Name: הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: למדו שיטה לתכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים לתאי שריר לב מושרים תוך שימוש בגורמי שעתוק GHMT. הפרוטוקול מאפשר זיהוי וכימות של תתי סוגים קרדיאליים שונים לחקר המרת שושלת ויישומים רפואיים רגנרטיביים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.F.-P. נתמך על ידי מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע במסגרת מענק מס' 2015165336. N.V.M נתמך על ידי מענקים מה-NIH (HL094699), קרן Burroughs Wellcome (1009838) ו-March of Dimes (#5-FY14-203). אנו מודים ליאנג-ג'ה נאם, כריסטינה לובצ'יק ומינוטי בהקטה על תרומתם החשובה לפיתוח פרוטוקולים וניתוח נתונים. אנו מודים גם לג'ון שלטון על הקלט הטכני היקר ולחברי מעבדת מונשי על הדיון המדעי.

<ol><li>Sissman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+landmarks+in+cardiac+morphogenesis%3A+comparative+chronology%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology.</a> Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).</li>
<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).</li>
<li>Ali, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existing+cardiomyocytes+generate+cardiomyocytes+at+a+low+rate+after+birth+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).</li>
<li>Lin, Z., Pu, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+cardiac+regeneration+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Strategies for cardiac regeneration and repair.</a> Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231(2014).</li>
<li>Writing Group, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2016+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Song, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+repair+by+reprogramming+non-myocytes+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors.</a> Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).</li>
<li>Ieda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors.</a> Cell. 142 (3), 375-386 (2010).</li>
<li>Qian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+reprogramming+of+murine+cardiac+fibroblasts+into+induced+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes.</a> Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).</li>
<li>Fu, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+human+fibroblasts+toward+a+cardiomyocyte-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state.</a> Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).</li>
<li>Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1%2Fprotein+kinase+B+enhances+transcriptional+reprogramming+of+fibroblasts+to+functional+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+Is+a+Key+Epigenetic+Barrier+to+Direct+Cardiac+Reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming.</a> Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+reprogramming+of+fibroblasts+into+cardiomyocytes+requires+suppression+of+pro-fibrotic+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling.</a> Nat Commun. 6, 8243(2015).</li>
<li>Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+steady+progress+on+direct+cardiac+reprogramming+toward+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application.</a> Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).</li>
<li>Atkinson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+molecular+mapping+of+the+left+and+right+ventricular+His-Purkinje+conduction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks.</a> J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).</li>
<li>Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atrial+cardiomyocyte+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Atrial cardiomyocyte calcium signalling.</a> Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).</li>
<li>Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+the+mouse+ventricular+conduction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of the mouse ventricular conduction system.</a> Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).</li>
<li>Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25406392">How to make a cardiomyocyte.</a> Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).</li>
<li>Nam, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+diverse+cardiac+cell+types+by+reprogramming+fibroblasts+with+cardiac+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors.</a> Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConner%2C+DA+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+embryonic+fibroblast+cells+suitable+for+culturing+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (64), (2012).</li>
<li>Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein+pseudotyped+retroviral+vectors%3A+concentration+to+very+high+titer+and+efficient+gene+transfer+into+mammalian+and+nonmammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).</li>
<li>Ichim, C. V., Wells, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+high-titer+viral+preparations+by+concentration+using+successive+rounds+of+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation.</a> J Transl Med. 9, 137(2011).</li>
<li>Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+mouse+fibroblasts+into+cardiomyocyte-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).</li>
<li>Yang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+mouse+and+human+fibroblasts+to+functional+melanocytes+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors.</a> Nat Commun. 5, 5807(2014).</li>
<li>Muraoka, N., Ieda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+reprogramming+of+fibroblasts+into+myocytes+to+reverse+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis.</a> Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).</li>
<li>Bass, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+image+analysis+identifies+signaling+pathways+regulating+distinct+signatures+of+cardiac+myocyte+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

המחקר הנוכחי מספק אסטרטגיה ישיר תכנות מחדש לגיור של MEFs לתוך קבוצה מגוונת של תת הלב באמצעות ביטוי בתיווך רטרו-וירוס של שעתוק לב גורמי Gata4, Mef2c, Tbx5, ו Hand2 (GHMT). שימוש בגישת immunostaining זמנית בשילוב עם עכבר כתב PM-ספציפי, אנו מסוגלים לזהות IAM, iVMs, ו iPMs ברזולוצית תא בודד. כזה assay מאפשר עבור ניסוי במערכת במבחנה מסוגלת לבודד את תרומתם של גורמי שעתוק פרט כלפי מגוון תת סוג ופיתוח sarcomere. במקביל, זה יכול להביא תובנה גורמי שעתוק חדשים או מולקולות קטנות כי ה...

הלב הוא האיבר הפונקציונלי הראשון לפתח בעובר 1, 2. בשיתוף עם מערכת הדם, היא מספקת חמצן, חומרי הזנה, וכן מנגנון סילוק פסולת במהלך פיתוח. שלושה שבועות לאחר ההפריה, הלב האנושי פועם בפעם הראשונה והרגולציה הראויה מתוחזק על ידי cardiomyocytes (CMS). ההפסד בלתי הפיך של תאים מיוחדים אלה היא אפוא הנושא היסודי אותו אי ספיקת לב מתקדמת. בעוד כמה אורגניזמים כגון דג הזברה Xenopus יש פוטנציאל להתחדשות לב, הלב של יונקי הבוגרים מוגבל יותר 3, 5, 6. לפיכך, בהתחשב הפונקציה הקריטית של הלב, אין זה מפתיע כי מחלת לב היא הגורם המוביל למוות בעולם, והיוותה 600,000 מקרי מוות בארצות הברית לבדה 7. הrefore, טיפולים מבוססי תאים כדי לתקן או להחליף את שריר הלב נפגע ביעילות הם עניין קליני גדול. המחקר הזרע של יאמאנאקה ועמיתיו 8 הראה כי ביטוי כפוי של ארבעה גורמי שעתוק מספיק כדי להמיר תאי פיברובלסטים בדיל באופן מלא לתאי גזע פלוריפוטנטיים. עם זאת, יכולת tumorigenic של כל אסטרטגיות תאי גזע פלוריפוטנטיים כבר דאגה קריטית בשימוש שלהם למטרות טיפוליות. זה הניע התחום המדעי לחפש שיטות חלופיות כדי transdifferentiate תאים תוך הימנעות שלב פלוריפוטנטיים. לאחרונה, מספר קבוצות הראו את הכדאיות של אסטרטגיה זו על ידי הצגת המרה ישירה של פיברובלסטים עכבר לתאי cardiomyocyte דמוי המושרה (iCLMs) עם ביטוי אקטופי של שעתוק גורמי Gata4, Mef2c, Tbx5, ובהמשך, Hand2 (GMT ו GHMT 9, בהתאמה), 10. Furthermore, באותה האסטרטגיה ניתן לבצע in vivo ו ברקמות אדם נגזר 9, 11, 12. מחקרים שנעשה לאחרונה הדגישו גורמים נוספים או מסלולי איתות כי יכול להיות מווסת כדי לשפר את יעילות תכנות מחדש של לב עוד 13, 14, 15. יחדיו, מחקרים אלה להדגים את הפוטנציאל של transdifferentiation ביים עבור טיפולים רגנרטיבית. עם זאת, היעילות הנמוכה של תכנות מחדש CM, המנגנונים המולקולריים הידועים, שחזור עולה בקנה אחד בשל הבדלים מתודולוגיים 16, ואת האופי הטרוגני של iCLMs להישאר unaddressed. על מנת ישירות להעריך ההטרוגניות iCLM, עצבנו assay בדידה החזקה תא בודד לזיהוי התפתחות sarcomere ו specificatio שושלת לבn ושניים מאפיינים דרושים של cardiomyocytes הפונקציונלי. יש לפחות שלושה סוגים עיקריים של CM בלב כהגדרתו לפי המיקום שלהם תכונות חשמליות ייחודי: פרוזדורים (PM), חדרית (VM) ו קוצב לב (PM) 17, 18, 19, 20. בשנת מערך מתוזמר, הם לאפשר שאיבה הנכונה של דם. במהלך פגיעה לבבית, אחד או כל תת עלול להיפגע, ואת הסוג של טיפול בתא היה צורך לטפל על בסיס כל מקרה לגופו. כיום, רוב האסטרטגיות להתמקד בדור הכולל של cardiomyocytes, בעוד מעט עבודה נעשתה כדי ללמוד את המנגנונים המולקולריים אשר מסדיר מפרט תת סוג. המחקר הבא מפרט כיצד לכמת כראוי סרקומר מאורגן היטב לזהות קבוצה מגוונת של תת cardiomyocyte. באמצעות קוצב לב (PM) עכבר כתב -specific, אנו מסוגלים להחיל iהגישה mmunocytochemical להבחין מיוציטים המושרה דמוי פרוזדורים (IAM), myocytes חדרית דמוי המושרה (IVM), ו myocytes PM דמוי המושרה (iPMs) 21. בהתבסס על התצפיות שלנו, רק תאים כי תערוכת ארגון sarcomere מסוגלים פועם ספונטני. פלטפורמת תכנות מחדש ייחודית זו מאפשרת להערכת התפקיד פרמטרים מסוימים של בארגון sarcomere, מפרט תת סוג, והיעילות של תכנות מחדש CM ברזולוציה תא בודד.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td>רכיב של מדיה iCLM, מדיה Plat-E, פיברובלסטים ומדיה טרנספקציה</td></tr><tr><td>מדיום 199</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11150059</td><td>רכיב של מדיה iCLM</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>Sigma</td><td>F2442</td><td>רכיב של מדיה iCLM, מדיה Plat-E, פיברובלסטים ומדיה טרנספקציה</td></tr><tr><td>אינסולין-טרנספרין-סלניום G</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>41400-045</td><td>רכיב של מדיה iCLM</td></tr><tr><td>תמיסת ויטמין MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11120-052</td><td>רכיב של מדיה iCLM</td></tr><tr><td>חומצות אמינו MEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1601149</td><td>רכיב של מדיה iCLM</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140-050</td><td>רכיב של מדיה iCLM</td></tr><tr><td>אנטיביוטיקה-אנטימיקוטיקה</td><td>תרמו פישר 15240062 מדעי</td><td></td><td>רכיב של תוסף מדיה iCLM</td></tr><tr><td>B-27</td><td>תרמו פישר 17504044</td><td></td><td>מדעי רכיב של מדיה iCLM</td></tr><tr><td>סרום סוס מומת בחום</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>26050-088</td><td>רכיב של מדיה iCLM</td></tr><tr><td>NaPyruvate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-70</td><td>רכיב של מדיה iCLM</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמו Fisher Scientific</td><td></td><td>1514022 רכיב של מדיה Plat-E ומדיה פיברובלסטים</td></tr><tr><td>Puromycin&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11139-03</td><td>רכיב של מדיה Plat-E</td></tr><tr><td>Blasticidin&nbsp; &nbsp;</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>400-128P</td><td>רכיב של מדיה</td></tr><tr><td>Plat-E Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050-061</td><td>רכיב של מדיה פיברובלסטים</td></tr><tr><td>סריקת לייזר קונפוקלית LSM700</td><td>Zeiss</td><td></td><td>לניתוח קונפוקלי</td></tr><tr><td>FuGENE 6 מגיב טרנספקציה</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>מגיב טרנספקציה&nbsp;</td></tr><tr><td>Opti-MEM סרום מופחת בינוני</td><td>תרמו פישר סיינטיפיקציה</td><td>31985-070</td><td>מגיב טרנספקציה&nbsp;</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>מגיב אינדוקציה. יש להשתמש בריכוז סופי של 8 &mu; M/mL</td></tr><tr><td>Platinium-E (PE) קו תאי פקגין רטרו-ויראלי, Ecotropic</td><td>CellBiolabs</td><td>RV-101</td><td>קו תאי פאקקינג רטרו-ויראלי</td></tr><tr><td>טריפסין 0.25% EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>עבור MEFs ו-Plat-E דיסוציאציה</td></tr><tr><td>של עכבר אנטי ואלפא;-אקטינין (שיבוט EA-53)</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td>נוגדן לניתוח קונפוקלי. השתמש ב-1:200</td></tr><tr><td>עוף אנטי-GFP IgY</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10262</td><td>נוגדן לניתוח קונפוקלי. לשימוש ב-1:200</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti-NPPA&nbsp;</td><td>נוגדן AP8534A אבג'נט</td><td></td><td>לניתוח קונפוקלי. לשימוש ב-1:400</td></tr><tr><td>Rabbit Pab anti Myl2 IgG&nbsp;</td><td>נוגדן ProteinTech</td><td>10906-1-AP</td><td>לניתוח קונפוקלי. השתמש בתמיסת Vectashield בשעה 1:200</td></tr><tr><td>עם DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td> <td>Vector Labs</td><td>H-1500</td><td>צבע לניתוח קונפוקלי</td></tr><tr><td>Superfrost Plus שקופיות מיקרוסקופ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>25 x 75 x 1.0 מ"מ</td></tr><tr><td>BioCoat Fibronectin 12 מ"מ</td><td>NeuVitro Corp</td><td>GG-12-1.5</td><td>כיסויים לניתוח קונפוקלי</td></tr><tr><td>100 &mu; מסננת תאים m</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; m מסנני מזרקים SFCA 25 מ"מ</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>09-740-106</td><td>לסינון וירוסים</td></tr><tr><td>6 מ"ל מזרקים</td><td>Covidien</td><td>8881516937</td><td>לסינון וירוסים</td></tr><tr><td>עז נגד עוף IgY (H& L) A488</td><td>Abcam</td><td>AB150169</td><td>נוגדן משני לניתוח קונפוקלי. לשימוש ב-1:400</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב A647 IgG(H+L)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31573</td><td>נוגדן משני לניתוח קונפוקלי. השתמש ב-1:400</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG(H+L) A555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>נוגדן משני לניתוח קונפוקלי. לשימוש ב-1:400</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>93443-100ml</td><td>לחדירות תאים&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS של Dulbecco ללא CaCl2 ו-MgCl2 (D-PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Power Block 10x מגיב חסימה אוניברסלי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9495720</td><td>לדלל ל-1x ב-H2O</td></tr><tr><td>16% תמיסה מימית פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>Electro Microscopy Sciences&nbsp;</td><td>15710</td><td>שימוש ב-4% מדולל ב-dH2O</td></tr><tr><td>6 ס"מ& צלחות</td><td>אולימפוס</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 6 בארות</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>צלחות 24 בארות</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107</td><td></td></tr><tr><td>10 ס"מ כלי תרבית רקמות</td><td>קורנינג</td><td>4239</td><td></td></tr><tr><td>15 ס"מ&nbsp; כלי תרבית רקמות</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>5442</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>קורנינג</td><td>4308</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינורות חרוטיים</td><td>קורנינג</td><td>4249</td><td></td></tr><tr><td>0.4% תמיסה כחולה טריפאן</td><td>סיגמא</td><td>T8154</td><td>לכדאיות</td></tr><tr><td>אתיל אלכוהול 200 הוכחה</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>7005</td><td></td></tr><tr><td>אקונומיקה</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>6009</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכה תת סוגי cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

תכנות מחדש ישיר של סוג תא אחד למשנהו התגלה לאחרונה כפרדיגמה רבת עוצמה לרפואה רגנרטיבית, מידול מחלות ומפרט שושלת. בפרט, ההמרה של פיברובלסטים למיוציטים דמויי קרדיומיוציטים מושרים (iCLMs) על ידי Gata4, Hand2, Mef2c ו-Tbx5 (GHMT) מייצגת דרך חשובה ליצירת מיוציטים לבביים דה נובו במבחנה וב-vivo. עדויות עדכניות מצביעות על כך ש-GHMT מייצר מגוון גדול יותר של תת-סוגים לבביים ממה שהוערך בעבר, ובכך מדגיש את הצורך בגישה שיטתית לביצוע מחקרים נוספים. עם זאת, לפני שניתן להשתמש בתכנות מחדש ישיר כאסטרטגיה טיפולית, יש להבין בפירוט את היסודות המכאניסטיים של המרת שושלת כדי ליצור תת-סוגים לבביים ספציפיים. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט ליצירת iCLMs על ידי תכנות מחדש בתיווך GHMT של פיברובלסטים עובריים של עכברים (MEFs). 
אנו מתארים שיטות לבידוד MEF, ייצור רטרו-ויראלי וזיהום MEF כדי להשיג תכנות מחדש יעיל. כדי לקבוע את זהות תת-הסוג של תאים מתוכנתים מחדש, אנו מפרטים גישה שלב אחר שלב לביצוע אימונוציטוכימיה על iCLMs באמצעות קבוצה מוגדרת של נוגדנים תואמים. מוצגות גם שיטות למיקרוסקופיה קונפוקלית, זיהוי וכימות של iCLMs ותתי סוגים בודדים של פרוזדורים (iAM), חדרים (iVM) וקוצב לב (iPM). לבסוף, אנו דנים בתוצאות מייצגות של ניסויי תכנות מחדש ישיר טיפוסיים ומדגישים היבטים טכניים חשובים של הפרוטוקול שלנו כדי להבטיח המרה יעילה של שושלת. יחד, הפרוטוקול האופטימלי שלנו אמור לספק גישה מדורגת לחוקרים לבצע ניסויי תכנות מחדש לבביים משמעותיים הדורשים זיהוי של תת-סוגים בודדים של CM.

ניצול של העכבר הכתב PM-ספציפי, פיתחנו אסטרטגיה immunostaining זמנית לזהות מיוציטים אנדוגני מגוונים כמו מתואר באיור 1. בעקבות צעדי תכנות מחדש שמוצגים באיור 2, אינדוקציה של CMS ספציפי תת סוג ניתן לאתר מוקדם ככל יום 4 21, אם כי שיעור נמוך. במשך היום 14, הניסוי ניתן לעצור שלהם ונבחנת לגביהם ארגון sarcomere (איור 3) וסוג משנה-מפרט (איור 4). איור 5</strong...

כתב יד זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירה וכימות של תת-סוגים לבביים מגוונים שתוכנתו מחדש באמצעות אספקה מתווכת רטרו-וירוס של Gata4, Hand2, Mef2c ו-Tbx5.

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להפיק ולכמת קבוצה מגוונת של תתי-סוגי תאי שריר לב (cardiomyocytes) מושראים. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות יסוד מרכזיות הנוגעות להמרת שושלת ספציפית לתת-סוג במהלך תכנות מחדש של הלב, כגון הרמזים הדרושים המבקרים את הרכבת הסרקומר ואת קביעת תת-הסוג. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה לכימות ההשפעות על קביעת תת-סוגי תאי שריר לב, דבר הדרוש לביצוע מחקרי מנגנונים.ראשית, בודדו פיברובלסטים עובריים של עכבר מעוברים בשלב E 12.5. אחסנו אותם בחנקן נוזלי כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, קצרו תאי plat-E והעבירו אותם לפלטה בעלת שש בארות בריכוז של מיליון תאים לבארה, כך שהתאים יגיעו ל-70 עד 80% התמזגות (confluency) תוך 24 שעות.כסו את התאים במצע טרנספקציה והדגירו אותם בתנאי תרבית סטנדרטיים. יום אחד לפני יום הניסוי, קחו מבחנה קונית מפוליסטירן בנפח 15 milliliters וערבבו 60 microliters של מצע עם סרום מופחת עם שש microliters של ריאגנט טרנספקציה לכל תגובה. הדגירו את התערובת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.כיוון שאתם משתמשים ברכיב טרנספקציה, הוסיפו את הרכיב ישירות למצע בעל ריכוז סרום מופחת כדי למנוע ירידה ביעילות הטרנספקציה. לאחר מכן, הוסיפו סך כולל של 2 µg מתמונית GHMT לכל תגובה, והקישו בעדינות על המבחנה כדי לערבב. דגרו את התגובה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הוסיפו את התערובת לתאי plat-E בטיפות.רשמו את התאריך והשעה של הטרנספקציה. דגרו את תאי ה-plat-E שעברו טרנספקציה למשך לילה. שעה לפני זריעת הפיברובלסטים העובריים של העכבר, הכינו פלטת 24 בארות עבור אימונו-ציטוכימיה על ידי הוספה של כיסויי זכוכית (coverslips) בקוטי של 12 מילימטר מצופים בפיברונקטין לכל בארה.בשלב הבא, הוסיפו 300 µL של תמיסת קולגן בקר לכל באר והדגרירו את הפלטה למשך שעה אחת. לקראת סיום ההדגירה, הפשיתו מבחנה קפואה של פיברובלסטים עובריים של עכבר מסוג HCN4GFP. ביצעו הפשרה מהירה לתאים, שטפו אותם פעם אחת עם מצע גידול לפיברובלסטים שחומם מראש, וספרו את ריכוז התאים החיים.לאחר מכן, שאבו את תמיסת הציפוי מלוח 24 הבארים והזריקו באופן מיידי 30,000 תאים לבאר על גבי לביבות הזכוכית המצופות בקולגן ופיברונקטין. 24 שעות לאחר הטרנספקציה, סננו את המצע הרטרו-ויראלי דרך מסנן צלולוז אצטט נטול סורפקטנט עם גודל נקבוביות של 0.45 מיקרון, והעבירו אותו למבחנה קונית של 15 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו polybrene עד לריכוז סופי של 8 µg/mL.מלאו בזהירות את תאי ה-plat-E בשני מיליליטר של מצע טרנספקציה טרי. החלפה מהירה מדי של המצע עלולה לגרום להינתקות התאים. תאי plat-E המתוחזקים כראוי מייצרים בממוצע עשרה מיליון יחידות זיהום למיליליטר.ביטוי גבוה של GFP ועוצמה ביותר מ-95% מהתאים מעידים בדרך כלל על הצלחה ביצירת מיוציטים דמויי קרדיומיוציטים מושריים באמצעות GHNT. לאחר מכן, שאבו את המצע מהפיברובלסטים העובריים המגודלים והוסיפו את מצע הרטרו-וירוס שנאסף טרי. לאחר מכן, החזירו את הצלחת לאינקובטור והדגירו למשך הלילה.ביום למחרת, העבירו שוב את המדדימ מהתאי plat-E אל הפיברובלסטים העובריים. השליכו את תאי ה-plat-E לאחר איסוף הנגיף השני. 48 שעות לאחר ההשראה, שאבו את המדדימ של התאים ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS.לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של מצע להשראת תאי שריר לב (induced cardiomyocyte-like myocyte media) שחומם מראש לכל באער בלוח של 24 באערים. החליפו את המצע מדי יומיים עד שלושה ימים במשך 12 הימים הבאים. 14 ימים לאחר ההשראה, שאבו בזהירות את המצע ושטפו כל באער עם 300 µL של PBS קר מאוד.לאחר מכן, הסירו את ה-PBS והוסיפו 250 microliters של תמיסת פאראפורמלידהיד 4% לכל באר, והדגירו את התאים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בצעו פרמיאביליזציה לתאים על ידי שטיפת הבאערים שלוש פעמים למשך חמש דקות עם 300 microliters של 0.1% tritonex 100 ו-PBS. שאבו את תמיסת הפרמיאביליזציה העודפת לאחר השטיפה האחרונה, ולאחר מכן הוסיפו באפר חסימה אוניברסלי בנפח של 300 microliters לבאר.בצעו חסימה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. צבעו זוג אחד של סליידים למשך לילה עם נוגדנים mouse anti-alpha actenin, chicken anti-GFP ו-rabbit anti-NPPA כדי לזהות מיוציטים דמויי קוצבי לב מושריים בתוך מיוציטים דמויי עלייה מושריים. למחרת, שטפו את הבארות והוסיפו את הנוגדן המשני המתאים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף.לאחר שטיפות נוספות, הוסף 2.4 µL של תמיסת קיבוע (mounting media) לזכוכית של שקופית מיקרוסקופ. קח כיסוי זכוכית (cover slip) מלוח ה-24 באריים והסר את עודפי התמיסה. לאחר מכן, העבר אותו לשקופית הזכוכית עם תמיסת הקיבוע.עבור כל סלייד, התחל מקצה אחד וסרוק מעלה ומטה בערוץ הפלואורסצנציה האדום כדי לזהות תאים חיוביים ל-sarcomere וחיוביים ל-alpha-actinin. את הפסים של ה-sarcomere קל ביותר לזהות באורך גל של 555 nanometer. לאחר הזיהוי, עבור לערוץ הירוק וציין אם התאים חיוביים.לאחר מכן, עברו למחשב כדי לבחון את אורך הגל באזור התמרור האדום הרחוק (647 ננומטר) כדי לחפש צביעה של NPPA או MYL2. תאים שהם חיוביים ל-alpha-actinin, חיוביים לסרקומר, שליליים ל-Hnc4-GFP וחיוביים ל-Nppa הם מיוציטים דמויי עליות שעברו השראה. צביעת Nppa תופיע באופן פרא-גרעיני ונקודתי.ראשית, ספרו את מספר התאים 24 שעות לאחר הזריעה כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. לאחר מכן, בצעו בדיקה ויזואלית של כל תא על לית ג XS (cover slip) כדי לוודא צביעה תקינה של alpha-actinin ושל הסרקומר (sacromere), ורשמו את מספר התאים שנצבעו באופן חיובי עבור שני הסמנים. לבסוף, חלקו את המספר במספר התאים הכולל שנזרעו בפועל.ניסוי תכנות מחדש ממוצע יניב כ-1% של תאים החיוביים הן ל-alpha-actinin והן לסרקומרים. ביום ה-14, ניתן להפסיק את הניסוי ולהעריך את ארגון הסרקומרים. הדבר מזוהה על ידי צביעת alpha-actinin חיובית המוצגת כאן בצבע אדום.רק תאים המפגינים ארגון של סרקומרים מסוגלים לפעום באופן ספונטני, ולכן זוהי בדיקה ראשונית טובה. מוצגים כאן תאי שריר לב (cardiomyocytes) דמויי קוצב לב מושריים מעכברי דגם עם reporter של Hcn4-GFP. שלושה תאים במבט זה מפגינים ארגון של סרקומרים.שלושה צבירי תאים חיוביים ל-Hcn4-GFP נמצאים במרכז התמונה וניתן לזהותם כסוג תאי קוצב. תא אחד בפינה השמאלית התחתונה נצפה עם צביעת alpha-actinin, אך ללא ארגון סרקומרים או סמן תת-סוג שניתן לזיהוי. באוכלוסייה זו של קרדיומיוציטים מושריים דמויי חדרים, התא המרכזי מראה ארגון סרקומרים; תא זה נצבע גם באופן חיובי לסמן שרשרת אורקל של מיוזין MYL-2, המהווה סמן לקרדיומיוציטים של החדרים.לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את זריעת התאים ואת הטרנספקציה של תאי plat-E תוך שעה אחת. השראת הפיברובלסטים העובריים של העכבר אורכת בין שעה לשעתיים, וכביו-קוונטיפיקציה של myto עבור פלטה מלאה בעלת 24 בארות אורכת כשמונה שעות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי פיברובלסטים עובריים בריאים של עכבר ונגיפים בעדירות גבוהה הם המפתח לניסוי תכנות מחדש מוצלח.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק ולכמת תת-סוגים בודדים של קרדיומיוציטים מושריים.

assessing-cardiomyocyte-subtypes-following-transcription-factor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרופיל יחיד ביטוי התא מאפשר את הגן מפורט ביטוי בניתוח של תאים בודדים. אנו מתארים שיטות הבידוד של cardiomyocytes, והכנת lysates וכתוצאה מכך עבור microarray או transcriptome qPCR כולו או מטרות ספציפיות.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

המאמר מתאר את המתודולוגיה מפורטת להבחין ביעילות תאי גזע pluripotent אנושיים לשריר לב על ידי באופן סלקטיבי ויסות מסלול Wnt, ואחרי ניתוח cytometry זרימה של סמני התייחסות להעריך הומוגניות וזהותה של האוכלוסייה.

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

אנו מתארים כאן פרוטוקול ליצירת iCMs באמצעות מסירה בתיווך רטרו-וירוס של Gata4, Tbx5 ו-Mef2c במבנה פוליציסטרוני. פרוטוקול זה מניב אוכלוסייה הומוגנית יחסית של תאים מתוכנתים מחדש עם יעילות ואיכות משופרים והוא בעל ערך למחקרים עתידיים של תכנות מחדש של iCM.

דור משופר של המושרה cardiomyocytes שימוש Construct Polycistronic הבעת יחס אופטימלי של Gata4, Mef2c וTbx5

תקנת כוונון עדינה של שעתוק גנים בבסיס החלטת גורל תא עוברי. בזאת, אנו מתארים מבחני immunoprecipitation הכרומטין לשמש כדי לחקור תקנה אפיגנטיים של שני בידול הלב של תאי גזע ופיתוח הלב של עוברי עכברים.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

פרוטוקול זה מתאר שיטה שלב אחר שלב לבידוד הניתן לשחזור ותרבית ארוכת טווח של קרדיומיוציטים של עכברים בוגרים עם תפוקה, טוהר וכדאיות גבוהים.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

הפרוטוקול המתואר כאן מפרט את השראת תוכנית המוגנית בפיברובלסטים עובריים של עכברים באמצעות ביטוי יתר של קבוצה מינימלית של גורמי שעתוק. טכנולוגיה זו עשויה להיות מתורגמת למערכת האנושית כדי לספק פלטפורמות למחקר עתידי של המטופואיזה, מחלות המטולוגיות והשתלת תאי גזע המטופויאטיים.

תכנות מחדש עכבר עוברי פיברובלסטים עם גורמי שעתוק כדי לגרום תכנית Hemogenic

כדי להבחין בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא בקרדיומיוציטים, אנו מציגים פרוטוקולים המשתמשים בשני קווי עכברים טרנסגניים: עכברים טרנסגניים Myh6-H2B-mCh, לזיהוי חד משמעי של גרעיני קרדיומיוציטים, ועכברי CAG-eGFP-אנילין, להבחנה בין חלוקת תאים לשינויים במחזור התא.

ויזואליזציה של וריאציות מחזור התא וקביעת נוקלאציה ב אחרי לידה cardiomyocytes

כאן, אנו מציגים שיטה יעילה לרתום את הפוטנציאל בידול הלב של מקורות צעיר של גזע mesenchymal האנושי על מנת ליצור תאים פונקציונלית, קבלנות, כמו cardiomyocyte אין ויטרו.

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

כאן אנו מציגים שיטה חזקה לתכנת fibroblasts עובריים הראשי לתוך cardiomyocytes פונקציונלי. דרך ביטוי של GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, מיר-1, ומיר-133 (GHMT2m) לצד עיכוב של TGF-β איתות. פרוטוקול שלנו יוצרת מכות cardiomyocytes מוקדם ככל 7 ימים שלאחר התמרה חושית עם עד 60% יעילות.

דיכוי של Pro-fibrotic איתות Potentiates בתיווך גורם התכנות של העכבר מתחלקים Fibroblasts לתוך Cardiomyocytes המושרה

אנו מתארים כאן, את הקמתו ויישום של Tg(Myh6-cre)1Jmk / J / GT (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze / J (המכונה αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 להלן) קו כתב עכבר להערכת תכנות לב. פיברובלסטים לב ילודים (NCFs) מבודדים מזן העכבר מומרים לקרדיומיוציטים מושרה (iCMs), ומאפשרים הערכה נוחה ויעילה של יעילות תכנות מחדש והתבגרות תפקודית של iCMs באמצעות שטף סידן (Ca2+).

הערכה במבחנה של תכנות לב מחדש על ידי מדידת שטף סידן ספציפי לב עם כתב GCaMP3

למדו שיטה לתכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים לתאי שריר לב מושרים תוך שימוש בגורמי שעתוק GHMT. הפרוטוקול מאפשר זיהוי וכימות של תתי סוגים קרדיאליים שונים לחקר המרת שושלת ויישומים רפואיים רגנרטיביים.

הערכה תת סוגי Cardiomyocyte בעקבות תמלול פקטור בתיווך תכנות מחדש של פיברובלסטים עכבר עובריים

גלה סרטונים נוספים