ניתוח התכווצות האוטומטי של רקמת לב Engineered האנוש להקרנת בטיחות תרופת לב
15 באפריל 2017
כאן, אנו מציגים את הדור של רקמת לב מהונדסים אנושי מתאי גזע מושרים (hiPSC) -derived cardiomyocytes. אנו מציגים שיטה לנתח בכוח התכווצות ושינוי למופת של דפוס כיווץ ידי מעכב ערוץ hERG E-4031. שיטה זו מציגה רמה גבוהה של חוסן ויכולת התאמת הקרנת סמי לב.
המטרה הכוללת של טכניקה זו היא ליצור רקמת לב מהונדסת תלת מימדית שיכולה לשמש כפלטפורמה לניתוח התכווצות במבחנה לסינון תרופות ומידול מחלות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הלב לגבי מודלים של מחלות, פרמקולוגיה בטיחותית וההשפעות של וריאנטים גנטיים, או תרופות על כוח התכווצות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למדוד את כוח ההתכווצות ברקמות לב מהונדסות ממינים שונים בתנאים סטריליים, לפרקי זמן ממושכים.
מדענים חדשים בשיטה זו עלולים להיאבק בחוסר איכות תאית. או חוסר במדיום. חשוב לייעל את ההכנה העצמית ולהימנע ממחזורים של ההדגמה של הליך זה יהיו אניקה בנזין ואומבר סלים.
לפני תחילת ההליך, הוסף 1.6 מיליליטר של אגרוז חם של שני אחוזים לבארות העזרה הראשונה של צלחת 24 בארות. והניחו מיד פוליטטרפלואורואתילן במרווחים לתוך האגרוז. לאחר כעשר דקות בטמפרטורת החדר, האגרוז יהפוך אטום, מה שמסמל את התמצקותו.
הסר את המרווחים והנח מדפי PDMS לתוך היציקות כך שזוגות עמודי מתלה יגיעו לכל תבנית אגרוז. כאשר כל המדפים הונחו, אנו משעים את הקרדיומיוציטים בתווך בריכוז מינימלי של 1.5 פעמים 10 לשבעת התאים למיליליטר ומערבבים מחדש טריים עם פיברינוגן 10 עד 15 פעמים עם הפיפטה הסרולוגית עד להמסת קריש הפיברינוגן. בדוק את תערובת הבנייה מחדש בפיפטה להומוגניות.
לאחר מכן, עבור כל רקמת לב מהונדסת, או EHT, מערבבים 100 מיקרוליטר של תערובת בנייה מחדש עם שלושה מיקרוליטרים של תרומבין בשפופרת של 200 מיקרוליטר. ומיד מכניסים 100 מיקרוליטר מתערובת תרומבין EHT זו לחריצי האגרוז. השתמש בקצה מסנן חדש עבור כל EHT.
לאחר שכל החריצים התמלאו בתערובת בנייה מחדש, סגרו את המכסה של צלחת תרבית התאים ודגרו על התכשירים למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ושבעה אחוזים פחמן דו חמצני. בתום הדגירה מניחים את הצלחת במכסה מנוע סטרילי ומכסים כל באר ב -200 עד 500 מיקרוליטר בינוני. נענע את הצלחת בעדינות והחזיר את ה- EHT לחממה.
לאחר 10 דקות, העבירו בזהירות את המדפים לצלחת חדשה של 24 בארות המכילה 1.5 מיליליטר מדיום EHT לבאר והניחו את הצלחת בחממת תרבית תאים בתנאי התרבות המתאימים. האכלת ה- EHT בכל יום שני, רביעי ושישי, על ידי העברת מדפי ה- PDMS לצלחת שנייה עם מדיום טרי. שבעה עד 10 ימים לאחר היציקה, ה-EHT צריכים להפגין התכווצויות ספונטניות המסיטות את עמודי מדפי ה-PDMS.
כדי לנתח את התכווצויות ה- EHT, ביום הניסוי, הפעל את מכשיר החימום במכשיר הניתוח EHT שעתיים לפני המדידה. מיד לפני הניתוח, הפעל את אספקת הגז והאלקטרוניקה של מערכת הציר. להקלטה בסיסית, הנח את לוחית ה- EHT במכשיר ניתוח ה- EHT והפעל את תוכנת ניתוח ההתכווצות בהתאם להוראות היצרן.
השתמש בהוראות מדריך התוכנה כדי להתחיל ריצה חדשה, לחץ על לשונית הפרוטוקול כדי להזין את פרטי המחקר הרלוונטיים. פתח את כרטיסיית ההגדרה ובחר את הבארות לניתוח. בשל אילוצי זמן, זה מודגם רק עבור שני EHT בסרטון זה.
לאחר מכן לחץ על המצלמה view הכרטיסייה והתחל את מצב המצלמה בשידור חי עם מצב זיהוי דמות אוטומטי. התאם את מיקום המצלמה עם קואורדינטות ה-xyz עבור כל באר שנבחרה בצלחת 24 הבארות, תוך הקפדה שכל EHT יהיה במרכז החלון ובפוקוס. ודא שהצלבים הכחולים נמצאים בקצה העליון והתחתון של ה-EHT ונעים כדי להתאים להתכווצויות של ה-EHT.
ולחץ על כפתור המיקום בסדר כדי לשמור את מיקומי ההגדרה של כל באר. כעת לחץ על לשונית הפרמטרים כדי להגדיר את הקריטריונים לפיהם התוכנה מזהה שיא כיווץ ומסמנת את הפסגות בריבועים ירוקים. שמור את כל ההגדרות שהוזנו על ידי לחיצה על כפתור פרמטרי השימוש בכל הבארות.
לאחר מכן לחץ על הכרטיסייה האוטומטית ועל כפתור ההתחלה כדי לתעד את התכווצויות ה- EHT הבסיסיות ולחשב את התכווצות הבסיס הספונטנית עבור כל EHT. ניתוח ההתכווצות בזמן אמת יוצג בכרטיסייה בזמן אמת. ודא שהצלבים הכחולים נעים רק אנכית כדי להתאים להתכווצויות של ה- EHT.
כדי לנתח את ההשפעות של תרופה ספציפית מעניינת על ההתכווצויות, העבירו תחילה צלחת של 24 בארות מלאה בתמיסת בלוטת התריס נטולת חלבון מתחת למכסה המנוע הסטרילי והניחו אלקטרודות פחמן לבארות. העבירו את ה-EHT במדפי ה-PDMS שלהם על גבי האלקטרודות והחזירו את ה-EHT לחממה. לאחר כחצי שעה, הנח את ה-EHT לתוך האינטרלוק של מכשיר הניתוח EHT ורשום את ההתכווצות הבסיסית הספונטנית למשך 20 שניות לכל EHT.
לאחר מכן, חבר את אלקטרודות הפחמן לכבל קוצב והתחל לגרות חשמלית את ה- EHT. רשום את קו הבסיס בקצב למשך 10 שניות לכל EHT, תוך הקפדה על כך שכל ה-EHT יהיו בקצב נכון. אות הקצב מסומן כעת בקווים אנכיים כחולים, הכלולים בשתל הכיווץ לפני כל שיא.
לאחר ההקלטה הבסיסית, העבירו את האלקטרודות ואת מדפי ה-PDMS לצלחת חדשה של 24 בארות המכילה את ריכוז התרופה הראשון והחזירו מיד את ה-EHT לאינטרלוק של מכשיר ניתוח ה-EHT למשך 20 דקות. חבר מחדש את כבלי הקצב, התאם את זיהוי הדמות ורשום את התכווצויות ה- EHT בתגובה לריכוז התרופה הראשון. לאחר שכל ריכוזי התרופות נבדקו, שמור את כל הקלטות ה-PDF שהתקבלו ובדוק כל הקלטה לזיהוי דמות ומיקום נכון של ריבועי שיא ההתכווצות והחפצים.
לניתוח לא מקוון, לחץ על בחר הפעלה עבור ההפעלה המתאימה ממסד הנתונים המופעל ובכרטיסיה פרמטר, שנה את הפרמטר עבור ניתוח הכיווץ. לאחר מכן, בכרטיסייה הלא מקוונת, בחר ניתוח לא מקוון כדי לנתח מחדש את הסרטונים. כדי להתאים את זיהוי הדמות ולהקליט קובץ וידאו חדש.
התאם את זיהוי האיורים בכרטיסייה בזמן אמת ובחר סקירה לדוגמה. ה-EHT ינותח כעת בהתאם לעמדות החדשות. הניתוח של כל EHT מבוסס על זיהוי דמויות בקצה העליון והתחתון של הרקמה.
לאחר מכן, התכווצויות ה-EHT המצולמות מנותחות באופן אוטומטי על ידי אלגוריתם תוכנת מכשיר הניתוח EHT והפסגות נקבעות על פי הקריטריונים הרלוונטיים שהוגדרו מראש. המדידה ארוכת הטווח של ניתוח התכווצות EHT מדגימה כי אין שינויים תלויי זמן לכאורה בכוח ההתכווצות, תדירות הפעמה, התכווצות T1 או זמני הרפיית T2 עד 20 שעות. מה שמעיד על רמת יציבות גבוהה עבור המבנים.
ואכן, התוצאות עבור כל אות EHT מסוגלות לשחזר עם שונות נמוכה. חשיפה לחוסם תעלות hERG לעומת זאת, מביאה להארכה משמעותית של זמן ההרפיה של T2, החל מהריכוז. ודפוס פעימות לא סדיר בריכוזים גבוהים יותר.
לאחר השליטה, ניתן לייצר 24 EHT תוך 30 דקות אם ההכנה מבוצעת כראוי. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מידול מחלות לחקור את ההשפעה של וריאנטים גנטיים במבחנה. הרבגוניות של מודל זה, מאפשרת לשלב אותו עם תאי גזע מושרים אנושיים או טכנולוגיית עריכת הגנום.
בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות נוספות כמו היסטולוגיה או RNA וניתוח חלבונים כדי לענות על שאלות נוספות לגבי שעתוק וביטוי גנים. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג טוב כיצד ללהק ולנתח את EHT. אם יש לך שאלות כלשהן בנוגע להליך זה, אנא אל תהסס ופנה אלינו ישירות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים יצירה של רקמת לב מהונדסת תלת-ממדית מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים אנושיים (hiPSCs) לצורך ניתוח התכווצות in vitro. השיטה מאפשרת הערכה של כוח ההתכווצות והשפעתם של סוכנים פרמקולוגיים, כגון מעכב תעלת hERG ששמו E-4031, על דפוסי ההתכווצות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- הנדסת רקמות לב
- פרמקולוגיה
- מחקר תאי גזע
רקע
- רקמות לב מהונדסות יכולות לדמות מחלות לב.
- פלטפורמות in vitro חיוניות לסריקת תרופות ופרמקולוגיה של בטיחות.
- הבנת כוח ההתכווצות היא קריטית להערכת תפקוד הלב.
- האתגרים כוללים שמירה על איכות התאים ואופטימיזציה של תנאי התרבית.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה חסונה ליצירת רקמת לב מהונדסת.
- ניתוח השפעותיהם של תרופות על התכווצות הלב.
- אספקת פלטפורמה למחקר של וריאנטים גנטיים והשפעתם על תפקוד הלב.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- יצירה של רקמת לב מהונדסת מתאי קרדיומיוציטים המופקים מ-hiPSC.
- מדידת כוח התכווצות תחת תנאים סטריליים.
- הערכת דפוסי התכווצות בתגובה לסוכנים פרמקולוגיים.
- אופטימיזציה של תנאי התרבית לשמירה על איכות תאית.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של רקמת לב מהונדסת תפקודית.
- הדגמה של שינוי בדפוסי ההתכווצות באמצעות E-4031.
- חוסנו של הפרוטוקול תומך בשימושו לסריקת תרופות.
- פוטנציאל למחקרים ארוכי טווח על תפקוד הלב.
מסקנות
- השיטה מספקת כלי בעל ערך למחקר לבבי.
- היא מאפשרת לבחון השפעות של תרופות על רקמת לב in vitro.
- יישומים עתידיים כוללים מידול מחלות ופרמקולוגיה של בטיחות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח התכווצות אוטומטי של רקמת לב אנושית מהונדסת מספק פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה לסריקה מוקדמת של בטיחות תרופות קרדיאליות, ומאפשר הערכה כמותית של כוח התכווצות ושל סיכון לאריתמיה המושרה על ידי תרופות. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית על ידי שכפול תגובות לבביות אנושיות לסוכנים פרמקולוגיים כגון מעכבי hERG, ובכך משפרת את הביטחון בתיקוף המטרה. השיטה מגבירה את הערך הניבויי בזיהוי מועמדים לתרופות (lead identification) על ידי גישור בין מודלים המופקים מתאי גזע לבין תוצאות פונקציונליות הרלוונטיות לתוצאות בטיחות קליניות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מודלים של רקמת לב אנושית המייצרת כוח, המשקפים פיזיולוגיה התכווצית הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי זיהוי השפעות של תרופות על קינטיקת התכווצות וזמני הרפיה במערכת ממקור אנושי.
- ערך ניבוי: מייצר נתונים כמותיים על הארכת T2 ואי-סדירות בפעימות על מנת לתעדף יעדים עם פרופילי בטיחות לבבית משופרים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר רקמות תלת-ממדיות סטריליות וסטנדרטיות בפורמט של 24 בארות, התואמות לתהליכי עבודה של דימות אוטומטי וניתוח התכווצות.
- פלט כמותי: מודד כוח המבוסס על קיצור באמצעות סטייה של עמוד PDMS, מה שמאפשר הערכת תגובה למינון של תרכובות כגון E-4031.
- יכולת הרחבה: מאפשר ייצור של כמה מאות רקמות לב מהונדסות בשבוע, בהגבלה רק של זמינות הקרדיומיוציטים, ובכך תומך בסריקה בתפוקה בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש בתאי שריר לב (cardiomyocytes) אנושיים למידול דינמיקת התכווצות, לשיפור ההלימה התרגומית (translational alignment) עם תפקוד הלב האנושי.
- המשכיות מכניסטית: לכידה של התכווצויות אוקסוטוניות (auxotonic) ופרמטרי הרפיה המשקפים צימוד אלקטרו-מכני, התומכים בהערכת סיכונים טרום-קלינית.
- תמיכה בקבלת החלטות: מאפשר שחזור של שינויים בכיווץ המושרים על ידי תרופות, המסייע בקבלת החלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) באופטימיזציה של מולקולות מובילות (lead optimization).
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד להערכת בטיחות פרה-קלינית, ומספקת תיקוף פונקציונלי של מטרות מולקולריות בהקשר של רקמה אנושית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערות על וריאנטים של גנים והשפעות של תרופות על ידי מדידה של כוח התכווצות בזמן אמת ברקמת לב אנושית מהונדסת.
- סריקה: מספקת קריאות התכווצות אוטומטיות וניתנות לשחזור, התומכות בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובסריקת תרכובות תחת תנאים מבוקרים.
- אנליטיקה: מייצרת פרמטרים מדידים הכוללים אמפליטודת התכווצות, תדירות פעימות וזמן הרפיה T2 לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: משתמשת ברקמות ממקור אנושי כדי לגשר בין ממצאים במערכות in vitro לבין ציפיות בטיחות קליניות, ובמיוחד עבור סיכונים הקשורים לתעלות יונים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-פעמית לסריקת בטיחות לבבית שניתן להחיל על פרויקטים רבים ומסוגי מטרות שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית בתגובה לתרופות לבביות.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה באמצעות זיהוי דמויות אוטומטי ותנאים סביבתיים מבוקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי זיהוי מוקדם של תרכובות קרדיוטוקסיות, ובכך מפחית את הסיכון לנשירה בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אותי בטיחות כמותיים המופקים ממודלים של רקמת לב אנושית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהנדסת רקמות לב, תרביות תאים סטריליות וטיפול בתאי שריר לב (cardiomyocytes).
- תלוי בחומרת דימיון עם בקרת צירי XYZ ובתוכנה אוטומטית לזיהוי דמויות לצורך גילוי התכווצויות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולים ליצירת רקמות, חשיפה לתרופות וניתוח לצורך קבלת תוצאות הדירות.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למקורי תאים שונים או למודלים גנטיים, תוך שמירה על שלמות הרקמה ותפקודיותה.
- מוגבל על ידי זמינותם של תאי שריר לב ומצב הבשלות שלהם, המשפיעים על ביצועי התכווצות ועל עקביות הבדיקה.
