הניתנים על ידי GUI עצמאית של SPHIRE. התכונה העיקרית של זרימת העבודה היא כי ביותרשל נהלים צריך להיות מופעל רק פעם אחת, שכן הם מסתמכים על הרעיון של אימות על ידי reproducibility 19 ו אינם דורשים פרמטר tweaking. מנגנון אימות אוטומטי זה הוא היתרון העיקרי של SPHIRE על גבי חבילות תוכנה אחרות מאז התוצאות נוטות להיות אובייקטיביות כמו גם לשחזור, והכי חשוב, להשגה במחיר חישוב מקובל. צינור מספק בנוסף שפע של מידע אבחון עבור משתמשים מנוסים לבצע אימות עצמאית נוספת עם שיטות משלו. עם זאת, משתמש טירון שיש לו לפחות רקע תיאורטי בסיסי ביולוגיה מבנית ומיקרוסקופ אלקטרונים אמור להיות מסוגל לקבל מבנים ברזולוציה אטומית כמעט באמצעות נתונים משלו ואת הליכי אימות אוטומטיים. עם זאת, קבלת מבנה ברזולוציה אטומית כמעט לא תמיד פשוטה והתוצאה תהיה תלויה מאוד באיכות המדגם ואת קלט datא. עבור הנהלים המוצגים כאן, ההנחה היא כי כמות מספקת של סרטים באיכות גבוהה גלם לא משויך EM זמינים, עם ממוצעים שלהם מראה בבירור חלקיקים הומוגניים יחיד מכוונת אקראית. באופן כללי, אין מגבלות לגבי הסימטריה, הגודל או הצורה הכוללת של המולקולה, אך משקל מולקולרי נמוך יכול להיות גורם מגביל, במיוחד כאשר לחלבון יש צורה גלובלית חסרת תכונות. בדרך כלל, ניתוח של חלקיקים גדולים, מסודרים היטב עם סימטריה קבוצתית גבוהה הוא פחות תובעני. לכן, זה מאוד ממליץ למשתמשים מתחילים להפעיל את הפרוטוקול הנוכחי הראשון עם מאופיין היטב cryo-EM dataset. או את הנתונים SPHIRE הדרכה (http: /sphire.mpg.de) או אחד הנתונים EMPIAR שהוגשו (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) עם סרטים גולמיים הם נקודת התחלה טובה . כאשר עיבוד הנתונים עצמו, סביר מאוד כי כמה מערכי נתונים או חלק מהתמונות לא יספק quali מסוימיםקריטריונים. בהקשר זה, בנוסף בדיקות אוטומטיות יציבות לשחזור, המבוצעת על ידי התוכנית בשלבים העיקריים של זרימת העבודה, הוא עדיין ממליץ למשתמשים לבחון ויזואלית את התוצאות &quot;מחסומים&quot; מסוימים של הפרוטוקול, במיוחד אם השחזור הסופי אינו מספק. הבדיקה החזותית הראשונה יכולה להתבצע ברמת המיקרוגרף לאחר יישור הסרט ( שלב 2 בפרוטוקול) והערכת ה- CTF ( שלב 3 של הפרוטוקול). ממוצעים המתקבלים בתנועה, צריכים להראות בבירור חלקיקים בודדים המופרדים היטב, וספקטרום הכוח שלהם צריך להראות בבירור את הטבעות האיזוטרופיות. התדר המרחבי אליו הם נראים מגדיר, ברוב המקרים, את הרזולוציה הגבוהה ביותר שעליה ניתן לקבוע את המבנה באופן עקרוני בסופו של דבר. דוגמאות לממוצע מתוקן בתנועה של איכות מספקת וספקטרום הכוח שלה מוצגים בסעיף &amp; #34. תוצאות נציג &quot;.תמונות חריגות יותר אשר עשויה להיות השפעה שלילית על התוצאה הסופית ניתן להסיר בעזרת ספייר של להיסחף ו- CTF הערכה GUI כלים (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php). לגבי ההקרנה החלקיקים, השלב המכריע בצינור SPHIRE הוא סיווג 2D באמצעות ISAC ( שלב 5.2 פרוטוקול) . כאן, המשתמש צריך לשלוט כי ממוצעים בכיתה 2 לשחזור מזוהות באופן אוטומטי על ידי התוכנית לאמץ מגוון של אוריינטציות מספיק כדי באופן שווה באופן שווה לכסות את המרחב הזוויתי. אם איכות ממוצעי הכיתה אינה משביעת רצון (תמונות רועשות ו / או מטושטשות) ו / או מספר ממוצעים בכיתה לשחזור הוא נמוך מאוד, שקול לשפר את איכות לקטוף אוטומטי, אופטימיזציה הדמיה dataset או הכנת המדגם. ברוב המקרים, לא ניתן לחשב שחזור אמין ממערכת נתונים שאינה מניבה ממוצעים מעמדיים דו-ממדיים טובים. דוגמאות של איכות גבוהה בכיתה 2 aveזעזועים מוצגים בסעיף &quot;תוצאות נציג&quot;. לפחות 100 ממוצעים מחלקה נדרשים כדי לקבל מודל תלת-ממד אמין ראשוני באמצעות RVIPER באופן אוטומטי ( שלב שלב 6.1 ). בשלב זה, המשתמש צריך לבחור את הממוצעים עם האיכות הגבוהה ביותר וכוללים כמו אוריינטציות שונות של החלקיקים ככל האפשר. איכות המודל הראשוני הוא קריטי להצלחתו של חידוד 3D ברזולוציה גבוהה. בחבילות תוכנה אחרות, סיווג 3D מבוצע לעתים כדי להסיר &quot;רע&quot; חלקיקים 8 , 9 . עם זאת, ב SPHIRE רוב החלקיקים האלה בוטלו באופן אוטומטי כבר במהלך סיווג 2D באמצעות ISAC. לכן, מומלץ לבצע את שלב אינטנסיבית חישובית של מיון 3D רק אם השחזור ואת ניתוח השתנות 3D מצביעים על הטרוגניות של הנתונים. והכי חשוב, המשתמש צריך תמיד לבדוק בקפידה את הכרכים 3D שהתקבלו בזהירות ( שלב שלב 9.3 ), ולאשר כי התכונות של צפיפות בהתאמה מסכימים היטב עם ההחלטה הנומינלית. ברזולוציה של &lt;9 Å, צפיפות דמוית מוט המקביל ל α-סלסלות להיות גלוי. ברזולוציה &lt;4.5 Å, צפיפות המקביל לגדילים ב β- גיליונות מופרדים בדרך כלל היטב חומצות אמינו מגושם להיות גלוי. מפה ברזולוציה גבוהה (&lt;3 Å) צריכה להראות שרשראות צד ברורות, ובכך לאפשר בניית מודל אטומי מדויק. תוצאות שהתקבלו עד כה להוכיח כי, בעזרת מבחני שחזור אוטומטי של SPHIRE בדיקות ויזואליות מינימלי, הפרוטוקול הנוכחי הוא ישים בדרך כלל לכל סוג של פרוייקט יחיד cryo-EM חלקיק. תוצאות נציג של כל שלב עיבוד מוצגים עבור שחזור של רעלן TCDA1 שלPhotorhabdus luminescens 21 , אשר נפתרה ברזולוציה אטומית כמעט. מפות צפיפות של איכות דומה ניתן להשתמש כדי לבנות מודלים אטומיים אמין על ידי השד נובו דה novo כמו גם עידון הדדי או שטח אמיתי, ובכך לספק מסגרת מבנית מוצק להבנת מנגנונים מולקולריים מורכבים. קודי גישה: הקואורדינטות עבור המבנה EM ואת הסרטים unprocessed הופקדו אלקטרונים מיקרוסקופית נתונים הבנק ואת מיקרוסקופית אלקטרונים פיילוט תמונה ארכיון תחת מספרי ההצטרפות EMD-3645 ו EMPIAR-10089, בהתאמה.

לאחר הפיתוח של טכנולוגיית גלאי האלקטרונים הישירה, ההתקדמות המדהימה של חלקיק יחיד cryo-EM כרגע עיצוב מחדש ביולוגיה מבנית 1 . לעומת קריסטלוגרפיה רנטגן, טכניקה זו דורשת רק כמות קטנה של חומר חלבון ללא צורך התגבשות, בעת ובעונה אחת מציב פחות מגבלות לגבי טוהר המדגם ועדיין המאפשר קביעת מבנים ברזולוציה אטומית כמעט. חשוב לציין, קומפוזיציות או מדינות שונות יכולות כעת להיות מופרדות באופן חישובי וקביעת המבנה של הקונפורמיות השונות יכולה להתבצע ברמה חסרת תקדים של פירוט. לאחרונה, מפות צפיפות של מולקולות מאתגרות יכול להיות מיוצר על החלטות המאפשר בניית מודל novo ובכך הבנה עמוקה של מצב הפעולה שלהם 2 , 3 , 4 , 5. מגוון רחב של עיבוד תמונה חבילות תוכנה זמינים 3DEM (3D אלקטרונים מיקרוסקופיה) הקהילה (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) ורובם נמצאים תחת פיתוח מתמשך. רזולוציה כמעט אטומית הושגה עבור חלבונים המציגים משקולות מולקולריות שונות וסימטריות עם מספר חבילות תוכנה שונות, כולל EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 ו- SPARX 11 . כל חבילה דורשת רמה אחרת של מומחיות המשתמש ומספקת רמה אחרת של הדרכה למשתמש, אוטומציה והרחבה. יתר על כן, בעוד כמה תוכניות לספק סביבות מלאות כדי להקל על כל השלבים של ניתוח התמונה, אחרים נועדו לייעל משימות ספציפיות, כגון חידוד של פרמטרים יישור החל מ r ידועמבנה האספקה. לאחרונה, פותחו מספר פלטפורמות, כולל APPION 12 ו- SCIPION 13 , המספקות צינור עיבוד יחיד המשלב גישות ופרוטוקולים מחבילות התוכנה השונות המפורטות לעיל. כדי לתרום לפיתוח הנוכחי של cryo-EM, SPARX פותחה מחדש לתוך פלטפורמת עצמאית חדשה מלאה עבור ניתוח חלקיקים בודדים, הנקראת SPHIRE (SPARX למיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה). על מנת להגביר את הנגישות של הטכניקה לחוקרים חדשים בתחום ולהתמודד עם כמות גדולה של נתונים המיוצרים על ידי מיקרוסקופים אלקטרונים מודרניים לחלוטין אוטומטיים מתקדמים, צינור העיבוד עוצב מחדש ופשוט על ידי הצגת קל לשימוש ממשק משתמש גרפי (GUI) ואוטומציה של השלבים העיקריים של זרימת העבודה. יתר על כן, אלגוריתמים חדשים נוספו כדי לאפשר מהיר, לשחזור אוטומטי קביעת מבנה מ crYo-EM תמונות. יתר על כן, אימות על ידי reproducibility הוכנס על מנת למנוע artifacts משותף המיוצר במהלך חידוד וניתוח הטרוגניות. למרות שהתוכנית השתנתה במידה ניכרת, תכונות הליבה המוערכות שלה נשמרו: קוד פתוח של קוד פתוח, עיצוב מודרני מונחה עצמים וממשקי Python עבור כל הפונקציות הבסיסיות. לכן, זה לא השתנה לתוך תוכנית קופסה שחורה, המאפשר למשתמשים ללמוד בקלות לשנות את קוד Python, כדי ליצור יישומים נוספים או לשנות את זרימת העבודה הכוללת. זה שימושי במיוחד עבור פרויקטים שאינם סטנדרטיים cryo-EM. כאן אנו מציגים פרוטוקול להשגת מפת אטומי ברזולוציה אטומית כמעט מ cryo-EM תמונות באמצעות GUI של SPHIRE. הוא מתאר בפירוט את כל השלבים הנדרשים כדי ליצור מפה צפיפות מ cryo-EM ישיר גלאי סרטים אינו מוגבל לכל סוג מקרומולקולה מסוים. פרוטוקול זה בעיקר מתכוונת להדריך newcOmers בתחום באמצעות זרימת עבודה ולספק מידע חשוב על צעדים מכריעים של העיבוד, כמו גם כמה מכשולים אפשריים ומכשולים. תכונות מתקדמות יותר ואת הרקע התיאורטי מאחורי SPHIRE יתוארו במקומות אחרים.

<table><tbody><tr><td></td><td>מכון SPHIRE מקס פלאנק לפיזיולוגיה מולקולרית - דורטמונד&nbsp; ובית הספר לרפואה של יוסטון, יוסטון, טקסס&nbsp;</td><td></td><td>http://sphire.mpg.de</td></tr><tr><td>UCSF Chimera</td><td>University of California, סן פרנסיסקו</td><td></td><td>http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/</td></tr> <tr><td>Unblur</td><td>Janelia Farm Research Campus, Ashburn</td><td></td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/unblur</td></tr><tr><td>Coot</td><td>MRC Laboratory of Molecular Biology, &nbsp; קיימברידג'</td><td>http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td> EMAN2 מכללת ביילור לרפואה, יוסטון http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 אשכול מחשוב עם 1824 ליבות אשכול לינוקס של מכון מקס פלאנק לפיזיולוגיה מולקולרית עם 76&nbsp; צמתים, כל אחד עם 2 מעבדים Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz ו-128 Gb זיכרון RAM TITAN KRIOS מיקרוסקופ אלקטרונים&nbsp <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>;</td><td>FEI</td><td></td><td>300 קילו וולט, תיקון CS,</td></tr><tr><td>גלאי אלקטרונים ישיר XFEG Falcon II</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU (תוכנה אוטומטית לרכישת נתונים)</td><td>FEI</td><td></td><td>https://www.fei.com/software/epu/</td></tr></tbody></table>

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים cryo-microscopy תמונות באמצעות sphire

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIX (SPARX למיקרוסקופ אלקטרונים ברזולוציה גבוהה) הוא קוד פתוח חדש, חבילת תוכנה ידידותית למשתמש לעיבוד אוטומטי למחצה של חלקיקים בודדים של קריאת מיקרוסקופ אלקטרונים (cryo-EM). הפרוטוקול המוצג כאן מתאר בפירוט כיצד להשיג מבנה אטומי ברזולוציה כמעט החל cryo-EM סרטים micrograph ידי הדרכת משתמשים בכל השלבים של צינור יחיד קביעת מבנה החלקיקים. צעדים אלה נשלטים מממשק המשתמש הגרפי החדש של SPHIRE ודורשים התערבות משתמש מינימלית. באמצעות פרוטוקול זה, מבנה 3.5 Å של TcdA1, מורכב רעלן Tc מ luminescens Photorhabdus , נגזר רק 9500 חלקיקים בודדים. גישה זו יעילה יעזור למשתמשים טירון ללא ניסיון עיבוד נרחב מידע מבניים מראש , כדי להשיג מודלים ללא אטום ללא רעש וללא משוא פנים של קומפלקסים macromolecular מטוהרים שלהם במדינה יליד.

<html> הפרוטוקול המתואר לעיל בוצע החל 112 סרטים גלאי ישיר של רכיב A של Photorhabdus luminescens Tc מורכבות (TcdA1) 20 , 21 , 22 . מערך נתונים זה הוקלט על מיקרוסקופ קרינה אלקטרונים עם מיקרוסקופ אלקטרונים בעל שדה בהירות גבוהה (XFEG), הפועל במתח תאוצה של 300 קילו וולט. התמונות נרכשו באופן אוטומטי עם מינון כולל של 60 e - / Å -2 בגודל פיקסל של 1.14 Å על סולם הדגימה. לאחר היישור של מסגרות הסרט ( שלב 2 פרוטוקול ), המתקבל תיקון ממוצעים שהתקבלו היו טבעות איסוטרופי Thon מרחיב ברזולוציה גבוהה ( איור 2 א ). חלקיקים בודדים היו גלויים בקלות מופרדים היטב ( איור 2 ב ). חלקיקים נבחרו מכן באמצעות כלי נחיל של e2boxerLass = &quot;xref&quot;&gt; 18 ( פרוטוקול שלב 4.1 ). במקרה זה, סף מתאים נקבע באמצעות אפשרות סלקטיבית יותר ( איור 2 ג ). 112 המיקרוגרפים הדיגיטליים הניבו 9,652 חלקיקים. רוב התמונות שחולצו ( פרוטוקול שלב 4.2 ) הכיל חלקיקים מוגדרים היטב גודל התיבה שלהם היה פי 1.5 יותר מאשר גודל החלקיקים, כפי שהומלץ ( איור 2 ד ). לאחר מכן, באמצעות ISAC, בוצע ניתוח הטרוגניות דו-צדדית ( פרוטוקול שלב 5 ). זה הניב 98 ממוצעים בכיתה ( איור 3 א ). באמצעות ממוצעים אלה ברמה 2 ד, מודל AB initio חושבה באמצעות ויפר ( פרוטוקול שלב 6 ) ברזולוציה ביניים ( איור 3 ב ). מודל זה מראה הסכם מצוין עם המבנה הגבישי של TcdA1 בעבר נפתרה ב 3.9 Å ברזולוציה 22 ( איור 3 ג ). מודל זה שימש לראשונה כטבלה ראשונית<html> צלחת עבור חידוד 3D (MERIDIEN), מניב 3.5 Å (0.143 קריטריון) שחזור ( פרוטוקול שלב 7 ) מ ~ רק 40,000 יחידות אסימטריות ( איור 4 ). זה כמעט אטומי מפת הפתרון התקבלה בתוך 24 שעות, באמצעות עד 96 CPUs עבור השלבים של זרימת עבודה כי נהנים ליבות מרובות. עבור ניתוח השתנות 3D (שלב 8 פרוטוקול), רק 2,000 תמונות חלקיקים לכל קבוצה שימשו בשלב 8.3.3 ( כלומר התהליך מתחיל עם 5 קבוצות 3D הראשונית) ו 200 תמונות עבור גודל הקבוצה הקטן ביותר בשלב 8.3.4 עקב את מספר קטן של חלקיקים (~ 10,000). הניתוח חשף גמישות מקומית בעיקר באזור N- מסוף של המתחם המכיל את התג שלו המשמש לטיהור ( איור 5 א ). ואכן, שנים עשר N- מסוף שאריות ואת התג שלו לא נפתרו במבנה גביש שפורסם בעבר של TcdA1&quot;22&gt; ו אזור זה כנראה לא היה פתור עדיין לא פתור את הצפיפות הנוכחית cryo-EM, ככל הנראה בשל הגמישות שלה.שונות נוספת זוהה על תחומים קולטן מחייב את תחום BC- מחייב ( איור 5 א ). פתרון הולם של המבנה וגודל קטן למדי של מערך הנתונים, הוחלט על הטרוגניות זו להיות נסבלת ולפיכך לא בוצע סיווג תלת-ממדי ממוקד 23. לבסוף, החישוב המקומי של מפת הצפיפות הסופית חושב ( פרוטוקול שלב 9.1, איור 5b ) ואת מפת 3D חידד היה מסונן באופן מקומי ( שלב שלב 9.2) . נפח של איכות זו ניתן להשתמש לבניית מודל novo באמצעות Coot 24 או כל כלי חידוד אחרים ( איור 6 ). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig1.jpg" /> &lt;Strong&gt; איור 1: עיבוד תמונה באמצעות SPHIRE. ( א ) GUI של חבילת התוכנה SPHIRE. שלב ספציפי של זרימת העבודה יכול להיות מופעל על ידי בחירת pictogram בהתאמה בצד שמאל של GUI (&quot;שלב זרימת העבודה&quot;). הפקודות והשירותים הקשורים לשלב זה של זרימת העבודה יופיעו באזור המרכזי של הממשק הגרפי. לאחר בחירת אחת הפקודות, הפרמטרים המתאימים מוצגים באזור הימני של הממשק הגרפי. פרמטרים מתקדמים בדרך כלל אינם דורשים שינוי של ערכי ברירת המחדל שהוגדרו מראש. ( ב ) שלבי זרימת עבודה של עיבוד תמונה אחת החלקיקים באמצעות GUI SPHIRE. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig2.jpg" /> איור 2: Motion תיקון וחלקLe חילוץ. ( A , ב ) אופייני באיכות גבוהה, נמוך במינון, להיסחף תיקון מיקרוסקופ דיגיטלי מוקלט ב defocus של 1.7 מיקרומטר. הערה הטבעות איזוטרופי Thon הארכת ברזולוציה של 2.7 Å בספקטרום כוח (א) ואת חלקיקי להבחין היטב בתמונה 2D ( ב ). ( ג ) בחירת החלקיקים באמצעות e2boxer. עיגולים ירוקים מצביעים על חלקיקים נבחרים. ( ד ) חלקיקים גולמיים אופייניים המופקים מן המיקרוגרף המשוקלל במינון. סולם ברים = 20 ננומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig3.jpg" /> איור 3: אשכולות דו-ממדיים ודגמים ראשוניים. ( א ) גלריה של ממוצעים מעמדיים דו-מימדיים, כאשר הרוב מייצג צדדים צדדיים<html> F החלקיק. סולם בר = 20 ננומטר. ( ב ) AB תחילת 3D המפה של TcdA1 שהושג באמצעות RVIPER ממוצעים בכיתה ללא התייחסות. ( ג ) התאמת גוף קשיח של מבנה גבישי TCDA1 (סרטים) (pdb-id 1VW1) לצפיפות הקריאו-EM הראשונית (אפור שקוף). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig4.jpg" /> איור 4: Cryo-EM 3D מבנה TcdA1. ( א , ב ) סופי 3.5 Å צפיפות המפה של TcdA1 מחושב באמצעות ~ 9,500 תמונות החלקיקים: ( א ) צד ו ( ב ) תצוגה העליון. ( ג ) אזורים מייצגים של צפיפות cryo-EM עבור סליל α ו- β גיליון.Arge.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig5.jpg" /> איור 5: ניתוח משתנות ורזולוציה מקומית. ( א ) פני השטח של מפת ה- cryo-EM המחודדת של TcdA1 (אפור) ומפת השתנות (ירוק). לקבלת הבהירות טוב יותר, את המפה השתנות היה נמוך לעבור מסונן עד 30 Å. ( ב ) טיוח פני השטח של TCPA1 חידד cryo-EM מפת צבעוני על פי ההחלטה המקומית (Å). שים לב להסכם הטופולוגי בין אזורים בעלי שונות גבוהה ורזולוציה מקומית נמוכה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55448/55448fig6.jpg" /> איור 6: מודול תלת ממדיאל TCDA1 באמצעות Cot. אזורים נציג של cryo-EM צפיפות המודל האטומי מוצגים עבור סליל α. המודל האטומי נבנה בנובו באמצעות Cot. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55448/55448fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

מאמר זה מציג פרוטוקול לעיבוד cryo-EM תמונות באמצעות חבילת תוכנה SPHIRE. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מיושם עבור כמעט כל חלקיקים יחיד פרויקטים EM כי היעד ברזולוציה אטומית כמעט.

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את המבנה של קומפלקסים מקרו-מולקולריים באמצעות אנליזה של חלקיקים בודדים של נתוני מיקרוסקופיה אלקטרונית קריוגנית (cryo-EM) באמצעות תוכנת עיבוד התמונות SPHIRE. cryo-EM של חלקיקים בודדים הופך לטכנולוגיה מרכזית לחקר מבנים של מקרו-מולקולות ברזולוציה קרובה לרמה אטומית. SPHIRE היא חבילת תוכנה חדשנית המאפשרת עיבוד חצי-אוטומטי של נתוני cryo-EM בצורה ידידותית למשתמש.היתרון העיקרי של SPHIRE הוא מנגנון האימות האוטומטי. מרבית הפרוצדורות נדרשות להרצה פעם אחת בלבד, והתוצאות הן אובייקטיביות וניתנות לשחזור. ניתן להשתמש ב-cryo-EM ברזולוציה גבוהה כדי למקם שאריות בודדות, ובכך לספק תובנה מכרעת לגבי הארגון והתפקוד של מכונות מיקרומולקולריות מורכבות.על משתמשים חדשים בשיטה זו לזכור כי השגת מבנה ברזולוציה גבוהה תלויה במידה רבה באיכות הדגימה ובנתוני הקלט. כדי להתחיל להשתמש באפליקציית SPHIRE, פתחו את ממשק המשתמש (GUI) מהטרמינל. פתחו את תפריט ה-UTILITIES כדי להציג תמונת קריו-מיקרוסקופיה באמצעות e2display.השתמש בכלי המדידה המובנה כדי למדוד את הציר הארוך ביותר של החלקיק באנגסטרום לפי פיקסל. פתח את הגדרות הפרויקט (Project Settings). הגדר את גודל חלון ה-CTF לגודל של לפחות גודל תיבת החלקיק.הגדירו את גודל תיבת החלקיקים למספר זוגי, הגדול לפחות פי 1 1/2 מקוטר החלקיק. הגדירו את רדיוס החלקיק ללפחות מחצית מהאורך שנמדד. הזינו את סימטריית חבורת הנקודות, אם היא ידועה, ואת המסה המולקולרית המשוערת.שמרו את ההגדרות. לאחר מכן, בתפריט MOVIE, פתחו את Micrograph movie alignment. הגדירו את נתיבי קבצי ההפעלה עבור unblur ו-summovie.בחרו סרטון מיקרוגרף גולמי שאינו מיושר, והחליפו את משתנה שם הקובץ בתו תבנית (wildcard) כדי להגדיר את תבנית נתיב הקלט של המיקרוגרפים. תנו שם לספריית הפלט. מלאו את מספר פריימי הסרטון, מתח המיקרוסקופ וזמן החשיפה לכל פריים.הפעל את התהליך כדי להפיק מיקרוגרפים ממוצעים מתוקננים לתנועה, עם שקלול מינון ובלי שקלול מינון. לאחר מכן, פתח את תפריט ה-CTER ובחר ב-CTF Estimation. הגדר את המיקרוגרפים ללא שקלול המינון כקלט.תנו שם לספריית הפלט, ומלאו את פרמטרי איסוף הנתונים. הגדירו את התדר הנמוך ביותר ל-0285 inverse angstroms ואת התדר הגבוה ביותר ל-0.285 inverse angstroms. הפעילו את התהליך כדי להפיק רשימה של פרמטרי CTF.בשלב הבא, פתח את תפריט WINDOW ובחר ב-Particle Picking. הגדר את המיקרוגרפים המשוקללים לפי מינון (dose-weighted micrographs) כקלט, והפעל את כלי העזר e2boxer. בצע את בחירת החלקיקים באופן ידני או אוטומטי.חלץ את החלקיקים שנבחרו למערכות תמונות (image stacks), ושלב את המערכות למערכת תמונות וירטואלית אחת במסד נתונים מסוג BDB. לאחר שהחלקיקים נבחרו וסודרו במערכות, פתח את תפריט ISAC ובחר ב-ISAC 2D Clustering. הגדר את מערכת התמונות הווירטואלית במסד נתוני ה-BDB כקלט.העריכו את מספר התמונות לכל מחלקה. מלאו את שאר הפרמטרים והפיקו את ממוצעי המחלקות בדו-ממד (2D class averages). לאחר השלמת הסיווג הדו-ממדי, השתמשו בכלי Display Data כדי לצפות בממוצעי המחלקות המאומתים והניתנים לשחזור.יש לוודא כי קיילים מספר אוריינטציות של חלקיקים וכי ממוצעי המחלקות הם באיכות מספקת. צור ערימת תמונות וירטואלית חדשה המכילה רק חלקיקים השייכים לממוצעי המחלקות שאושרו. לאחר מכן, פתח את תפריט ה-VIPER והשתמש בכלי ה-Display Data כדי לצפות בממוצעי המחלקות.מחק ממוצעי מחלקות באיכות נמוכה או כאלה המציגות מבטים זהים של החלקיק. שמור את ממוצעי המחלקות שנותרו לקובץ חדש. לאחר מכן, בחר ב-Initial 3D Model RVIPER, והשתמש בבחירה המצומצמת של ממוצעי המחלקות כקלט.הריצו את הפקודה כדי להפיק מודל תלת-ממדי ראשוני הניתן לשחזור של החלבון. בחנו את המודל בתוכנת הגרפיקה המולקולרית Chimera. השוו את המודל למבנה ידוע של חלבון הומולוגי או דומיין מהחלבון הנחקר.חזרו לתפריט ה-VIPER ב-SPHIRE, ובחרו ב-Create 3D Reference. צרו מודל ייחוס תלת-ממדי ראשוני עם גודל פיקסל נכון ומסכה תלת-ממדית. פתחו את תפריט ה-MERIDIEN, ובחרו ב-3D Refinement.מלאו את נתיבי הקבצים של ערימת תמונות הקלט ושל קובץ הייחוס התלת-ממדי הראשוני. תנו שם לספריית הפלט, והגדירו את המסכה של מודל הייחוס כמסכה התלת-ממדית. בחרו ב-Apply hard 2D mask.הגדירו את רזולוציית ההתחלה לבין 20 ל-25 אנגסטרם, והריצו את עיבוד הדיוק התלת-ממדי (3D refinement) כדי להפיק את חצאי הנפחים (half-volumes) ללא סינון. לאחר מכן, צפו בחצי נפח ללא סינון בתוכנת Chimera. קבעו סף בינאריזציה שבו כל צפיפויות החלבון מחוברות, אך ארטיפקטים של רעש אינם מחוברים.חזרו לתפריט ה-MERIDIEN של SPHIRE, ופתחו את Adaptive 3D Mask. הזינו את קלט חצי-הנפח (half-volume) ללא הסינון ואת סף הבינריזציה (binarization threshold). תנו שם למסכה שתיווצר, והפעילו את התהליך כדי לייצר מסכת תלת-ממד עם קצוות רכים.לאחר מכן, פתחו את Sharpening ובחרו את שני חצאי הנפחים (half-volumes) ללא הסינון. הגדירו את מסכת ה-3D של חצי הנפח בעלת השוליים הרכים (soft-edge) כמסכה שהוזנה על ידי המשתמש. הפעילו את התהליך הממזג את חצאי הנפחים ולאחר מכן מסנן ומחדד את הנפח הממוזג.פתחו את קובץ הלוג כדי לצפות בהערכת הרזולוציה הסופית. צרו מפת תלת-ממד של ההתפלגות הזוויתית של החלקיקים עבור ערימת התמונות שהופקה במהלך העידון התלת-ממדי (3D refinement). פתחו את המודל התלת-ממדי שעבר חידוד וסינון בתוכנת Chimera.בחן את מפת הצפיפות ואת המאפיינים ברזולוציה גבוהה. פתח את ההתפלגות הזוויתית ב-Chimera, ואמת כי זוויות האוילר (Euler angles) מפוזרות באופן איזוטרופי. פתח את תפריט SORT3D, ובחר ב-3D Variability Estimation.צור מפת שונות תלת-ממדית (3D variability map) מהמחסנית הווירטואלית של תמונות החלקיקים השייכים לממוצעי המחלקות המאומתים. צור מסכה תלת-ממדית בינארית ממפת שונות זו עבור צבירה (clustering) תלת-ממדית ממוקדת בהמשך. לאחר מכן, פתח את 3D Clustering RSORT3D, ובחר בספרייה של ה-3D refinement הקודם כקלט.נקוב את שם תיקיית הפלט, והגדר את מסכות ה-3D הגלובליות והממוקדות. עבור מערכי נתונים גדולים, השתמש בלפחות 5,000 עד 10,000 תמונות לכל קבוצה. הפעל את תהליך המיון כדי להפיק נפחים של כל קבוצת 3D הומוגנית.השתמשו ב-Chimera כדי לזהות את המבנה בעל הרזולוציה הנראית הגבוהה ביותר. חזרו לתפריט SORT3D ב-SPHIRE, ופתחו את Local Subset Refinement. הגדירו את נתיב קובץ הטקסט של תת-הקבוצה לקובץ אשכול מזהי החלקיקים (particle ID cluster file) המתאים למבנה בעל הרזולוציה הגבוהה ביותר.הגדירו את ספריית הזיכוך התלת-ממדי לספרייה המכילה את חצאי-הנפחים (half-volumes) ללא הסינון, ואת איטרציית ההפעלה מחדש לאיטרציית הרזולוציה הגבוהה ביותר מהזיכוך התלת-ממדי הקודם. הפעילו את הפקודה ליצירת חצאי-נפחים מקומיים ללא סינון. לאחר מכן, צרו מסכה תלת-ממדית בעלת קצוות רכים מאחד מחצאי-הנפחים המקומיים.מזגו את חצאי הנפחים המקומיים, ובצעו החדה לנפח הממוזג ללא שימוש במסנן מעביר נמוך (low-pass filter). לאחר מכן, פתחו את תפריט LOCALRES ולחצו על Local Resolution. בחרו את חצאי הנפחים המקומיים.לאחר מכן, בחר את המסכה המקומית בעלת הקצוות הרכים (local soft-edged mask). הגדר את הרזולוציה הכללית לרזולוציה המוחלטת שהוערכה בעת חידוד הנפח המקומי הממוזג. חשב את הרזולוציה המקומית של הנפח.בשלב הבא, פתחו את 3D Local Filter. הגדירו את הנפח המקומי הלא-מסונן והמחודד כקלט. בחרו את מפת הרזולוציה המקומית ואת ה-3D mask בעל הקצוות הרכים.החל את מסנן הרזולוציה המקומית על הנפח שעבר חידוד כדי להפיק את המודל התלת-ממדי הסופי. פתח את הנפח שהתקבל ואת מפת הרזולוציה המקומית בתוכנת Chimera. הפעל את כלי צביעת המשטח (Surface Color), ובחר מהתפריט את הנפח ואת האפשרות לצבוע את המשטח בהתאם לרזולוציה המקומית.קומפלקס הרעלן TcdA1 דומם באמצעות מיקרוסקופיה קריוגנית (cryo-microscopy). בכל התמונות נצפו חלקיקים בודדים שניתן להבחינם בבירור, וטבעות Thon שהגיעו לרזולוציה של פחות מארבעה אנגסטרם בספקטרום ההספק. החלקיקים נבחרו באמצעות e2boxer ולאחר מכן חולצו למערכת תמונות (image stack).ממוצעי מחלקה דו-ממדיים הופקו באמצעות יישור וצבירה יציבים באופן איטרטיבי, או ISAC. ממוצעי מחלקה אלו שימשו לחישוב מודל תלת-ממדי הניתן לשחזור באמצעות RVIPER. מודל זה תאם היטב את מבנה הגביש של TcdA1 שנפתר בעבר.זיקוק תלת-ממדי אוטומטי של מודל זה באמצעות MERIDIEN הניב מפה ברזולוציה קרובה לרמה אטומית. ניתוח שונות תלת-ממדי הצביע על גמישות מקומית של אזור ה-N terminal המסומן ב-histidine, של דומייני קישור לקולטן (receptor-binding domains), ושל דומיין הקישור ל-TcB. בוצעו חישובים של רזולוציה מקומית.המודל המחוודד עבר סינון מקומי והוחל סולם צבעים המתאים לרזולוציה מקומית, אשר הראה התאמה טופולוגית בין אזורים בעלי שונות גבוהה לאזורים בעלי רזולוציה נמוכה. מבנה ה-cryo-EM הסופי של TcdA1 ברזולוציה של 3.5-angstrom הראה צפיפויות ברורות עבור רוב שרשראות הצד. ניתן להשתמש במפת צפיפות ברמת פירוט זו לבניית מודל אטומי de novo.באמצעות גישה זו, ניתן להשיג מבנה ברזולוציה קרובה לאטומית בתוך שעות או ימים ספורים, ללא מידע מבני מוקדם (a priori). בעת ביצוע הליך זה, השתמשו אך ורק בנתונים באיכות גבוהה ובדקו את התוצאות הביניים. הטרוגניות הרכבית ומבנית של דגימת ה-cryo-EM עשויה להוות גורם מגביל להשגת רזולוציה קרובה לאטומית.לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן השימוש ב-SPHIRE לקביעת מבנה ב-cryo-EM. כפי שראיתם, שגרות הקיבוץ (clustering) הכלולות ב-SPHIRE יאפשרו לכם לא רק לפתור את המבנה של החלבון הנחקר, אלא גם לחקור דינמיקה קונפורמציונית ולספק תובנות מכניסטיות מכריעות לגבי מנגנונים מולקולריים מורכבים.

high-resolution-single-particle-analysis-from-electron-cryo

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

ניתוח חלקיקים בודדים במיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית היא אחת הטכניקות העיקריות המשמשות לקביעת מבנה ההרכבים הביולוגיים ברזולוציה גבוהה. Scipion מספקת את הכלים ליצירת הצינור כולו לעיבוד המידע שנרכש על ידי המיקרוסקופ ולהשיג שחזור תלת מימדי של הדגימה הביולוגית.

ניתוח קריו-EM וחלקיקים בודדים עם Scipion

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

מיקרוסקופיה הקפאה-אלקטרונית של חלקיק יחיד דורשת חבילת תוכנה מתאימה וצנרת ידידותית למשתמש לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. כאן, אנו מציגים את היישום של חבילת תוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת תמונות, Latitude-S, וצינור מעשי לאיסוף נתונים של ביומולקולים משוקלים בתנאים במינון נמוך.

ידידותית למשתמש, תפוקה גבוהה ותוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד

מאמר זה מתאר כיצד לנצל ביעילות שלוש פלטפורמות עיבוד קריו-EM, כלומר, cryoSPARC v3, RELION-3 ו- Scipion 3, כדי ליצור זרימת עבודה אחת וחזקה החלה על מגוון ערכות נתונים של חלקיקים בודדים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה.

תהליך עבודה חזק של עיבוד קריו-אלקטרון (cryo-EM) עם cryoSPARC, RELION ו- Scipion

היישום של שכבות תמיכה ברשתות מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (cryoEM) יכול להגדיל את צפיפות החלקיקים, להגביל אינטראקציות עם ממשק אוויר-מים, להפחית תנועה הנגרמת על ידי אלומה, ולשפר את התפלגות כיווני החלקיקים. מאמר זה מתאר פרוטוקול חזק לציפוי רשתות cryoEM בשכבה אחת של גרפן לשיפור הכנת דגימת קריו.

יישום גרפן חד-שכבתי ברשתות מיקרוסקופיית אלקטרונים קריו-אלקטרונים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה

שיטת בחירת חלקיקים מתקדמת עבור cryo-EM, כלומר CryoSieve, משפרת את רזולוציית מפת הצפיפות על ידי הסרת רוב החלקיקים בערימות סופיות, כפי שהודגם באמצעות היישום שלה על מערך נתונים בעולם האמיתי.

שיפור מפות צפיפות על ידי הסרת רוב החלקיקים בערימות סופיות של מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני של חלקיק יחיד

ספריות התצוגה חיידקי Biopanning היא טכניקה מוכחת על גילוי של פפטיד זיקה ריאגנטים, אלטרנטיבה איתנה נוגדנים. בשיטת המיון האוטומטי למחצה בזאת יש יעיל biopanning כדי להקטין את המופע של תוצאות חיוביות שגויות. כאן אנו ממחישים את התהליך המחשבתי וטכניקות מתבצעת הערכת המועמדים וצמצום ניתוח במורד הזרם.

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

להלן מוצגות שתי שיטות שבהן ניתן להשתמש בנפרד או במשולב כדי לנתח את השפעת בטא עמילואיד על מבנה קריש פיברין. כלול הוא פרוטוקול עבור יצירה של במבחנה clot פיברין, ואחריו קריש עכירות ואלקטרון סריקה שיטות.

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

הפרוטוקול BN-MS רב-תכליתי באמצעות מיקרוטומה מוצג ברזולוציה גבוהה complexome פרופיל.

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

למד לעבד תמונות cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות תוכנת SPHIRE לניתוח חלקיקים יחידים. שיטה זו מאפשרת לקבוע מבנים מולקולריים מורכבים בדיוק אטומי ולחקור דינמיקה קונפורמציונלית של חלבונים.

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

גלה סרטונים נוספים