הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים
22 במרץ 2017
כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירה וכימות של תת-סוגים לבביים מגוונים שתוכנתו מחדש באמצעות אספקה מתווכת רטרו-וירוס של Gata4, Hand2, Mef2c ו-Tbx5.
המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק ולכמת קבוצה מגוונת של תתי-סוגי תאי שריר לב (cardiomyocytes) מושראים. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות יסוד מרכזיות הנוגעות להמרת שושלת ספציפית לתת-סוג במהלך תכנות מחדש של הלב, כגון הרמזים הדרושים המבקרים את הרכבת הסרקומר ואת קביעת תת-הסוג. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה לכימות ההשפעות על קביעת תת-סוגי תאי שריר לב, דבר הדרוש לביצוע מחקרי מנגנונים.
ראשית, בודדו פיברובלסטים עובריים של עכבר מעוברים בשלב E 12.5. אחסנו אותם בחנקן נוזלי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, קצרו תאי plat-E והעבירו אותם לפלטה בעלת שש בארות בריכוז של מיליון תאים לבארה, כך שהתאים יגיעו ל-70 עד 80% התמזגות (confluency) תוך 24 שעות.
כסו את התאים במצע טרנספקציה והדגירו אותם בתנאי תרבית סטנדרטיים. יום אחד לפני יום הניסוי, קחו מבחנה קונית מפוליסטירן בנפח 15 milliliters וערבבו 60 microliters של מצע עם סרום מופחת עם שש microliters של ריאגנט טרנספקציה לכל תגובה. הדגירו את התערובת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
כיוון שאתם משתמשים ברכיב טרנספקציה, הוסיפו את הרכיב ישירות למצע בעל ריכוז סרום מופחת כדי למנוע ירידה ביעילות הטרנספקציה. לאחר מכן, הוסיפו סך כולל של 2 µg מתמונית GHMT לכל תגובה, והקישו בעדינות על המבחנה כדי לערבב. דגרו את התגובה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוסיפו את התערובת לתאי plat-E בטיפות.
רשמו את התאריך והשעה של הטרנספקציה. דגרו את תאי ה-plat-E שעברו טרנספקציה למשך לילה. שעה לפני זריעת הפיברובלסטים העובריים של העכבר, הכינו פלטת 24 בארות עבור אימונו-ציטוכימיה על ידי הוספה של כיסויי זכוכית (coverslips) בקוטי של 12 מילימטר מצופים בפיברונקטין לכל בארה.
בשלב הבא, הוסיפו 300 µL של תמיסת קולגן בקר לכל באר והדגרירו את הפלטה למשך שעה אחת. לקראת סיום ההדגירה, הפשיתו מבחנה קפואה של פיברובלסטים עובריים של עכבר מסוג HCN4GFP. ביצעו הפשרה מהירה לתאים, שטפו אותם פעם אחת עם מצע גידול לפיברובלסטים שחומם מראש, וספרו את ריכוז התאים החיים.
לאחר מכן, שאבו את תמיסת הציפוי מלוח 24 הבארים והזריקו באופן מיידי 30,000 תאים לבאר על גבי לביבות הזכוכית המצופות בקולגן ופיברונקטין. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, סננו את המצע הרטרו-ויראלי דרך מסנן צלולוז אצטט נטול סורפקטנט עם גודל נקבוביות של 0.45 מיקרון, והעבירו אותו למבחנה קונית של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו polybrene עד לריכוז סופי של 8 µg/mL.
מלאו בזהירות את תאי ה-plat-E בשני מיליליטר של מצע טרנספקציה טרי. החלפה מהירה מדי של המצע עלולה לגרום להינתקות התאים. תאי plat-E המתוחזקים כראוי מייצרים בממוצע עשרה מיליון יחידות זיהום למיליליטר.
ביטוי גבוה של GFP ועוצמה ביותר מ-95% מהתאים מעידים בדרך כלל על הצלחה ביצירת מיוציטים דמויי קרדיומיוציטים מושריים באמצעות GHNT. לאחר מכן, שאבו את המצע מהפיברובלסטים העובריים המגודלים והוסיפו את מצע הרטרו-וירוס שנאסף טרי. לאחר מכן, החזירו את הצלחת לאינקובטור והדגירו למשך הלילה.
ביום למחרת, העבירו שוב את המדדימ מהתאי plat-E אל הפיברובלסטים העובריים. השליכו את תאי ה-plat-E לאחר איסוף הנגיף השני. 48 שעות לאחר ההשראה, שאבו את המדדימ של התאים ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS.
לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של מצע להשראת תאי שריר לב (induced cardiomyocyte-like myocyte media) שחומם מראש לכל באער בלוח של 24 באערים. החליפו את המצע מדי יומיים עד שלושה ימים במשך 12 הימים הבאים. 14 ימים לאחר ההשראה, שאבו בזהירות את המצע ושטפו כל באער עם 300 µL של PBS קר מאוד.
לאחר מכן, הסירו את ה-PBS והוסיפו 250 microliters של תמיסת פאראפורמלידהיד 4% לכל באר, והדגירו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו פרמיאביליזציה לתאים על ידי שטיפת הבאערים שלוש פעמים למשך חמש דקות עם 300 microliters של 0.1% tritonex 100 ו-PBS. שאבו את תמיסת הפרמיאביליזציה העודפת לאחר השטיפה האחרונה, ולאחר מכן הוסיפו באפר חסימה אוניברסלי בנפח של 300 microliters לבאר.
בצעו חסימה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. צבעו זוג אחד של סליידים למשך לילה עם נוגדנים mouse anti-alpha actenin, chicken anti-GFP ו-rabbit anti-NPPA כדי לזהות מיוציטים דמויי קוצבי לב מושריים בתוך מיוציטים דמויי עלייה מושריים. למחרת, שטפו את הבארות והוסיפו את הנוגדן המשני המתאים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.
לאחר שטיפות נוספות, הוסף 2.4 µL של תמיסת קיבוע (mounting media) לזכוכית של שקופית מיקרוסקופ. קח כיסוי זכוכית (cover slip) מלוח ה-24 באריים והסר את עודפי התמיסה. לאחר מכן, העבר אותו לשקופית הזכוכית עם תמיסת הקיבוע.
עבור כל סלייד, התחל מקצה אחד וסרוק מעלה ומטה בערוץ הפלואורסצנציה האדום כדי לזהות תאים חיוביים ל-sarcomere וחיוביים ל-alpha-actinin. את הפסים של ה-sarcomere קל ביותר לזהות באורך גל של 555 nanometer. לאחר הזיהוי, עבור לערוץ הירוק וציין אם התאים חיוביים.
לאחר מכן, עברו למחשב כדי לבחון את אורך הגל באזור התמרור האדום הרחוק (647 ננומטר) כדי לחפש צביעה של NPPA או MYL2. תאים שהם חיוביים ל-alpha-actinin, חיוביים לסרקומר, שליליים ל-Hnc4-GFP וחיוביים ל-Nppa הם מיוציטים דמויי עליות שעברו השראה. צביעת Nppa תופיע באופן פרא-גרעיני ונקודתי.
ראשית, ספרו את מספר התאים 24 שעות לאחר הזריעה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, בצעו בדיקה ויזואלית של כל תא על לית ג XS (cover slip) כדי לוודא צביעה תקינה של alpha-actinin ושל הסרקומר (sacromere), ורשמו את מספר התאים שנצבעו באופן חיובי עבור שני הסמנים. לבסוף, חלקו את המספר במספר התאים הכולל שנזרעו בפועל.
ניסוי תכנות מחדש ממוצע יניב כ-1% של תאים החיוביים הן ל-alpha-actinin והן לסרקומרים. ביום ה-14, ניתן להפסיק את הניסוי ולהעריך את ארגון הסרקומרים. הדבר מזוהה על ידי צביעת alpha-actinin חיובית המוצגת כאן בצבע אדום.
רק תאים המפגינים ארגון של סרקומרים מסוגלים לפעום באופן ספונטני, ולכן זוהי בדיקה ראשונית טובה. מוצגים כאן תאי שריר לב (cardiomyocytes) דמויי קוצב לב מושריים מעכברי דגם עם reporter של Hcn4-GFP. שלושה תאים במבט זה מפגינים ארגון של סרקומרים.
שלושה צבירי תאים חיוביים ל-Hcn4-GFP נמצאים במרכז התמונה וניתן לזהותם כסוג תאי קוצב. תא אחד בפינה השמאלית התחתונה נצפה עם צביעת alpha-actinin, אך ללא ארגון סרקומרים או סמן תת-סוג שניתן לזיהוי. באוכלוסייה זו של קרדיומיוציטים מושריים דמויי חדרים, התא המרכזי מראה ארגון סרקומרים; תא זה נצבע גם באופן חיובי לסמן שרשרת אורקל של מיוזין MYL-2, המהווה סמן לקרדיומיוציטים של החדרים.
לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את זריעת התאים ואת הטרנספקציה של תאי plat-E תוך שעה אחת. השראת הפיברובלסטים העובריים של העכבר אורכת בין שעה לשעתיים, וכביו-קוונטיפיקציה של myto עבור פלטה מלאה בעלת 24 בארות אורכת כשמונה שעות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי פיברובלסטים עובריים בריאים של עכבר ונגיפים בעדירות גבוהה הם המפתח לניסוי תכנות מחדש מוצלח.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק ולכמת תת-סוגים בודדים של קרדיומיוציטים מושריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לתכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) לתאי שריר לב מושריים דמויי קרדיומיוציטים (iCLMs) באמצעות גורמי השעתוק Gata4, Hand2, Mef2c, ו-Tbx5 (GHMT). השיטה מאפשרת ייצור וכמות של תת-סוגים לבביים מגוונים, ומספקת גישה שיטתית לחקר המרת שורות תאים והגדרה של תת-סוגים לבביים in vitro.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- תכנות מחדש של תאים
- ביולוגיה של הלב
- רפואה רגנרטיבית
רקע
- תכנות מחדש ישיר מאפשר המרה של סוג תא אחד לאחר, ובכך מציע פוטנציאל לטיפולים רגנרטיביים ולמידול מחלות.
- תכנות מחדש של פיברובלסטים באמצעות GHMT יכול להניב סוגים שונים של תת-סוגים לבביים.
- הבנת המנגנונים של קביעת תת-הסוג היא קריטית ליישומים טיפוליים.
- הערכה כמותית ואיכותית של תאים שעברו תכנות מחדש נחוצה למחקרים מכניסטיים.
מטרת המחקר
- אספקת פרוטוקול שלבי ליצירת iCLMs מ-MEFs באמצעות גורמי GHMT.
- מתן אפשרות לזיהוי וכמות של תתי-סוגים לבביים ספציפיים (עליות, חדרים, קוצב לב).
- סיוע במחקרים מכניסטיים של המרת שושלת לבבית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד ושימור בהקפאה (cryopreservation) של פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs).
- ייצור של וקטורים רטרו-ויראליים המקודדים לגורמי שעתוק GHMT באמצעות תאי Plat-E.
- הדבקה של MEFs ברטרו-וירוס GHMT ותרבית המשכית לצורך תכנות מחדש (reprogramming).
- אימונוציטוכימיה באמצעות נוגדנים ספציפיים לזיהוי סוגים משניים של תאי לב.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית לצורך ויזואליזציה וכימות של iCLMs והסוגים המשניים שלהם.
תוצאות עיקריות
- יצירה יעילה של iCLMs מ-MEFs, כאשר כ-1% מהתאים מראים חיוביות הן ל-alpha-actinin והן לסרקומרים.
- זיהוי תת-סוגים הושג באמצעות ביטוי סמנים: NPPA לתאי עליה, MYL2 לתאי חדר, ו-HCN4-GFP לתאי קוצב.
- תאים עם סרקומרים מאורגנים מסוגלים לפעמים פעימה ספונטנית, מה שמאשר תכנות מחדש תפקודי.
- הפרוטוקול מאפשר כימות והבחנה בין תת-סוגים לבביים בודדים בתוך אוכלוסיות שעברו תכנות מחדש.
מסקנות
- הפרוטוקול המתואר מאפשר יצירה וניתוח הדירות של iCLMs ותתי-סוגים שלהם מ-MEFs.
- MEFs בריאים ותכשירי וירוס בריכוז גבוה הם קריטיים לתכנות מחדש מוצלח.
- שיטה זו תומכת במחקרים מכניסטיים מפורטים של התמיינות תתי-סוגים של תאי לב והמרה של שושלת תאים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תכנות מחדש ישיר של פיברובלסטים עובריים של עכבר לסוגי תתי-תאים שונים של קרדיומיוציטים מאפשר חקירה מכניסטית של המרת שושלת לבבית, ובכך תומך בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובמידול מחלות. זיהוי כמותי של תאי עליה, תאי חדר ותאים דמויי קוצב לב מספק ביטחון חיזוי למחקר לבבי תרגומי. תהליך עבודה זה נותן מענה לנקודת מפנה קריטית עבור רפואה רגנרטיבית וקידום פורטפוליו לבבי פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה שיטתית של שילובי גורמי שעתוק לקביעת שושלת לבבית.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי כימות יעילות ההמרה הספציפית לסוג-משנה.
- מקל על תיקוף תפקודי של מטרות באמצעות זיהוי של סוגי-משנה של קרדיומיוציטים המבוסס על סמנים.
- מספק פלטפורמה למחקרים מונחי-השערות על מסלולי התמיינות לבבית.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מקיים תהליכי עבודה הניתנים לשחזור עבור אימונוציטוכימיה ודימוי קונפוקאלי לצורך כימות תתי-סוגים.
- מספק קריאות סטנדרטיות לארגון הסרקוםרה ולביטוי סמנים.
- מאפשר השוואה חסונה של תנאי תכנות מחדש בין זרועות ניסוייות.
- מכין מערכות תאים שעברו תיקוף לצורך סריקת תרכובות או סריקה גנטית בהמשך התהליך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה בין יצירת תתי-סוגים של תאי לב במעבדה (in vitro) לבין פנוטיפים רלוונטיים למחלה עבור יישומי מידול.
- תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות לרגנרציה של הלב.
- מספק נקודות קצה כמותיות לצורך קידום מותאם סיכונים של מועמדים לטיפול תאי בלב.
- מאפשרת הערכה של הבשלה תפקודית באמצעות ארגון סרקומרים ופעימות ספונטניות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
פרוטוקול זה משתלב ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי כך שהוא מאפשר מחקרים מכניסטיים מוקדמים, פיתוח בדיקות ומודלים תרגומיים של תתי-סוגים של תאי לב.
- ביולוגיה של התגליות: תומך בבדיקת היפותזות בנוגע להמרה של שושלת תאים המונעת על ידי גורמי שעתוק והגדרה של תת-סוגים.
- סריקה: מספק פלטים כמותיים וניתנים לשחזור של אימונוציטוכימיה ודימוי לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- אנליטיקה: מספק מדידות מבוססות ספירת תאים ומבוססות סמנים לצורך השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין יצירת תת-סוגים in vitro לבין מידול מחלות ומחקר קרדיאלי פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע זרימת עבודה ניתנת לשימוש חוזר למחקרי תכנות מחדש של תאי לב במספר תוכניות מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי במיתוג תת-סוגים של תאי לב ובבשלות תפקודית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי תכנות מחדש וכמות עבור הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) עבור יוזמות של רפגנרציה של הלב ומודלים של מחלות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של נכסי טיפול בתאי לב ומודלים של מחלות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרביות תאים, טרנסדוקציה ויראלית ואימונוציטוכימיה.
- נחושה גישה למיקרוסקופיה קונפוקאלית ולפאנלים מאושרים של נוגדנים לזיהוי תת-סוגים.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לפרוטוקולים של טיפול בתאים וכימות.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של גורמי תכנות מחדש וסממנים.
- היעילות תלויה בבריאות הפיברובלסטים ובטר בה ויראלי, כפי שנ supported על ידי נתוני המקור.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Retrovirus Production in Plat-E Cells
2:04
Hcn4-GFP Mouse Embryonic Fibroblast Seeding
2:57
Transduction and Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts
4:30
Immunostaining of Reprogrammed MEFs
6:01
Identification of Cardiac Subtypes Using Confocal Microscopy
6:56
Quantification of Sarcomere+ Cells
7:32
Results: Identification of Cardiomyocyte Sub-populations
8:44
Conclusion
