Name: Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged שחפת Mycobacterium (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: למד ליצור צברי מקרופאגים נגועים ב-Mycobacterium tuberculosis בפורמט 96-well לבדיקת רגישות לתרופות נגד שחפת. שיטה זו משפרת פיתוח תרופות ומספקת תוצאות חזויות יותר ליעילות בתוך הגוף.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר פרנק וולשנדורף על הגישה לקורא לוחות ההדמיה האוטומטי Cytation 3. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק NIH R01-AI104499 ל-OK. חלקים מהעבודה בוצעו במתקני UAB CFAR ועל ידי UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, הממומנים על ידי NIH/NIAID P30 AI027767 ועל ידי NIH 5P30 AR048311.

הערה: כפי שחפת mc 2 6206 הוא זן לֹא אַלִים 17, 18, כל העבודה בפרוטוקול זה יכול להתבצע במתקן 2 רמת בטיחות ביולוגית (BSL-2). 1. תנאי תרבות עבור חלבון פלואורסצנטי ירוק הבעת שחפת mc 2 6206 (חיידקי השחפת -GFP) הערה: M. שחפת H37Rv נגזר auxotroph זן mc 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) הפך עם GFP להביע פלסמיד pMN437 משמש ברחבי פרוטוקול זה 16. אפשר להחליף את זן חיידקי השחפת -GFP עם GFP שאינו מביע זן פראי סוג כדי לאפשר נגישות קלה יותר של הזן לחוקרים. עם זאת, הביטוי GFP רצוי לאפשר אישור ויזואלי של phagocytosis היווצרות של אגרגטים MTB / מקרופאג. עבור לוןאחסון לטווח גרם, MTB -GFP הוקפאו ב -80 מעלות צלזיוס 7H9 מדיה מלאה (כמתואר בשלב 1.1) בתוספת 20% גליצרול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת חיידק השחפת -GFP מלאה (7H9-C) על ידי השלמת 7H9 בינוני עם 10% מידלברוק OADC, 0.02% tyloxapol, 24 מיקרוגרם / מ&quot;ל D-חומצה פנטותנית, 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל L-לאוצין ו -50 מיקרוגרם / מ&quot;ל hygromycin B. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון אחד של חיידק השחפת -GFP ולהוסיף 10 מ&quot;ל של 7H9-C בבקבוק PETG תחתית מלבנית 30 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס על שייקר רוטרי (50 סל&quot;ד). קח מדידות צפיפות אופטית (OD 600) כל כמה ימים עד OD 600 מגיע 1.0 (כ 5-8 ימים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל ותרבות מעבר לפי הצורך כדי לשמור על OD 600 בין 0.2-1.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זיהום, להשתמש תרבות הוקמה של חיידק השחפת -GFP במסגרת שלב צמיחת הלוגריתמים (OD 600 של 0.6-1). כדי למנוע תרבויות clumpy, sonicate את הבקבוק תרבות חיידקי השחפת באמבט מים (130 ואט; 3 x פולסים של 5) oncדואר או פעמיים בשבוע </li></ol> 2. תנאי התרבות THP-1 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן התקשורת תא THP-1 המלא (RPMI-C) על ידי משלים RPMI 1640 בינוני עם 10% בסרום שור העובר חום מומת, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, ו -10 מ&quot;מ HEPES. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים בבקבוק T-75 על 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified של 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים באמצעות hemocytometer או cytometry זרימה בכל יום אחר ולשמור תאים THP-1 בצפיפות בין 0.1 כדי 0.6 מיליון דולר מ&quot;ל. </li></ol> 3. פרוטוקול זיהום כדי לייצר מבני צבירת MTB / Macrophage <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> THP-1 הכנת תא (לכל צלחת 96-היטב) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 7 x 10 6 THP-1 תאים ב 250 XG במשך 5 דקות. Resuspend ב 7 מ&quot;ל RPMI-C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה חיידק השחפת -GFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 2.8 x 10 8 חיידק השחפת -GFP ב 3,200 XG במשך 5 דקות בצנטריפוגה מתנדנד דלי uלשיר המרה של OD 600 1.0 = 3 x 10 8 חיידקים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפי פעם עם כמו RPMI-C ו צנטריפוגות בשלב 3.2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה ב 7 מ&quot;ל RPMI-C ו מערבולת למשך 10 s. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הַדבָּקָה הערה: ראה איור 1 עבור תבנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחת 96-היטב על ידי הוספת 200 μL של מים סטריליים בשורות A ו- H ועמודות 1 ו 12 עבור שפת מים כדי למנוע אידוי של מדיום התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL RPMI-C לעמודה 2 (B2 כדי G2) לפיקוח רקע (Blank). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להדביק, להוסיף ההשעיה חיידקי השחפת -GFP (שלב 3.2) כדי ההשעיה תא THP-1 (שלב 3.1) ומערבבים היטב על ידי pipetting. צפיפות התאים THP-1 הסופית היא 5 x 10 5 לכל מיליליטר והריבוי המקביל של זיהום הוא 40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את ההשעיה THP-1 / חיידקי השחפת -GFP למאגר 25 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 μL של THP-1 / חיידקי השחפת -GFP השעיה לכל 96-הבארות הנותרות (B3 דרך G11) usinפיפטה רב ערוצי ga. הערה: אם עובד עם 96-גם צלחות מרובות, באופן קבוע resuspend השעית THP-1 / חיידק השחפת שנותרה המאגר כדי להבטיח אפילו תערובת מתווספת כל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 7-10 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי תקשורת כל 2 ימים על ידי הסרת 100 לאט μL בילה תקשורת מהחלק העליון של כל טוב והוספה בעדינות 100 μL מראש חממו RPMI-C באמצעות pipet רב ערוצית. אל resuspend בארות ומפריעים המצרפים MTB / מקרופאג על החלק התחתון של הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבחינה ויזואלית לבחון את הבארות ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אובייקטיבי 4-10X) יומי, ובשים לב לגודל של אגרגטים MTB / מקרופאג. במשך היום 7-10, אגרגטים MTB / מקרופאג צריכים להיות גדולים מספיק (ראה איור 2 לעיון) כדי להמשיך לבדיקה יעילה תרופה (סעיף 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, ללכוד תמונות של 96-בארות באמצעות מערכת הדמית תא אוטומטית מצוידותעם מסנן שדה GFP בהיר קובע לתעד היווצרות המצרפי MTB / מקרופאג. הערה: אם אין למשתמשים גישה למערכת הדמיה אוטומטיות, תמונות של בארות נציג ניתן לקחת באמצעות כל מיקרוסקופ מתאים עם GFP ושדה בהיר יכולות. </li></ol></li></ol> 4. צמיחה Assay עיכוב כדי להעריך את חיידקי השחפת נגד יעילות התרופה נגזר MTB / אגרגטים Macrophage <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה ותרופות (תנאים בשלושה עותקים עבור שתי תרופות) הערה: ראה איור 1A עבור תבנית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 96-היטב נפרדת, להוסיף 125 μL של תקשורת 7H9-C כדי B2 עד G10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתי תרופות במחיר כפולה לריכוז הסופי הרצוי הגבוה ביותר 1 מיליליטר של 7H9-C לתת דין וחשבון על הדילול בשלב 4.2.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μL של כל תרופה לבארות B11-C11-D11 ו- E11-F11-G11, בהתאמה עבור טיפולים בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet הרב ערוצית, סדרתי dilיוטה תרופות המבחן כפול על ידי העברת 125 μL מ B11-G11 לתוך B10-G10. מערבבים על ידי pipetting 5 פעמים בכל שלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך כדי לעבור 125 μL מעמודה לעמודה (מימין לשמאל) על פני הצלחת, ולהפסיק אחרי טור 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ערבוב בעמודה 4, להשליך 125 μL לתוך מיכל פסולת. עמודות 2 ו -3 לא יכילו כל תרופות כדי לאפשר שימוש כרקע (בלנק) ובקרות צמיחה חיובית. הערה: לחילופין, בצע תבנית באיור 1B לספריות בדיקות סמים. כל צלחת 96-גם יכולה להכיל 58 תרופות בריכוז יחיד. כן זה צלחת סמים באמצעות כפול לריכוז הסופי הרצוי שכן הוא יהיה מדולל וחצי בשלב 4.2.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפול תרופתי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את צלחת 96-היטב המכיל את חיידקי השחפת -infected מקרופאגים (אגרגטים MTB / מקרופאג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למזוג את כל הבארות הרלוונטיות (B2 דרך G11) עם pipet רב ערוצית.בצע זאת באופן דו-שלבי: ראשית להסיר 150 μL ללא הטיית הצלחת, ולאחר מכן להסיר התקשורת הנותרים (~ 50 μL) על ידי הטיית הצלחת החדרת קצה פיפטה לקצה התחתון של הבאר. כפי MTB / אגרגטים מקרופאג הם חסיד אל תחתית הבאר, לא חומר צריך ללכת לאיבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להוסיף 100 μL של תקשורת 7H9-C לכל הבארות הרלוונטיות (B2 דרך G11) של הצלחת המכילה אגרגטים MTB / מקרופאג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet רב ערוצית, להעביר 100 μL מהתרופה המכיל צלחת 96-היטב (שלב 4.1) על הבארות המקבילות של הצלחת הזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום בשקית אטומה דגירה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 5. כימות של יעילות התרופה באמצעות assay Resazurin microtiter טוב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן resazurin פתרון המניות בריכוז סופי של 0.8 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב H 2 O. סינון דרך קרום PVDF גודל 0.22 מיקרומטר הנקבוביות לעיקור.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן resazurin עובד פתרון על ידי ערבוב פתרון מניות resazurin, H 2 O ו Tween-80 (פתרון 20% ב O H 2) בתוך 2: יחס 1: 1. ריכוזים גמר הן 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​resazurin ו 5% Tween-80. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קורא צלחת, התקנת תכנית לקרוא קרינת עירור 530 ננומטר ו 590 ננומטר פליטה כל 30 דקות במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. קורא צלחת טרום חם 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 μL של פתרון עובד resazurin לכל בארות רלוונטי (B2 דרך G11) של הצלחת טיפול תרופתי (שלב 4.11) באמצעות pipet הרב ערוצית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת על צלחת הקורא ולהפעיל את התוכנית להקים בשלב 5.3. הערה: כדי להקל על העיבוד של כמויות גדולות של צלחות assay, זה מספיק כדי לפתח את assay C חממת 37 ° ולבצע קרינה יחידה קוראה לכל 24 h. זה חל גם על משתמשים שאין להם גישה קוראת צלחת עם יכולות הקינטית דגירה. </li></ol>

<ol><li>Barry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lessons+from+seven+decades+of+antituberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery.</a> Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).</li>
<li>Bass, J. B. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+tuberculosis+and+tuberculosis+infection+in+adults+and+children.+American+Thoracic+Society+and+The+Centers+for+Disease+Control+and+Prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention.</a> Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).</li>
<li>Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenge+of+new+drug+discovery+for+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The challenge of new drug discovery for tuberculosis.</a> Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).</li>
<li>Palomino, J. C., Martin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMC207+becomes+bedaquiline%2C+a+new+anti-TB+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug.</a> Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).</li>
<li>Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+for+early-stage+tuberculosis+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The future for early-stage tuberculosis drug discovery.</a> Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).</li>
<li>Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+anti-tuberculosis+drug+efficacy%3A+rethinking+bacterial+populations+and+how+we+model+them%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them.</a> Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).</li>
<li>Ekins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+back+to+the+future%3A+predicting+in+vivo+efficacy+of+small+molecules+versus+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis.</a> J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).</li>
<li>Hartkoorn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+drug+susceptibility+of+intracellular+and+extracellular+tuberculosis%2C+and+the+impact+of+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein.</a> Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. (83), e51114(2014).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intracellular+screen+for+new+compounds+able+to+inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).</li>
<li>Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+drug+uptake+in+phenotypically+resistant+nutrient-starved+nonreplicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).</li>
<li>Dutta, N. K., Karakousis, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+duration+of+tuberculosis+treatment+be+shortened+with+higher+dosages+of+rifampicin%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin?</a> Front Microbiol. 6, 1117(2015).</li>
<li>van Ingen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+Do+We+Use+600+mg+of+Rifampicin+in+Tuberculosis+Treatment%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment?</a> Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).</li>
<li>Donald, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+concentrations+of+antituberculosis+agents+in+adults+and+children%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children.</a> Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).</li>
<li>Schaaf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Macrophage+Infection+Model+to+Predict+Drug+Efficacy+Against+Mycobacterium+Tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis.</a> Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).</li>
<li>Sampson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+elicited+by+a+double+leucine+and+pantothenate+auxotroph+of+Mycobacterium+tuberculosis+in+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs.</a> Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).</li>
<li>Jain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+transduction+designed+for+precise+high-throughput+unmarked+deletions+in+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis.</a> MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).</li>
<li>Davis, J. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+granuloma+in+expansion+and+dissemination+of+early+tuberculous+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection.</a> Cell. 136 (1), 37-49 (2009).</li>
<li>Collins, L., Franzblau, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+alamar+blue+assay+versus+BACTEC+460+system+for+high-throughput+screening+of+compounds+against+Mycobacterium+tuberculosis+and+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium.</a> Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).</li>
<li>Snewin, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+immunity+to+mycobacterial+infection+with+luciferase+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs.</a> Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הנה, יש לנו תיאר בפרוטרוט מודל חלופי בחיידק השחפת זיהום מתאים בדיקות יעילות התרופה. מודל זה לוקח בחשבון שני גורמים מרכזיים שיש לתת את דעת יותר במהלך תהליך פיתוח תרופות TB מוקדם: הנוכחות של מחסומים רלוונטיים מבחינה הפיזיולוגית לחדירה בסמי שינויים מטבוליים של חיידק השחפת במהלך הדבקה. למרות שאנו בעבר הראינו את היתרונות של מודל הזיהום שלנו והצענו את האפשרות של דרוג את הזיהום עבור תאימות תפוקה 16, כאן אנו מראים כי זהו אכן ברי השגה על ידי התאמת ...

<html> שחפת (TB) נותרה איום בריאותי הגלובלי רציני למרות הזמינות של כימותרפיה נגד שחפת במשך 40 שנה 1. זה נובע בחלקו לדרישת תקופות טיפול ארוך של למעלה מ -6 חודשים באמצעות שילובי תרופות מרובות, אשר מוביל לחולה אי קיום 2. הופעה של TB עמיד לתרופות בשנים האחרונות חריף עוד יותר בעיות בתחום שבו פיתוח מוצלח של תרופות קליניות שאושרה הנו כמעט אפסי 3. ואכן, למרות בפיתוח תרופות נגד שחפת ממצה, רק תרופה אחת כבר FDA אישר לשימוש קליני ב -40 השנים האחרונות 4. לפיכך, דורות חדשים של תרופות אנטי-TB יש צורך דחוף כדי לטפל בבעיה זו. בעיית מפתח לגילוי סמי TB היא חוסר העברה מוצלחת תרכובות עם פעילות במבחנה יעילה במסגרת הקלינית= &quot;Xref&quot;&gt; 5, 6, 7. בתחילה, גישות ה ביעדים שימשו למסך אנטי סמים חיידק השחפת 5, אשר לא הצליחו לתרגם בתאים שלמים של חיידקים. גם כאשר תאי חיידק השחפת משמשים, זה בד&quot;כ מבוצע באמצעות תרבויות גדלו מרק, אשר לא לחזות במדויק יעילות תרופת in vivo 8, 9. בעיות אלה הוכרו מבחני מיון תרופה נגד מקרופאגים המכילים חיידקי שחפת או סמוי חיידק שחפת הוקמו 8 בהצלחה, 10, 11, 12. עם זאת, גם אלה מבחנים מתקדמים יותר לא נותנים תמורה מספקת לחסמים החדירים שתרופות נתקלות הנגעים ריאתי הלא vascularized, ובסופו של המוקדים נמקי באתר של זיהום. אכן, אפילו עבור ריפמפיצין התרופה הראשונה אונליין TB, מינון תת אופטימלית נחקר בשל לקוי ברקמות vivo ובנוזל השדרה מוחין (CSF) חדירה 13, 14, 15 וכן ירד היעילות נגד תאיים 8 MTB, 9. ככזה, מודלי מבחנים חדשים שייקחו בחשבון פרמטרים אלה במהלך תהליך פיתוח מוקדם להוביל היה ללא ספק לשפר את המאמצים לגילוי סמי TB. כדי לתת מענה לצורך זה, הקמנו לאחרונה מודל זיהום זול, מהיר, BSL-2 תואם חלופי בדיקות יעילות תרופת חיידקי שחפת 16. מודל זיהום זה מיוצר ארוז חיידק שחפת בצפיפות בתוך מבנים המצרפי מקרופאג גדולים, אשר סכם את המחסומים חדירי הסלולר רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שנוצר-passaged מקרופאג <em&gt; חיידקי שחפת עם מצב פיסיולוגי שינה הדומה סמויה חיידק שחפת. חיידק השחפת נגזר ממודל זיהום זה היה בשילוב עם assay microtiter resazurin (הרמ&quot;א) כדי להעריך יעילות התרופה, אשר הפיק תוצאות עקביות עם מודלים זיהום תאיים אחרים בקורלציה גם עם היכולת דיווח של סמים TB נפוצה מנת להגיע לריכוזי CSF גבוהה ביחס ריכוזים בסרום 16. כאן אנו מתארים בפרוטרוט את הדור של חיידק השחפת / מבנים המצרפי מקרופאג לייצר-passaged מקרופאג חיידק השחפת מתאים בדיקות רגישות סמים באמצעות הרמ&quot;א. בפרט, אנו מראים כיצד מערכת זיהום זה יכול להיות מותאם בפורמט 96-גם עבור תאימות עם התפוקה ההקרנה של תרופות נוגדות-TB מועמד.

<table><tbody><tr><td>7H9</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td>עקוב אחר המלצות היצרן Middlebrook</td></tr><tr><td>OADC</td><td>BD Biosciences</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Tyloxapol</td><td>Sigma</td><td>T8761</td><td>הכן תמיסת מלאי של 20% ב-H2O; מסנן לעקר</td></tr><tr><td>חומצה D-Pantothenic מלח Heicalcium</td><td>Sigma</td><td>P5710</td><td>הכן תמיסת מלאי של 24 מ"ג/מ"ל ב-H2</ תת>O; מסנן לעקר</td></tr><tr><td>L-leucine</td><td>MP Biomedicals</td><td>194694</td><td>הכן תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל ב-H2O; לסנן לעקר</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>EMD Millipore</td><td>400051</td><td>הכן תמיסת מלאי של 200 מ"ג/מ"ל בבקבוק מדיה H2O</td></tr><tr><td>Nalgene Square PETG Thermo</td><td>Fisher</td><td>2019-0030</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Hyclone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>אטלנטה ביולוגי</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>קורנינג</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Hyclone</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 3 קורא צלחות</td><td>Biotek</td><td></td><td>ניתן להחלפה עם כל קורא צלחות פלואורסצנטי ומיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Gen5 תוכנה</td><td>Biotek</td><td></td><td>הקלטה וניתוח של rezasurin coversion</td></tr><tr><td>Rifampicin&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2679250</td><td>הכינו תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-H2O</td></tr><tr><td>Moxifloxacin Hydrochloride</td><td>Acros Organics</td><td>457960010</td><td>הכינו תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל ב-H2O</td></tr><tr><td>Resazurin נתרן מלח</td><td>סיגמא</td><td>R7017</td><td>הכינו 800 &mu; תמיסת מלאי g/mL ב-H2O; מסנן לעקר</td></tr><tr><td>Tween-80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164500</td><td>הכן תמיסת מלאי של 20% ב-H2O; לעקר מסנן</td></tr></tbody></table>

assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד macrophage passaged<em&gt; שחפת mycobacterium</em

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרופות נגד שחפת מעוכב על ידי תרגום לא יעיל של תרכובות בעלות פעילות חוץ גופית ליעילות בסביבה הקלינית. סביר להניח שהדבר נובע מחוסר התחשבות במחסומי החדירה התאיים הרלוונטיים מבחינה פיזיולוגית הקיימים במארח הנגוע. לאחרונה הקמנו מודל זיהום חלופי המייצר מבנים מצטברים גדולים של מקרופאגים המכילים M. tuberculosis (Mtb) צפוף בליבתו, שהיה מתאים לבדיקת רגישות לתרופות. מודל הדבקה זה הוא זול, מהיר והכי חשוב תואם BSL-2. כאן, אנו מתארים את ההליכים הניסיוניים ליצירת מבנים מצטברים של Mtb/מקרופאגים שייצרו Mtb העובר במקרופאגים לבדיקת רגישות לתרופות. בפרט, אנו מדגימים כיצד ניתן להתאים את מערכת ההדבקה הזו ישירות לפורמט צלחת 96 בארות המראה יכולת תפוקה לסינון ספריות תרכובות כנגד Mtb. בסך הכל, בדיקה זו היא תוספת חשובה לארגז הכלים לגילוי תרופות Mtb הזמין כיום בשל הפשטות, העלות האפקטיבית והמדרגיות שלה.

כדי לאשר את חוסנו של התאמת המודל זיהום זה 96-גם בפורמט צלחת, אנחנו כאן בחנו את הרגישות לתרופה של חיידק השחפת נגזר 96-היטב שלנו מותאם מודל הזיהום ריפמפיצין (RIF) ו moxifloxacin (Moxi) בהתאם לתבנית ניתנת באיור 1A. אנו מראים כי הדור של חיידק שחפת / מקרופאג המצרפי מבני מפתח assay זה יכול להיות מיוצר באופן מהימן במתכונת צלחת 96-היטב (איור 2), ובכך שהיא מאפשרת תאימות תפוקה (איור 1B). מק...

מודלים ומבחנים חדשים שישפרו את תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרופות נגד שחפת מהדור הבא הם רצויים מאוד. כאן, אנו מתארים בדיקה מהירה, זולה ותואמת BSL-2 להערכת יעילות התרופה נגד Mycobacterium tuberculosis שניתן להתאים בקלות לבדיקה בתפוקה גבוהה.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לייצר באופן הדיר מבני אגרגטים של מקרופאגים המודבקים ב-mycobacterium tuberculosis בפורמט של פלטה בעלת 96 בארות, לצורך בדיקת רגישות לתרופות באמצעות צבע חיוניות. שיטה זו יכולה לשפר את תהליך הפיתוח המוקדם של תרופות עבור תרכובות אנטי-שחפת, אשר מעוכב בשל מעבר לא יעיל של תרכובות מועמדות מהמעבדה למסגרת הקלינית. היתרון המרכזי של מודל הדבקה פשוט, זול ותואם לרמת בטיחות ביולוגית BSL 2 הוא בכך שהוא משחזר מחסומי חדירה תאיים רלוונטיים פיזיולוגית, המזכירים גרנולומות של שחפת.פעולה זו מניבה תוצאות רגישות לתרופות המנבאות טוב יותר את היעילות in vivo. התחילו את ההליך על ידי הכנת M.tuberculosis MC squared 6206 המבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק, אשר יכונה להלן MTBGFP, לצורך הדבקה. יש לזכור כי זהו זן שאינו virulent, ולכן ניתן לבצע את כל העבודה בפרוטוקול המתואר כאן במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2).עבור כל פלטת 96 בארות המיועדת להקמה, סבב במערך צנטריפוגה 2.8 × 10⁸ MTBGFP ב-3,200 ×g למשך חמש דקות בצנטריפוגה עם סלים נערכים (swinging bucket). לאחר הסבב, שאב את העילוי והוסף 5 mL של RPMIC לשטיפת החיידקים. בצע פיפוט מעלה ומטה כדי להשעות מחדש את התאים.לאחר מכן, סבבו שוב בצנטריפוגה. לאחר הסבב השני, שפכו את העלייה (supernatant) ותלו את התאים החיידקיים שוב בשבעה מיליליטר של RPMIC, ולאחר מכן ערבבו ב-vortex למשך 10 שניות. לאחר מכן, עבור כל פלטת 96 בארות המיועדת להקמה, סבבו בצנטריפוגה 7×10⁶ תאי מונוציטים אנושיים מסוג THP1 במהירות של 250×g למשך חמש דקות.לאחר הצנטריפוגציה, שפכו את הנוזל העליון והשעיקו מחדש את תאי ה-THP1 בשבעה מיליליטר של RPMIC. לאחר מכן, הכינו פלטה בעלת 96 בארות להדבקה על ידי הוספת 200 microliters של מים סטריליים לבארות בשורות A ו-H ובעמודות 1 ו-12. שולי מים אלו ימנעו את התאיידות מצע התרבית.הוסיפו 200 µL של RPMIC לעמודה שתיים, מ-B2 עד G2, עבור בקרת הרקע או הבלנק. כדי להדביק את המונוציטים מסוג THP1, השתמשו בפיפט להעברת כל תרחיף החיידקים של MTBGFP שהוכן אל תרחיף תאי ה-THP1 וערבבו היטב באמצעות שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting up and down). צפיפות תאי ה-THP1 הסופית היא 5 × 10⁵ למילליטר, ומכפלת ההדבקה (MOI) המתאימה לבאר היא 40.שפוך כעת את תרחיף ה-THP1 MTBGFP למאגר של 25 milliliter, ולאחר מכן, באמצעות פיפט רב-ערוצי, הוסף 200 microliters של תרחיף THP1 MTBGFP לכל שאר 96 הבארים, מ-E 3 ועד G 11. דגור את הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, עם 5%CO2 למשך שבעה עד 10 ימים. מדי יומיים לאורך תקופת הדגור, השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להחליף את המצע על ידי הסרה איטית של 100 microliters של מצע משומש מהחלק העליון של כל באר והוספה עדינה של 100 microliters של RPMIC שחומם מראש.בעת החלפת המצע, חשוב להקפיד שלא להפריע לצבירי המקרופאגים עם MTB בתחתית הבארים. בכל יום, בחנו חזותית את הבארים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה, המצויד בערכות פילטרים לשדה בהיר (bright field) ול-GFP, עם עדשה של 4 עד 10X. רשמו את גודל צבירי המקרופאגים עם MTB וצלמו תמונות במידת הצורך.ביום השביעי עד העשירי, אגרגטים של מקרופאגים עם MTB צריכים להיות גדולים מספיק כדי להמשיך לבדיקת יעילות התרופות, כפי שיתואר בהמשך הסרטון. לצורך בדיקת התרופות, הכינו שתי תרופות אנטי-טוברקולוזיס בשלוש חזרות בלוח 96 בארות חדש באופן הבא. ראשית, הוסיפו 125 µL של מצע 7H9C לבארות B2 עד G10.בשלב הבא, הכינו את שתי התרופות בריכוז כפול מהריכוז הסופי הגבוה ביותר הרצוי, בתוך מיליליטר אחד של 7H9C. באמצעות פיפט, הוסיפו 250 מיקרוליטר מכל תרופה לבארים B, C ו-D 11 ולאחר מכן לבארים E, F ו-G 11 בהתאמה, עבור טיפולים בשלוש חזרות. לאחר מכן, באמצעות פיפט רב-ערוצי, בצעו דילול סדרתי של תרופות הבדיקה פי שניים על ידי העברה של 125 מיקרוליטר מבארים B 11 עד G 11 לבארים B 10 עד G 10.ערבבו באמצעות פיפוט חמש פעמים בכל שלב. המשיכו להעביר 125 microliters מעמודה לעמודה מימין לשמאל לאורך הפלטה, ועצרו לאחר עמודה ארבע. לאחר ערבוב עמודה ארבע, השליכו 125 microliters למכל פסולת.עמודות שתיים ושלוש לא צריכות להכיל תרופות כלשהן. הדבר יאפשר להשתמש בהן כרקע וכביקורות צמיחה חיוביות. לאחר מכן, הוצא מהאינקובטור את פלטת 96 הבארים המכילה את המקרופאגים המודבקים ב-MTB.בלי להטות את הפלטה, השתמשו בפיפט רב-ערוצי כדי להסיר 150 µL של מצע מבארים B2 עד G11. לאחר מכן, הטו את הפלטה כפי שמוצג כאן, והחדירו את קצות הפיפט לקצה התחתון של הבארים והסירו את שארית המצע, כ-50 µL. מכיוון שצבירי מקרופאגים של MTB נצמדים לתחתית הבאר, לא אמור לחול אובדן של חומר.עם זאת, יש להסיר את המצע בעדינות רבה ככל האפשר, ויש להקפיד למנוע רסספנזיה (resuspension) במהלך תהליך זה. הוסיפו בעדינות 100 µL של מצע 7H9C לבארים B2 עד G11 של הפלטה, המכילות את אגרגט המקרופאגים של MTB. העבירו, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, 100 µL מהפלטה בעלת 96 בארים המכילה את התרופה לבארים התואמות בפלטת ההדבקה.לאחר מכן, הניחו את הפלטה בשקית אטומה והדגירו אותה למשך שלושה ימים בטמפרטורה של 37 °C. בדיקת ה-resazurin מתבססת על מינים חמצוניים המיוצרים על ידי MTB פעיל מבחינה מטבולית, אשר ממירים את ה-resazurin הכחול ל-resorufin ורוד פלואורסצנטי. ניתן להשתמש בשינוי הצבע והפלואורסצנציה כסמן חלופי לקביעת כמות הצמיחה החיידקית.הכינו תמיסת ס탁 של resazurin בריכוז סופי של 8 mg/mL במים. סננו דרך ממבנ PVDF בעל גודל נקבים של 22 µm לצורך עיקור. הכינו תמיסת עבודה של resazurin על ידי ערבוב של תמיסת הס탁, מים ו-Tween-80 ביחס של שתיים לאחת לאחת.הריכוזים הסופיים הם 4 mg/mL resazurin ו-5% Tween-80. באמצעות קורא לוחות, הגדירו תוכנית לקריאת פלואורסצנציה בעירור של 530 nm ופליטה של 590 nm למשך 24 שעות בכל 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. חממו מראש את קורא הלוחות ל-37 °C.באמצעות פיפט רב-ערוצי, הוסיפו 20 microliters של תמיסת עבודה של resazurin לבארים B 2 עד G 11 בלוחית המטופלת בתרופה. הניחו את הלוחית בקורא והפעילו את התוכנית. כדי לאשר את חוסנו של ההתאמת מודל זיהום זה לפורמט של לוחית 96 בארי, נבחנה הרגישות של MTB ל-rifampicin RIF ול-moxifloxacin moxy כפי שמתואר בסרטון זה.כפי שמוצג כאן, מבני אגרגטים של מקרופאגים עם MTB נוצרו בהצלחה בפורמט של פלטת 96 בארות, ובכך התאפשרה תאימות לסריקה רחבה (high throughput). כדי למדוד באופן כמותי את המרת הרזאזורין (resazurin) כאינדיקטור לצמיחה בקטריאלית, נוטר פלואורסצנציה של בארות בודדות באופן קינטי במשך 24 שעות. נוכחות של תאי MTB חיוניים נקבעת על ידי המרת צבע הרזאזורין הכחול לצורתו הרeduced הוורודה, אשר משתקפת כמותית על ידי ערכי הפלואורסצנציה היחסיים בנקודת הזמן של הרוויה.גרפים מיניאטוריים מייצגים אלו מציגים את יחידות הפלואורסצנציה המתקבלות בציר ה-Y לעומת הזמן בציר ה-X. כדי להפיק עקומות הריגה של רגישות לתרופות, בארות שטופלו ב-rifampicin וב-moxifloxacin נורמלו לצמיחת MTB המקסימלית בביקורת ללא תרופה כ-100% שרידות. אותות רקע של ביקורת ריקה הופחרו מכל באר דגימה.אחוז ההישרדות שורטט עבור כל ריכוז בודד של טיפול בתרופה כדי ליצור עקום הריגה. נתונים אלו מראים כי הריכוז העיכוב המינימלי, המגדיר את הריכוז הנמוך ביותר של האנטיביוטיקה שבו נצפתה עכבת צמיחה של 90%, גבוה מ-2 µg/mL, הן עבור rifampicin והן עבור moxifloxacin נגד MTB שהופק ממודל ההדבקה שלנו. לפיכך, הריכוז העיכוב המינימלי של שתי תרופות אלו נגד MTB תוך שימוש במודל ההדבקה ובבדיקה שלנו משקף טוב יותר את הפעילות של תרופות אלו in vivo.לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן להפיק באופן מהימן ובחזרתי מבני אגרגטים של מקפגים מזוהמים ב-MTB לצורך בדיקת רגישות לתרופות באמצעות מבחן הרזאזורין. ביצוע הליך זה, תוך שינוי תבנית התרופות משתי התרופות המוצגות לפאנל של ספריית 58 תרופות, מתבצע בקלות כדי לאפשר סריקת תרופות בסביבת עיבוד גבוהה (high throughput).

a-high-throughput-compatible-assay-to-evaluate-drug-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים בדיקה להערכת יעילות התרופות נגד זיהום Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  נוצר מודל זיהום במבחנה המכיל אגרגטים Mtb/מקרופאגים המחקה זיהום in vivo. עם החדרת אנטיביוטיקה מתאימה, יעילותם נבדקת באמצעות בדיקת resuzarin כדי לפקח על הישרדותם של חיידקים עם ריכוזי תרופות עולים.

בדיקה להערכת יעילות התרופה נגד מודל זיהום Mycobacterium tuberculosis

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

כימות מהיר ויעיל של גדילת שחפת M. תוך תאית הוא חיוני להמשך טיפולים משופרים נגד שחפת ( שחפת ). פרוטוקול זה מתאר בדיקת זיהוי קולורימטרית מבוססת מרק באמצעות מערכת תרבית נוזלית אוטומטית כדי לכמת את גידול ה-Mtb במקרופאגים שטופלו בטיפולים מוכווני מארח מועמדים.

מערכת תרבית אוטומטית לשימוש בבדיקות פרה-קליניות של טיפולים מכווני מארח לשחפת

קביעת יחידות יוצרות מושבות (CFU) היא הטכניקה הסטנדרטית לכימות חיידקים, כולל Mycobacterium tuberculosis אשר יכול לקחת שבועות כדי ליצור מושבות גלויות. כאן אנו מתארים מיקרו-CFU לקביעת CFU עם יעילות זמן מוגברת, שטח מעבדה מופחת ועלות מגיב, ומדרגיות לניסויים בתפוקה בינונית וגבוהה.

בדיקת יחידה להקמת מושבות מיקרו להערכת יעילות חיסונים נגד שחפת

מחקר זה פיתח בדיקה לסינון בתפוקה גבוהה נגד Mycobacterium abscessus עם זן כפול של כתב שנוצר לאחרונה, תוך שימוש בפלואורסצנטיות ולומינסנציה כדי להעריך את כדאיות החיידקים במהירות. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי לחוקרים השואפים לסנן תרופות חדשות נגד חיידק עמיד לתרופות.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

מחקר זה מספק פרוטוקול להערכת האינטראקציה של Mycobacterium tuberculosis עם החיישן המיקרוביאלי SLAMF1. הבדיקות נערכו על מקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הכלים המתוארים רלוונטיים לחקר אינטראקציות בין פתוגנים לקולטני חיסון.

מבחני פלואורסצנטיות לחקר אינטראקציה של Mycobacterium tuberculosis עם הקולטן החיסוני SLAMF1

שחפת Mycobacterium מהווה biofilms סמים סובלניים כאשר בתרבית בתנאים מסוימים. כאן אנו מתארים שיטות culturing מ ' שחפת biofilms וקביעת תדירות persisters סמים סובלניים. פרוטוקולים אלה יהיה שימושי למחקרים נוספים לתוך מנגנוני עמידות לתרופה בתוך: מ ' שחפת.

גידול של שחפת Mycobacterium Biofilms

שחפת ומלריה הן שניים מהזיהומים הנפוצים ביותר בבני אדם וגורמים עיקריים לתחלואה ותמותה באוכלוסיות עניות באזורים הטרופיים. הקמנו מערכת מודל ניסיונית ללמוד תוצאה של coinfection מלריה שחפת בעכברים לאחר אתגר עם שני פתוגנים דרך התוואי הטבעי שלהם לזיהום.

מודל ניסיוני לחקר המלריה שחפת-coinfection על הילוכים טבעיים של חפת Mycobacterium ו Berghei Plasmodium</i

Microarray הגברה משלב הכלאת הגברה וmicroarray PCR אסימטרי לתוך תא בודד, אשר מייעל באופן משמעותי את זרימת עבודה microarray למשתמש הקצה. פישוט זרימת העבודה microarray הוא צעד ראשון הכרחי ליצירת אבחון מבוסס microarray שניתן להשתמש באופן שיגרתי בסביבות נמוכים יותר משאבים.

הוכחת סמים רבים עמידים<em&gt; חפת Mycobacterium</em&gt; Microarray ההגברה

למד ליצור צברי מקרופאגים נגועים ב-Mycobacterium tuberculosis בפורמט 96-well לבדיקת רגישות לתרופות נגד שחפת. שיטה זו משפרת פיתוח תרופות ומספקת תוצאות חזויות יותר ליעילות בתוך הגוף.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged

גלה סרטונים נוספים