Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged שחפת Mycobacterium

מודלים ומבחנים חדשים שישפרו את תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרופות נגד שחפת מהדור הבא הם רצויים מאוד. כאן, אנו מתארים בדיקה מהירה, זולה ותואמת BSL-2 להערכת יעילות התרופה נגד Mycobacterium tuberculosis שניתן להתאים בקלות לבדיקה בתפוקה גבוהה.

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור באופן שחזורי מבנים מצטברים של מקרופאגים נגועים ב-Mycobacterium tuberculosis בפורמט צלחת 96 באר לבדיקת רגישות לתרופות באמצעות צבע כדאיות. שיטה זו יכולה לשפר את תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרכובות נגד שחפת, אשר מעוכב על ידי תרגום לא פרודוקטיבי של תרכובות מועמדות לסביבה הקלינית. היתרון העיקרי של מודל זיהום פשוט וזול זה הוא שהוא מסכם מחסומי חדירה תאיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, המזכירים גרנולומות שחפת.

זה מייצר תוצאות רגישות לתרופות המנבאות יותר את יעילות in vivo. התחל הליך זה על ידי הכנת חלבון פלואורסצנטי ירוק המבטא M.tuberculosis MC בריבוע 6206, להלן MTBGFP, לזיהום. זכור שזהו זן אוירולנטי, כך שכל העבודה בפרוטוקול המתואר כאן יכולה להתבצע במתקן ברמת בטיחות ביולוגית שתיים.

לכל צלחת של 96 בארות יש להגדיר צנטריפוגה ב-2.8 כפול 10 ל-MTBGFP השמיני ב-3, 200 פעמים G למשך חמש דקות בצנטריפוגה דלי מתנדנדת. לאחר הסיבוב, שאפו את הסופרנטנט והוסיפו חמישה מיליליטר של RPMIC כדי לשטוף את החיידקים. פיפטה למעלה ולמטה כדי להשעות את התא.

ואז שוב צנטריפוגה. לאחר הסיבוב השני שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את תאי החיידקים בשבעה מיליליטר של סל"ד, ואז מערבולת למשך 10 שניות. לאחר מכן, עבור כל צלחת של 96 בארות שיש להקים, צנטריפוגה שבע פעמים 10 לתאים מונוציטים אנושיים THP1 השישי ב-250 פעמים G למשך חמש דקות.

לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את תאי THP1 בשבעה מיליליטר של RPMIC. לאחר מכן הכינו צלחת של 96 בארות לזיהום על ידי הוספת 200 מיקרוליטר מים סטריליים לבארות בשורות A ו-H ובעמודות 1 ו-12. שפת מים זו תמנע אידוי של מדיום התרבית.

הוסף 200 מיקרוליטר של RPMIC לעמודה שתיים, B שתיים ל-G שתיים, עבור בקרת הרקע או הריק. כדי להדביק את המונוציט THP1 השתמש בפיפטה כדי להעביר את כל התרחיף החיידקי MTBGFP המוכן לתרחיף תאי THP1 ולערבב את הרצון על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. צפיפות התאים הסופית של THP1 היא חמש כפול 10 עד חמישית למיליליטר ודו-פרצופיות הזיהום המקבילה היא 40.

לאחר מכן, שפכו את מתלה THP1 MTBGFP למאגר של 25 מיליליטר, ולאחר מכן באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מתלה THP1 MTBGFP את כל 96 הבארות הנותרות, E שלוש עד G 11. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2 למשך שבעה עד 10 ימים. כל יומיים לאורך הדגירה, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לשנות את המדיום על ידי הסרה איטית של 100 מיקרוליטר של מדיום משומש מהחלק העליון של כל באר והוספת עדינות של 100 מיקרוליטר של RPMIC מחומם מראש.

בעת החלפת המדיום חשוב להקפיד לא להפריע לאגרגטים של מקרופאגים MTB בתחתית הבארות. בכל יום בחן ויזואלית את הבארות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המצויד בשדה בהיר וערכות מסנני GFP עם מטרה של 4 עד 10 X. שימו לב לגודל של מצברי מקרופאגים MTB וצלמו תמונות אם תרצו.

עד היום השביעי עד העשירי מצטברים של מקרופאגים MTB אמורים להיות גדולים מספיק כדי להמשיך לבדיקת יעילות תרופות, כפי שמתואר בהמשך הסרטון. לבדיקת סמים, הכינו שתי תרופות נגד שחפת בשלוש פעמים על צלחת באר חדשה של 96 כדלקמן. ראשית, הוסף 125 מיקרוליטר של מדיום 7H9C לבארות B שתיים עד G 10.

לאחר מכן הכינו את שתי התרופות בריכוז סופי כפול מהריכוז הסופי הגבוה ביותר הרצוי במיליליטר אחד של 7H9C. בעזרת פיפטה מוסיפים 250 מיקרוליטר מכל תרופה לבארות B, C ו-D 11 ולאחר מכן E, F ו-G 11 בהתאמה לטיפולים משולשים. לאחר מכן, באמצעות פיפטה רב-ערוצית מדללים באופן סדרתי את תרופות הבדיקה פי שניים על ידי העברת 125 מיקרוליטר מ-B 11 דרך G 11 ל-B 10 עד G 10.

מערבבים על ידי פיפטינג חמש פעמים בכל שלב. המשך לנוע 125 מיקרוליטר מעמודה לעמודה מימין לשמאל על פני הצלחת, ועצור אחרי עמודה ארבע. לאחר ערבוב עמודה ארבע השליכו 125 מיקרוליטר למיכל פסולת.

עמודות 2 ו-3 לא צריכות להכיל תרופות כלשהן. זה יאפשר להשתמש בהם כרקע, ולבקרות צמיחה חיוביות. לאחר מכן שלפו את צלחת 96 הבאר המכילה את המקרופאגים הנגועים ב-MTB מהחממה.

מבלי להטות את הצלחת, השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להסיר 150 מיקרוליטר של מדיום מבארות B שתיים עד G 11. לאחר מכן הטה את הצלחת כפי שמוצג כאן, והכנס את קצות הפיפטה לקצה התחתון של הבארות והסר את המדיום שנותר, כ -50 מיקרוליטר. מכיוון שאגרגטים של מקרופאגים MTB נצמדים לתחתית הבאר, אסור לאבד שום חומר.

עם זאת, הסרת המדיום צריכה להיות עדינה ככל האפשר ויש להקפיד על מניעת השעיה חוזרת במהלך תהליך זה. הוסף בעדינות 100 מיקרוליטר של מדיום 7H9C לבארות B שתיים עד G 11 של הצלחת, המכילות את אגרגטי המקרופאגים MTB. בעזרת פיפטה רב-ערוצית העבירו 100 מיקרוליטר של התרופה המכילה צלחת באר 96 לבארות המתאימות של צלחת הזיהום.

לאחר מכן מניחים את הצלחת בשקית אטומה ודוגרים עליה במשך שלושה ימים בחום של 37 מעלות צלזיוס. בדיקת הרזזורין מסתמכת על המינים החמצונים המיוצרים על ידי MTB פעיל מטבולית כדי להמיר את הרזזורין הכחול לרסורופינה ורוד פלואורסצנטי. השינוי בצבע ובפלואורסצנטיות יכול לשמש כסמן חלופי לקביעת כמות גידול החיידקים.

הכינו תמיסת מלאי של רזזורין בריכוז סופי של 8 מיליגרם למיליליטר במים. סנן דרך קרום PVDF בגודל נקבוביות 22 מיקרומטר לעיקור. הכן תמיסת עבודה ברזזורין על ידי ערבוב תמיסת המלאי, המים ו-Tween-80 ביחס של שניים לאחד לאחד.

הריכוזים הסופיים הם 4 מיליגרם למיליליטר רזזורין, ו-5% טווין-80. באמצעות קורא צלחות, הגדר תוכנית לקריאת הקרינה בעירור של 530 ננומטר ופליטה של 590 ננומטר למשך 24 שעות כל 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. מחממים מראש את קורא הצלחות ל -37 מעלות צלזיוס.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת עבודה רזזורין לבארות B שתיים עד G 11 של הצלחת המטופלת בתרופות. הנח את הצלחת על הקורא והתחל את התוכנית. כדי לאשר את החוסן של התאמת מודל זיהום זה לפורמט צלחת 96 בארות, הוערכה הרגישות של MTB rifampicin RIF במוקסי מוקסיפלוקסצין כמתואר בסרטון זה.

כפי שמוצג כאן, מבני אגרגט מקרופאגים MTB נוצרו בהצלחה בפורמט צלחת של 96 בארות ובכך אפשרו תאימות דרך put. כדי למדוד כמותית את ההמרה של רזזורין כאינדיקטור לצמיחת חיידקים, הקרינה של בארות בודדות נוטרה באופן קינטי במשך 24 שעות. נוכחותם של תאי MTB ברי קיימא נקבעת על ידי המרת צבע הרזזורין הכחול לצורתו המופחתת הוורודה, המשתקפת כמותית על ידי רשתות z הקרינה היחסית בנקודת הזמן של הרוויה.

מיני גרפים מייצגים אלה מראים את יחידות הקרינה המתקבלות המוצגות על ציר Y לעומת הזמן המוצג על ציר X. כדי ליצור עקומות הרג רגישות לתרופות, בארות שטופלו ב-rifampicin ו-moxifloxacin נורמלו לצמיחה מקסימלית של MTB ללא בקרת תרופות כ-100% הישרדות. אותות ריקים של בקרת רקע הופחתו מכל באר דגימה.

אחוז ההישרדות נקבע עבור כל ריכוז בודד של טיפול תרופתי כדי ליצור עקומת הריגה. נתונים אלה מראים כי הריכוז המעכב המינימלי מגדיר את הריכוז הנמוך ביותר של האנטיביוטיקה בו נצפה עיכוב גדילה של 90% גדול משני מיקרוגרם למיליליטר, הן עבור ריפמפיצין והן עבור מוקסיפלוקסצין כנגד MTB הנגזר ממודל הזיהום שלנו. ככזה, הריכוז המעכב המינימלי של שתי התרופות הללו כנגד MTB באמצעות מודל הזיהום והבדיקה שלנו משקף יותר את הפעילות של תרופות אלה in vivo.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד ליצור באופן אמין וניתן לשחזור מבנים מצטברים של מקרופאגים נגועים ב-MTB לבדיקת רגישות לתרופות באמצעות בדיקת רזזורין. בעקבות הליך זה, שינוי תבנית התרופה משתי תרופות כפי שמוצג לפאנל ספריית תרופות של 58 מבוצע בקלות כדי לאפשר בדיקת תרופות גבוהה.