Name: טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: למדו שיטה לטיהור DNA גנומי במשקל מולקולרי גבוה מטחב אבקתי לסיקוגנום ארוך. הטכניקה מאפשרת חקר גנומים פטרייתיים מורכבים ומנגנוני מחלות צמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרוטוקול זה פותח לתמיכה בפרויקט ריצוף משותף של מכון הגנום והקהילה (#1657). העבודה נתמכה בחלקה על ידי קרן פילומטיה, הקרן הלאומית למדע (#0929226) והמכון למדעי האנרגיה ל-S. Somerville; ועל ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע (#310030_163260) לב. ברצוננו להודות לעמיתינו, M. Figureroa ו- M. Miller (אוניברסיטת מינסוטה), R. Panstruga (אוניברסיטת RWTH אאכן), C. Pedersen (אוניברסיטת קופנהגן), P. Spanu (אימפריאל קולג'), J. Taneja (אוניברסיטת קליפורניה ברקלי), M. Wildermuth (אוניברסיטת קליפורניה ברקלי), R. Wise (אוניברסיטת מדינת איווה) ו- S. Xiao (אוניברסיטת מרילנד) על עצותיהם הנדיבות ועל התנדבות הפרוטוקולים שלהם בזמן שפיתחנו את הפרוטוקול המתואר כאן.

1. הכנת חומר פטרייתיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידול אבק טחב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל צמחים בתאי גידול עם התנאים הבאים: 22 ° C יום הטמפרטורה, 20 ° C טמפרטורה בלילה, 80% לחות יחסית, 14-h-אורך היום לבין עוצמת אור של 125 μE / m 2 / s (המסופק על ידי תאורת פלורסנט ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק צמחים מלפפון (מגוון סטיבה Cucumis בוש אלוף) עם UCSC1 זן cichoracearum Golovinomyces כמתואר 18, 29. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר אבק טחב נבגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר נבגים מצמחים נגועים ב 7 - 10 ימים לאחר חיסון באמצעות ואקום קטן עם מסנן ב-קו (11 מיקרומטר) שעליו נבגים לצבור. הפעלת לחץ עדין, להפעיל את זרבובית הוואקום לאורך פני השטח של העלים כדי לאסוף את הנבגים. הערה: התשואה הממוצעת של G. cichoracearum הוא 20 מ&quot;ג של נבגים מתוך בכבדות infeעלה מלפפון cted של כ 130 ס&quot;מ 2 בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מברישים על 150 מ&quot;ג של נבגים (כ 375 נפח μL, או נבגים 7-8 עלים מלפפון נגועים) מהמסנן גבי גיליון נייר נקי. מכאן, להעביר נבגים לתוך 2 מ&quot;ל cryovials עם שני 5/32-inch בקוטר טרום צונן (בחנקן נוזלי) כדורי טחינה פלדה. מיד לחזור צינורות חנקן נוזלי. צינורות חנות ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כשפתח נבגים ידי כדור כרסום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלאש להקפיא צלחות אלומיניום של טחנת כדור בחנקן נוזלי. טען cryovials לתוך מתלה כדור-הטחנה. נמרצות לנער את cryovials עם כדורי נבגים ופלדה בטחנת הכדור עבור 30 שניות על 30 מחזורים / s (בטמפרטורת החדר). מיד refreeze cryovials בחנקן נוזלי. הערה: בתחילה, לגשת מדגם של נבגים על ידי מיקרוסקופ בהגדלה 100X ליעילות של קרע בדופן התא במהלך שחיקה. במידת הצורך, לטחון עבור תוספת 1 - 2 סבבים של 30 s עבור 30 מחזורים / s, בUT לשמור על מספר סיבובים עד למינימום. הערכה שגרתית של שבירה הנבגים ידי מיקרוסקופ בשלב זה היא מיותרת פעם הוקמו תנאים אופטימליים. </li></ol></li></ol> 2. טיהור DNA הגנומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמוגה נבגים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות כדי למנוע הפשרת נבגים, להסיר את כדורי פלדה מ cryovials עם מגנט. הוספת 700 μL 65 ° חיץ תמס C (לוח 1) ו מערבולת 5 - 10 s עד תרחיף נוצר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μL מראש התחמם (C 65 °) 5% (v / v) sarcosyl ו להפוך בעדינות לתערובת (1 היפוך לכל 3 ימים) חמש פעמים. דגירת צינורות עבור 30 דקות ב 65 מעלות צלזיוס; להפוך פעמים 3 בעדינות על 10, 20 ו 30 דק &#39;. בעזרת קצה פיפטה רחב נשא, להעביר פתרון שלם צינור 2 מ&quot;ל microcentrifuge חדש. בכל השלבים הבאים, ומערבבים על ידי היפוך עדין, איטי ולהעביר את פתרונות המכילים DNA עם טיפים פיפטה רחב נשא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת DNA לי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 נפח של כלורוטופס: אלכוהול isoamyl (24: 1 v / v) לפתרון תמוגה להפוך בעדינות לתערובת חמש פעמים. דגירה של 10 דקות בטמפרטורת החדר, היפוך בעדינות לתערובת חמש פעמים בנקודת אמצע הדרך ואז שוב בסוף הדגירה. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ב 14,000 x ז. באמצעות קצה פיפטה רחב נשא, להעביר את השכבה המימית בזהירות 2 צינור microcentrifuge חדש מ&quot;ל; להימנע כולל חומר מהממשק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA משקעים לי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 1 נפח בטמפרטורת החדר 100% isopropanol (כ 750 μL) ו להפוך בעדינות לתערובת שש פעמים. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות ב 14,000 x ז. מוציאים בזהירות את supernatant וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 450 μL מראש מצונן (-20 ° C) אתנול 70%. צנטריפוגה 5 דקות בטמפרטורת החדר בבית g 14,000 x. מוציאים בזהירות את supernatant וזורקים. צנטריפוגה ב 1000 XG במשך 3 ים, להסיר את supernatant בזהירות עם קצה פיפטה בסדר וזורקים. אוויר יבש גלולה במשך 15 דק &#39;טמפרטורת T בחדר. אין לייבש יותר מ 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה 300 μL TE (10 מ&quot;מ טריס-Cl, 1 מ&quot;מ חומצה אצטית טטרה diamine אתילן, pH 8.0). דגירה לילה בשעה 4 ° C. בעדינות קפיצי להשעות כל חומר שיורית שלא להיכנס פתרון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר זיהום RNA, להוסיף 10 μL RNase A (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל). בעדינות להפוך לערבב שלוש פעמים. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 3 s. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפקת DNA II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 300 μL פנול: כלורופורם: אלכוהול isoamyl (25: 24: 1 v / v) ו להפוך בעדינות לתערובת חמש פעמים. דגירה 10 דקות בטמפרטורת החדר, היפוך בעדינות לתערובת חמש פעמים על מחציתו ושוב בסוף הדגירה. צנטריפוגה 15 דקות בטמפרטורת החדר ב 14,000 x ז. בעזרת קצה פיפטה רחב נשא, להעביר את supernatant צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge חדש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA משקעים II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5.2 pH אצטט 0.01 נפח 3 M נתרן (approximately 3 μL), להפוך בעדינות לתערובת חמש פעמים. הוספת 2.5 כרכים טרום צונן (-20 ° C) 100 אתנול% (כ 750 μL). בעדינות להפוך לערבב חמש פעמים. דגירת הלילה בשעה -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 30 דקות ב 4 ° C ב 14,000 x ז. מוציאים בזהירות את supernatant וזורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 450 μL מראש מצונן (-20 ° C) אתנול 70%. צנטריפוגה 5 דקות ב 4 ° C ב 14,000 x ז. מוציאים בזהירות את supernatant וזורקים. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 3 s. מוציאים בזהירות את supernatant עם טיפ מחק פיפטה בסדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוויר יבש גלולה במשך 30-60 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend גלולה 27.5 μL TE. דגירה לילה בשעה 4 ° C. בעדינות קפיצי להשעות כל חומר שיורית שלא להיכנס פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 2.5 μL לתוך 22.5 μL TE (25 נפח סופי μL) עבור בדיקות בקרת איכות (ראו להלן). חנות ה- DNA דגימות ב 4 מעלות צלזיוס עד הגשת רצף. עבור אחסון לטווח ארוך, דגימות חנותב -80 ° C ו למזער להקפיא להפשיר מחזורים כדי למנוע מריחה. הערה: נזהרת בעת pipetting בשלב הזה כמו ה- DNA הגנומי המשקל המולקולרי הגבוה יכול להיות קשה פיפטה כראוי, וזה חשוב כדי להבטיח כי &quot;QC Aliquot&quot; הוא ייצוג מדויק של דגימת DNA הגנומי. </li></ol></li></ol> 3. בקרת איכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טוהר מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת ריק TE, להעריך את טוהר מדגם של DNA על ידי טעינת 1 μL של QC Aliquot על ספקטרופוטומטר קטן-נפח. קריאות שיא A260 / A280 ו- A260 / A230. דנ&quot;א טהור יהיה יחס A260 / A280 של יחס כ 1.8 ו A260 / A230 בין 1.8 לבין 2.2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כימות של הדנ&quot;א הגנומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כימות של aliquot QC באמצעות ערכת assay כימות מסחרי פעמיים תקועים DNA על פי הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להערכת איכות DNA לי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ טען 60 הדנ&quot;א הגנומי ng וסולם DNA על ג&#39;ל agarose 0.7% ב 1x טה (40 מ&quot;מ טריס, 20 mM חומצה אצטית, ו 1 mM EDTA, pH 8.0). מנגנון ג&#39;ל לרוץ לעבר 70 V עבור 40 - 45 דקות עד להקות הדנ&quot;א הגנומי כ 2 סנטימטר מן ההפרדה היטב להקת הסולם ניכר. תנאים אלה עשויים צריכים להיות מותאמים המבוססים על מנגנון ג&#39;ל אלקטרופורזה זמין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DNA איכות הערכת II <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען כ 60 ng DNA גנומי סולם DNA משקל מולקולרי גבוה (מתאים ג&#39;ל אלקטרופורזה פעמו שדה) על ג&#39;ל agarose 1% ב TBE 0.5x (44.5 מ&quot;מ טריס, 44.5 מ&quot;מ חומצה בורית, 1 מ&quot;מ EDTA, pH 8.3) ו לרוץ למאגר פועל TBE 0.5x באמצעות 5 - פרוטוקול ג&#39;ל אלקטרופורזה פעם שדה צורת גל KBP 80 עבור 16 h. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת חיידקים, פטריות, צמחים ומזהמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את המפרידים עבדו הפנימיים המתאימים האזורים (ITS) של גני ריבוזומלי באמצעות פריימרים ותנאי הגברת רשימהed בטבלה 2. טען 10 μL של התגובה הנובעת מהם על ג&#39;ל. הערה: להקה המייצגת את הטחב אבק באזור שלה צריך להיות מוגבר עם פריימרים ITS פטרייתיים. דנ&quot;א amplicon זה וכל amplicon שנוצר עם פריימרים החיידקים, או הצמח צריך להיות רצף כדי לקבוע את מקור הזיהום. טחב אבק רק רצפי ITS צריך להימצא amplicon פטרייתיים. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Agrios, G. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+GN+%22Plant+Pathology%22">Plant Pathology</a>. , 4th, Academic Press. (1969).</li>
<li>Braun, U., Cook, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBraun%2C+U+%22Taxonomic+manual+of+the+Erysiphales+%28Powdery+Mildews%29%22">Taxonomic manual of the Erysiphales (Powdery Mildews)</a>. , CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre Utrecht. The Netherlands. (2012).</li>
<li>Both, M., Csukai, M., Stumpf, M. P. H., Spanu, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+of+Blumeria+graminis+indicate+dynamic+changes+to+primary+metabolism+during+development+of+an+obligate+biotrophic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles of Blumeria graminis indicate dynamic changes to primary metabolism during development of an obligate biotrophic pathogen.</a> Plant Cell. 17 (7), 2107-2122 (2005).</li>
<li>Glawe, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+powdery+mildews%3A+A+review+of+the+world%27s+most+familiar+%28yet+poorly+known%29+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">The powdery mildews: A review of the world's most familiar (yet poorly known) plant pathogens.</a> Annu Rev Phytopathol. 46, 27-51 (2008).</li>
<li>Fabro, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+expression+profiling+Arabidopsis+at+the+stage+of+Golovinomyces+cichoracearum+haustorium+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide expression profiling Arabidopsis at the stage of Golovinomyces cichoracearum haustorium formation.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1421-1439 (2008).</li>
<li>Hückelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell biology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Curr Opin Plant Biol. 14 (6), 738-746 (2011).</li>
<li>Micali, C. O., Neumann, U., Grunewald, D., Panstruga, R., O'Connell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biogenesis+of+a+specialized+plant-fungal+interface+during+host+cell+internalization+of+Golovinomyces+orontii+haustoria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biogenesis of a specialized plant-fungal interface during host cell internalization of Golovinomyces orontii haustoria.</a> Cell Microbiol. 13 (2), 210-226 (2011).</li>
<li>Chandran, D., Inada, N., Hather, G., Kleindt, C. K., Wildermuth, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microdissection+of+Arabidopsis+cells+at+the+powdery+mildew+infection+site+reveals+site-specific+processes+and+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Laser microdissection of Arabidopsis cells at the powdery mildew infection site reveals site-specific processes and regulators.</a> Proc Natl Acad Sci. 107 (1), 460-465 (2010).</li>
<li>Spanu, P. D., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Powdery+mildew+genomes+in+the+crosshairs%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Powdery mildew genomes in the crosshairs.</a> New Phytol. 195 (1), 20-22 (2012).</li>
<li>Vela-Corcía, D., Romero, D., Torés, J. A., De Vicente, A., Pérez-García, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+transformation+of+Podosphaera+xanthii+by+electroporation+of+conidia%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transient transformation of Podosphaera xanthii by electroporation of conidia.</a> BMC Microbiol. 15 (20), (2015).</li>
<li>Hacquard, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHacquard%2C+S+%22Advances+in+Botanical+Research%22">Advances in Botanical Research</a>. Francis, M. M. 70, Academic Press. 109-142 (2014).</li>
<li>Spanu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+expansion+and+gene+loss+in+powdery+mildew+fungi+reveal+tradeoffs+in+extreme+parasitism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome expansion and gene loss in powdery mildew fungi reveal tradeoffs in extreme parasitism.</a> Science. 330 (6010), 1543-1546 (2010).</li>
<li>Wicker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+wheat+powdery+mildew+genome+shows+the+unique+evolution+of+an+obligate+biotroph%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The wheat powdery mildew genome shows the unique evolution of an obligate biotroph.</a> Nat Genet. 45 (9), 1092(2013).</li>
<li>Jones, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+genomic+structural+variation+in+the+grape+powdery+mildew+pathogen%2C+Erysiphe+necator%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Adaptive genomic structural variation in the grape powdery mildew pathogen, Erysiphe necator.</a> BMC Genomics. 15, 1081(2014).</li>
<li>Thomma, B. P. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3B+seven+reasons+to+close+fragmented+genome+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet+Biol%22%5BJournal%5D)">Mind the gap; seven reasons to close fragmented genome assemblies.</a> Fungal Genet Biol. 90, 24-30 (2016).</li>
<li>Parlange, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+major+invasion+of+transposable+elements+accounts+for+the+large+size+of+the+Blumeria+graminis+f.sp.+tritici+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Integr+Genomics%22%5BJournal%5D)">A major invasion of transposable elements accounts for the large size of the Blumeria graminis f.sp. tritici genome.</a> Funct Integr Genomics. 11, 671-677 (2011).</li>
<li>Faino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+real-time+sequencing+combined+with+optical+mapping+yields+completely+finished+fungal+genome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Single-molecule real-time sequencing combined with optical mapping yields completely finished fungal genome.</a> mBio. 6, (2015).</li>
<li>Adam, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Erysiphe+cichoracearum+and+E.+cruciferarum+and+a+survey+of+360+Arabidopsis+thaliana+accessions+for+resistance+to+these+two+powdery+mildew+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Microbe+In%22%5BJournal%5D)">Comparison of Erysiphe cichoracearum and E. cruciferarum and a survey of 360 Arabidopsis thaliana accessions for resistance to these two powdery mildew pathogens.</a> Mol Plant Microbe In. 12 (12), 1031-1043 (1999).</li>
<li>Bourras, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+avirulence+loci+and+allele-specific+effector+recognition+control+the+PM3+race-specific+resistance+of+wheat+to+powdery+mildew%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple avirulence loci and allele-specific effector recognition control the PM3 race-specific resistance of wheat to powdery mildew.</a> Plant Cell. 27 (10), 2991-3012 (2015).</li>
<li>Joint Genome Institute DNA sample submission guidelines. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/DNA-Preparation-Requirements-1.pdf</a> (2016).</li>
<li>Chovatia, M., Sharma, A. Genomic DNA sample QC version 4.0. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2013/11/Genomic-DNA-Sample-QC.pdf</a> (2014).</li>
<li>Daum, C. iTag sample amplification QC version 1.3. , 
 <a target="_blank" href="http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf">http://1ofdmq2n8tc36m6i46scovo2e.wpengine.netdna-cdn.com/wp-content/uploads/2016/04/iTag-Sample-Amplification-QC-v1.3.pdf</a> (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Plant+genotyping+II%3A+SNP+technology%22">Plant genotyping II: SNP technology</a>. Henry, R. J. , CABI. Oxfordshire, UK. (2008).</li>
<li>Healey, A., Furtado, A., Cooper, T., Henry, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+a+simple+method+for+extracting+next-generation+sequencing+quality+genomic+DNA+from+recalcitrant+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: a simple method for extracting next-generation sequencing quality genomic DNA from recalcitrant plant species.</a> Plant Methods. 10 (21), (2014).</li>
<li>Fang, G., Hammar, S., Grumet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quick+and+inexpensive+method+for+removing+polysaccharides+from+plant+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA.</a> Biotechniques. 13 (1), 52-54 (1992).</li>
<li>Jordon-Thaden, I. E., Chanderbali, A. S., Gitzendanner, M. A., Soltis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+CTAB+and+TRIzol+protocols+improve+RNA+extraction+from+chemically+complex+Embryophyta%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Modified CTAB and TRIzol protocols improve RNA extraction from chemically complex Embryophyta.</a> Appl Plant Sci. 3 (5), 1400105(2015).</li>
<li>Murray, M. G., Thompson, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+high+molecular+weight+plant+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of high molecular weight plant DNA.</a> Nucleic Acids Res. 8 (19), 4321-4325 (1980).</li>
<li>Greco, M., Sáez, C. A., Brown, M. T., Bitonti, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+effective+method+for+high+quality+co-extraction+of+genomic+DNA+and+total+RNA+from+low+biomass+Ectocarpus+siliculosus%2C+the+model+brown+alga%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A simple and effective method for high quality co-extraction of genomic DNA and total RNA from low biomass Ectocarpus siliculosus, the model brown alga.</a> PLoS One. 9 (5), e96470(2014).</li>
<li>Wilson, I. W., Schiff, C. L., Hughes, D. E., Somerville, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+trait+loci+analysis+of+powdery+mildew+disease+resistance+in+the+Arabidopsis+thaliana+accession+Kashmir-1%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative trait loci analysis of powdery mildew disease resistance in the Arabidopsis thaliana accession Kashmir-1.</a> Genetics. 158 (3), 1301-1309 (2001).</li>
<li>User Manual: Pippin Pulse Electrophoresis Power Supply. , Sage Science. 
 <a target="_blank" href="http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf">http://www.sagescience.com/wp-content/uploads/2014/01/Pippin-Pulse-User-Manual-RevH.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

על מנת לקבל טהור, הדנ&quot;א הגנומי משקל מולקולרי גבוה מן פטריות וטחב אבקתי biotrophic לחייב, גרסה שונה של השיטות שתוארו קודם לכן פותחה 30. התשואה הממוצעת באמצעות פרוטוקול מותאם זה DNA 7 מיקרוגרם לכל 150 מ&quot;ג נבגים, הכפלה של התשואה המתקבלת עם פרוטוקול מוקדם. כמו כן, את הגודל הממוצע גדל מכ 20 KBP למעל 48.5 KBP. פרוטוקול זה מותאם במערכת cichoracearum ג cucumber-. על מנת לקבל את האיכות הטובה ביותר ואת DNA הטוהר הגבוה ביותר טחב אבקה אחר או לחייב פט...

<html> קימחון הם קבוצה של צמחים biotrophic פטרייתיים לחייב פתוגנים, כאשר נלקח יחד, הם הגורם הגדול ביותר של מחלות צמחים ברחבי העולם 1. ישנם מעל 900 מינים מתוארים של טחב אבקתי, אשר קובצו טקסונומית לחמש שבטים בתוך המשפחה Erisyphaceae 2. הן בשל חשיבותה הכלכלית שלהם ואת היחסים האינטימיים שהם מפתחים עם מארחיהם, מחלות טחב אבקתי כבר נושא למחקר עבור&gt; 100 שנים. לאחר ההדבקה, קימחון לעורר שינויים דרסטיים במבנה הסלולר, חילוף החומרים וביולוגיה מולקולרית של מארחיהם, ליהנות פתוגן זה. עם זאת, המחקר של קימחון הוא מאתגר במיוחד בשל אורח חי מחייבים שלהם, והצמיחה של הפטרייה בתרבות טהורה טרם תארה 3, 4, 5,&quot;Xref&quot;&gt; 6, 7, 8. שינוי גנטי אמין ויציב של קימחון יש גם עדיין לא הושג, למרות שינוי חולף דווח בכמה מינים 9, 10. והרצף וההרכבה של הגנום טחב אבקתי הוכיח קשים בשל מספר התכונות של הגנום עצמו. הגנום טחב אבקתי גדול (120 - 180 MBP) ביחס הגנום פטרייתיים אחר, וכולל 60 - 90% אלמנטים חוזרים מופצים באופן שווה 11. אלמנטים אלה כוללים חזרות הטרמינל הלא-ארוכות, כמו גם אלמנטים חוזרים ללא קטגוריה. שני speciales formae של מיני טחב אבקה יחידים, F graminis Blumeria. sp. hordei ו F. sp. tritici (BGH ו bgt, בהתאמה) וכן טחב אבקתי ענבים Erysiphe necator, יש דבוריםn רצף, ואת הגנום טיוטה עבור כמה אחרים הושלמו 12, 13, 14. האופי החוזר ונשנה של הגנום עשה הרכבה קשה, ואת הגנום BGH השלימה הורכב לתוך 6989 supercontigs עם L50 של 2 Mb 12. למרות בגנום גדול, קימחון נראה שיש מספר קטן של גנים המקודדים חלבונים, עם 5845 ו 6540 גנים החזוי BGH ו bgt, בהתאמה. קימחון הרצף גם נראה חסר לפחות גני ליבה 99 כי הם חיוניים פטריות אחרות, אשר עולה בקנה אחד עם התלות של הפטריות על הצמח הפונדקאי שלהם להישרדות 11, 12, 13, 14. רצפים חוזרים ליד telomers, צנטרומר, RN הריבוזומיתמערכי גנים ואזורים המועשרים ב מאלמנטים ניידים הם מאורגנים מן אסטרטגיות רצף קצרות לקריאה ולעתים קרובות הם תת ייצוג המכלולים הגנום 15. אזורים כאלה נחשבים אחראים רבים של הפערים המתרחשים רצפי גנום, וזה חל על הקימחון עם ההתרחבות שלהם הנרחבת של אלמנטים חוזרים 16. Highly אזורים בגנום פלסטיק נמצאים בדרך כלל באזורים חוזרים כגון 3. הם משמשים כאתר של שיחלופים כרומוזום ולעתים קרובות לקודד גנים תחת לחץ סלקטיבי חזק, כגון גנים המקודדים חלבונים מפעיל ואת הגנים המקודדים אנזימים של המטבוליזם המשני. התקדמות בטכנולוגיות סידור מולקולה בודדת לקריאה ארוכה מספקת פתרון אפשרי עבור סידור פני אזורים חוזרים של הגנום 15. לדוגמה, Faino ואח. (2015) מצאו כי ארוך רצף כולל לקרוא טכנולוגיות מטר אופטיapping מותר להם לייצר רצף הגנום פחות פער לשני זנים של דליית Verticillium הפתוגן צמח פטרייתיים, שולש שיעור רצפי DNA חוזרים בגנום, הגדלת מספר הסברי גן (וצמצום מספר סברי גן חלקי או חסר ) ו הגנום חושפני שיחלופים 17. כדי להעסיק טכנולוגיות רצף ארוכות לקרוא אלה, ריכוזים גבוהים של הדנ&quot;א הגנומי באיכות גבוהה, עם גדלים מינימאלי&gt; 20 KBP, נדרשים. כאן אנו מתארים את השיטות שלנו לאיסוף נבגים, טיהור של דנ&quot;א משקל מולקולרי גבוה מ נבגים והערכות בקרת איכות שלנו באמצעות מיני טחב אבקה Golovinomyces cichoracearum גדלו על מלפפון 18. פרוטוקול זה מבוסס על פרוטוקול שפותח בקבוצה מעבדה B. קלר (אוניברסיטת ציריך, ציריך שוויץ) 13, 19וכולל מספר שינויים שהובילו תשואות DNA מוגברות שיעור גבוה יותר של ה- DNA&gt; 48.5 KBP בגודלם. הפרוטוקול כולל גם צעדי בקרת איכות מבוססות על המלצות מארה&quot;ב מח&#39; הגנום משותף אנרגיה במכון 20, 21, 22. הפונקציה של כל מגיב הכלול במאגר תמוגה, ואת הרציונל לכל שלב טיהור, מתוארת כמו הנרי (2008) 23. פרוטוקולים שפורסמו זמין עבור בידוד של DNA גנומי משקל מולקולרי גבוה מרקמות הצמח מיקרוביאלי היו התייעץ גם בשלבי התכנון של פרוטוקול זה 24, 25, 26, 27, 28.

<table><tbody><tr><td>MM400 טחנת כדור</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>או שווה ערך טחנת כדור</td></tr><tr><td>2 צינורות מ"ל לכרסום כדור</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.694.007</td><td></td></tr><tr><td>5/32 אינץ' כדורי כרסום נירוסטה</td><td>OPS אבחון</td><td>GBSS 165-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מעבד נשלט 280 סדרת אמבט מים מוגדרת מראש ל-65 מעלות; C&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>או אמבט מים שווה ערך</td></tr><tr><td>מיקרו-מעבד נשלט 280 סדרת אמבט מים מוגדר מראש ל-37 מעלות; C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>או אמבט מים שווה ערך</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R מיקרוצנטריפוגה מקוררת</td><td>Krakeler Scientific&nbsp;</td><td>38-022621807</td><td>או מיקרו-צנטריפוגה מקבילה</td></tr><tr><td>כלורפורם: IAA (24:1 v/v)</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>C0549</td><td>מסוכן במקרה של מגע בעור או שאיפה. ללבוש כפפות ניטריל, משקפי מגן, מעיל מעבדה ולעבוד במכסה המנוע הכימי</td></tr><tr><td>פנול: כלורופורם: IAA (25: 24: 1 v/v)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593031</td><td>מסוכן במקרה של מגע בעור או שאיפה. ללבוש כפפות ניטריל, משקפי מגן, מעיל מעבדה ולעבוד במכסה מנוע כימי</td></tr><tr><td>100% איזופרופנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td></td><td></td>W292907</tr><tr><td>100% אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>34923</td><td>צינון עד -20 מעלות; C שימוש קודם</td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Rnase, ללא דנאז (10 מ"ג/מ"ל)Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן מטאביסולפיט</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>P2522</td><td></td></tr><tr><td>נתרן לאוריל סקרואינט</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td></td><td></td>10708976001</tr><tr><td>חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA)</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H6269</td><td></td></tr><tr><td>Uvex של Honeywell Futura משקפי מגן S345C, Uvextreme</td><td>Staples</td><td>423263</td><td>או משקפיים שווי ערך</td></tr><tr><td>High Five כפפות ניטריל COBALT, LARGE</td><td>Neta Scientific</td><td>HFG-N193</td><td>או כפפות שוות ערך</td></tr><tr><td>ג'ל חומצת גרעין אדומה כתם ג'ל 10,000x במים</td><td>ביוטיום</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד 10 מ"ג/מ"ל</td><td>ביוטיום</td><td>40042</td><td>מסוכן במקרה של מגע בעור. ללבוש כפפות ניטריל ומשקפי מגן</td></tr><tr><td>Agarose Ultrapure Bioreagent</td><td>VWR International LLC</td><td>JT4063</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1332</td><td></td></tr><tr><td>8 - 48 kb תקני גודל DNA של CHEF</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3707</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>4472172</td><td>או שווה ערך ג'ל שדה דופק aparatus</td></tr><tr><td>נייר סינון איכותי Whatman, כיתה 1</td><td>סיגמא-אולדריץ'&nbsp;</td><td>תא</td><td>צמיחה WHA1001042 או שווה ערך</td></tr><tr><td>תא צמיחה Percival</td><td></td><td>AR66LXC9</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 8000 UV-Vis ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>ND-8000-GL</td><td>או ספקטרופוטומטר שווה ערך</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA ערכת בדיקת</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>TAE מאגר (Tris-אצטט-EDTA) (50x)</td> <td>תרמו פישר Scientific</td><td>B49</td><td>יש לדלל 1/50 במים לפני השימוש (עד 1x)</td></tr> <tr><td>TE Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12090015&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borate-EDTA, תמיסה פי 10 (אלקטרופורזה)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP13334</td><td>לדלל 1/10 במים לפני השימוש (עד 1x)</td></tr> <tr><td>חנקן נוזלי חנקן</td><td></td><td></td><td>נוזלי (-196 &deg; ג) מהווה סכנת הקפאה. הוא גם יתרחב במהירות עם ההתחממות ואין לשמור אותו במיכל סגור היטב</td></tr></tbody></table>

טיהור של ה- dna הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

פטריות טחב אבקה הן קבוצה של פתוגנים צמח פטרייתיים חשובים מבחינה כלכלית. יחסית מעט מאוד ידוע על הביולוגיה והגנטיקה המולקולרית של פתוגנים אלה, בין השאר בשל חוסר משאבים גנטיים גנומי מפותח. יש אורגניזמים אלה הגנום גדול, החוזרות על עצמן, אשר הפכו הגנום רצף והרכבה להחריד קשה. כאן, אנו מתארים שיטות לאיסוף, מיצוי, טיהור בקרת איכות הערכת הדנ&quot;א הגנומי משקל מולקולרי גבוה ממיני טחב אבקה אחד, Golovinomyces cichoracearum. הפרוטוקול המתואר כולל הפרעה מכנית של נבגים ואחריו מיצוי DNA גנומי מותאם פנול / כלורופורם. תשואה אופיינית היתה DNA 7 מיקרוגרם לכל 150 נבגים מ&quot;ג. ה- DNA הגנומי כי הוא מבודד באמצעות הליך זה מתאים רצף ארוך לקרוא (כלומר,&gt; 48.5 KBP). אמצעי בקרת איכות על מנת להבטיח את הגודל, תשואה, וטוהר של הדנ&quot;א הגנומי הם גםהמתוארים בשיטה זו. רצף של הדנ&quot;א הגנומי של האיכות המתוארת כאן יאפשר ההרכבה וההשוואה של הגנום טחב אבקתי מרובה, אשר בתורו יוביל להבנה טובה יותר ושיפור שליטת הפתוגן חקלאי זה.

דוגמה מייצגת של 60ng הדנ&quot;א הגנומי מטוהרים מן G. cichoracearum להריץ על ג&#39;ל agarose באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה ושימוש ג&#39;ל אלקטרופורזה פעמו שדה מוצגים איורים 1 ו 2, בהתאמה. הכנות DNA הגנומי שעוברים, שולי לעבור להיכשל בקרת איכות מיוצגות. הכנות DNA הגנומי שעוברות בקרת איכות באופן מלא הם אידיאליים עבור סידור באמצעות גישות רצף הגנום ארוך לקרוא. הכנות כי שולי לעבור בקרת איכות כשרים,...

מתוארת כאן שיטה למיצוי, טיהור ובקרת איכות של DNA גנומי מהפתוגן הפטרייתי הביוטרופי המחייב, טחב אבקתי, לשימוש בריצוף גנום לקריאה ארוכה.

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לבודד DNA גנומי בעל משקל מולקולרי גבוה מקונידיות הפלואיד של פטריית ה mildew האבקתית עבור ריצוף גנומי בקריאות ארוכות. שיטה זו יכולה להשיב על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של פטריות פתוגניות לצמחים, כגון המבנה וההרכב של גנומים שקשה לחקור. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מיצוי של DNA גנומי באיכות גבוהה מפתוגן שקשה לעבוד איתו.כדי להתחיל את הניסוי, הוציאו במהירות את כדורי הפלדה מהמבחנות הקפואות (cryovials) של הקונידיות באמצעות מגנט. הוסיפו 700 µL של תמיסת ליזיס בטמפרטורה של 65 °C וערבלו את התמיסה במכשיר וורטקס למשך חמש עד 10 שניות. לאחר חמש עד 10 שניות, תיווצר תרחופה.הוסיפו 300 µL של sarkosyl בריכוז 5% volume by volume שחומם מראש ל-65 מעלות, והפכו את המבחנה בעדינות חמש פעמים. דגרו את המבחנות למשך 30 דקות בטמפרטורה של 65 °C. באמצעות טיפ פ pipette בעל פתח רחב (wide bore), העבירו את כל התמיסה למבחנת מיקרוצנטריפוגה חדשה בנפח של 2 mL.הוסיפו נפח אחד של כלורופורם איזואמיל אלכוהול לתמיסת הליזיס, והפכו בעדינות את המבחנה חמש פעמים כדי לערבב. דגרו את התערובת למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הפכו בעדינות את המבחנה חמש פעמים לערבוב במחצית הזמן, ושוב בסיום הדגירה.בשלב הבא, סבבו בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. באמצעות טיפ פפיטה בעל פתח רחב, העבירו בזהירות את השכבה המימית למסורת מיקרוצנטריפוגה חדשה של שני מיליליטר, והימנעו מהכללת חומרים מהממשק. הוסיפו נפח של 750 µL של 100% isopropanol בטמפרטורת החדר והפכו את המסורת בעדינות שש פעמים.לאחר מכן, סובב את התערובת בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. הסר בזהירות את עליון הנוזל (supernatant) והשלך אותו. הוסף 450 µL של 70% ethanol שקויררו מראש.סבבו את התערובת בצנטריפוגה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסירו בזהירות את supernatant והשליכו אותו. סבבו בצנטריפוגה ב-1000 times g למשך שלוש שניות.הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) באמצעות טיפ פיפט עדין והשלח אותו. ייבש את המשקע באוויר למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השהה מחדש את המשקע ב-300 µL של TE. דגרי את ה-DNA למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.למחרת בבוקר, נקש עם האצבע בעדינות כדי להמיס מחדש כל DNA שטרם נמס בתמיסה. כדי להסיר זיהומים של RNA, הוסיפו 10 µL RNase. הפכו את המבחנה בעדינות שלוש פעמים וסובבו את ה-DNA בצנטריפוגה ב-1000 ×g למשך שלוש שניות.לאחר מכן, דגרו את ה-DNA בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. הוסיפו 300 µL של phenol chloroform isoamyl alcohol והפכו בעדינות את המבחנה חמש פעמים כדי לערבב, ודגרו את ה-DNA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הפכו בעדינות את המבחנה כדי לערבב את ה-DNA חמש פעמים במחצית מזמן הדגירה ושוב בסיומו.בשלב הבא, סבב את המבחנה בצנטריפוגה למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. העבר את הסופרנאטנט למבחנה חדשה של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל באמצעות טיפ פיפטה רחב (wide bore). הוסף שלושה מיקרוליטרים של Sodium acetate בריכוז 3 מולרי pH 5.2, ולאחר מכן הפוך את המבחנה בעדינות חמש פעמים.הוסף 750 µL של 100% ethanol שקויררו מראש והפוך את המבחנה בעדינות חמש פעמים. דגור את התערובת למשך לילה בטמפרטורה של 20 °C. למחרת בבוקר, סבב את המבחנה בצנטריפוגה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C.הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והשלך אותו. הוסף 450 µL של 70% ethanol שקויררו מראש. לאחר מכן, צנטריפוג את המבחנה למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C.לאחר שקיעת ה-DNA, הסר בזהירות את הנוזל העליון (supernatant). סובב את המבנה שוב ב-1000 ×g למשך שלוש שניות כדי להשקיע שאריות של הנוזל העליון. הסר את שאריות הנוזל העליון באמצעות פיפטה בעלת קצה דק.ייבשו את המשקע באוויר למשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הייבוש באוויר, השעיקו שוב את המשקע ב-27.5 µL של TE. למחרת, הפכו את המבחנה בעדינות כדי להשעיק שאריות חומר שלא נמסו בתמיסה. העבירו מנה (aliquot) של 2.5 µL לתוך 22.5 µL של TE עבור בדיקות בקרת איכות.יש לאחסן את דגימות ה-DNA בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד להגשתן לריצוף. לאחסון לטווח ארוך, יש לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס ולמזער את מחזורי ההקפאה וההפשרה כדי למנוע שבירה של המולקולות. בהתאם לפרוטוקול, נעשה שימוש ב-DNA גנומי מטוהר להרצת אלקטרופורזה על ג'ל, אשר הניבה DNA שעבר בקרת איכות עם פס בודד וחזק מעל 20kbp ומריחה מינימלית, DNA שנתן תוצאה גבולית עם פס בודד מעל 20kbp, ותוצאה שנכשלה המציגה מריחה מתחת ל-20kbp וכוללת פרגמנטים ב-100bp.אלקטרופורזה במטריצת שדה פועם, או PFGE, בוצעה כדי להבחין בין דגימת DNA מקובלה שבה רוב ה-DNA גדול מ-48.5kbp לבין דגימת DNA גבולית שבה רוב ה-DNA הוא בין 20 ל-48.5kbp. לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ריצוף קריאות ארוכות של מולקולה בודדת (single molecule long-read sequencing) כדי לענות על שאלות נוספות לגבי הגנום של ה mildew הפודרתי.

purification-high-molecular-weight-genomic-dna-from-powdery-mildew

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

מתודולוגיה לבודד משקל מולקולרי גבוה גבוה DNA הגנומי איכות מהקהילה חיידקים בקרקע מתואר.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

אנו מספקים פרוטוקול משופר לחילוץ משקל מולקולרי גבוה DNA של חיידקים מחצלות hypersaline. תאים מיקרוביאלית מופרדים המטריצה ​​מחצלת לפני מיצוי DNA וטיהור. זה משפר את הריכוז, איכות, גודל של ה-DNA. הפרוטוקול ניתן להשתמש בדגימות עקשן אחרים.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

מאמר זה מציג שיטה רגישה הנקראת Circle-Seq לטיהור DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי (eccDNA). השיטה כוללת טיהור עמודות, הסרת ה-DNA הכרומוזומלי הליניארי שנותר, הגברת מעגל מתגלגל ורצף תפוקה גבוהה. Circle-Seq ישים לסינון בקנה מידה גנומי של eccDNA איקריוטי ולחקר חוסר יציבות הגנום ושונות במספר העתק.

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

ההשוואה ואופטימיזציה של שתי שיטות העשרה DNA DNA organellar צמח מוצגים: צנטריפוגה ההפרש הדיפרנציאלי ואת החלוקה של gDNA הכולל מבוסס על מצב מתילציה. אנו מעריכים את כמות הדנ"א וכתוצאה מכך, מדגימים ביצועים ברצף של הדור הבא, וקוראים את הפוטנציאל לשימוש ברצף המולקולה החד-פעמית.

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Nanopore טכנולוגיה עבור רצפי מולקולות יש אפליקציות רחב במדעי החיים, כולל זיהוי של פתוגנים, ניטור בטיחות מזון, אנליזה גנומית, ניטור סביבתי metagenomic אפיון בקטריאלי עמידות לאנטיביוטיקה. במאמר זה, הוכח נוהל metagenomic אדמה רצפי DNA לצורך זיהוי מינים בטכנולוגיה רצף nanopore.

Nanopore רצפי DNA לניתוח Metagenomic אדמה

תא בודד רצף חושף הטרוגניות genotypic במערכות ביולוגיות, אך טכנולוגיות הנוכחי חוסר התפוקה הכרחי עבור פרופיל עמוק של הקהילה הרכב ותפקוד. כאן, אנו מתארים זרימת עבודה microfluidic עבור רצף &gt; הגנום בתא יחיד 50,000 מ מגוונות תא אוכלוסיות.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

המטרה של פרוטוקול זה היא להשתמש שילוב של חישובית ומחקר ספסל למצוא רצפי חדשניים אשר לא ניתן להפריד בקלות בין רצף טיהור משותף, אשר עשוי להיות מוכר באופן חלקי בלבד.

גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים

רצפי זמן-קריאה מאוד להקל על ההרכבה של הגנום מורכבים ואפיון של וריאציה מבנית. אנו מתארים שיטה כדי ליצור רצפים ארוכים במיוחד על ידי רצף nanopore מבוססי פלטפורמות. הגישה מאמצת הוצאה DNA ממוטבת ואחריו ההכנות ספריית ששונה כדי להפיק מאות קריאות kilobase עם כיסוי מתון של תאים אנושיים.

רצף קריאה ארוכים במיוחד עבור ניתוח הדנ א הגנומי לגמרי

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את ההתפלגות הגנום של שינויים histone, אשר יכול לזהות גנים יעד חדשים בפתוגנזה של M. oryzae ופטריות חוטיות אחרות.

ניתוח כלל-גנומי של הפצת שינויים בהיסטון באמצעות שיטת רצף האימונו-הוצאה כרומטין במגנפורטה אוריזה

כאן, אנו מציגים טכניקה פשוטה להערכת עמידות אנטי-מיקרוביאלית סביבתית (AMR) על-ידי שיפור שיעור הדנ"א החוץ תאי בעל משקל מולקולרי נמוך. טיפול קודם עם 20%-30% PEG ו-1.2 M NaCl מאפשר זיהוי של גנים AMR גנומיים ואופקיים. הפרוטוקול משאיל את עצמו לתהליך ללא ערכה עם אופטימיזציה נוספת.

מיצוי משופר של DNA במשקל מולקולרי נמוך משפכים להערכה מקיפה של עמידות מיקרוביאלית 

למדו שיטה לטיהור DNA גנומי במשקל מולקולרי גבוה מטחב אבקתי לסיקוגנום ארוך. הטכניקה מאפשרת חקר גנומים פטרייתיים מורכבים ומנגנוני מחלות צמחים.

טיהור של ה- DNA הגנומי משקל מולקולרי גבוה מ אבקתי טחב על רצף ארוך לקריאה

גלה סרטונים נוספים