Precision-לחתוך פרוסות ריאת עכבר לדמיין תאי דנדריטים ריאה חיים
5 באפריל 2017
אנו מתארים שיטה לייצור פרוסות ריאה-לחתוך Precision (PCLS) ו immunostaining להם לדמיין את הלוקליזציה של סוגי תאים שונים חיסוניים הבריא. פרוטוקול שלנו ניתן להאריך לדמיין את המיקום והתפקוד של סוגי תאים שונים תחת מגוון של תנאים.
המטרה הכללית של שיטה זו היא להשתמש בפרוסות ריאה חתוכות בדיוק, או PCLS, כדי להמחיש את המיקום והתנועה של סוגים שונים של תאי מערכת החיסון בריאה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה, כגון דפוסי המיקום והנדידה של תאי מערכת החיסון בריאה. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להמחיש מספר אינטראקציות ברקמה חיה ex vivo, השומרת על הארכיטקטורה התלת-ממדית של הריאה.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הלוקליזציה והתנועה של תאי מערכת החיסון במהלך דלקת, ניתן להשתמש בה גם כדי להדמות את התכווצות רקמת דרכי הנשימה והשריר החלק. כדי לקצור את רקמת הריאה, השתמש תחילה במספריים כדי לפתוח את העור והפריטונאום מאמצע הבטן ועד ללסת של עכבר בן שבועיים עד 12 שבועות, והסט את המעיים לצד חלל הבטן. גזור את הווריד הראשי התחתון (inferior vena cava) כדי לנקז את הדם מהריאות, והשתמש בקצה החד של המספריים כדי לנקב את הסרעפת כדי לאפשר את התרחבות כלוב הצלעות.
בשלב הבא, השתמשו בפינצטה כדי להרחיק ידנית את בלוטות הרוק ורקמות אחרות מהקנה, והשתמשו בפינצטה עדינה כדי לבצע חתך בקנה בצד הקדמי של רצוע הסחוס העבה ביותר, בגודל מספיק כדי לאפשר חדירה של מחט בכיליב 20. כעת, החליקו מחט בגודל 1.5 inch ובכיליב 20 על מקטע של צינור פוליאתילן, וחתכו את הצינור בזווית של כ-45 מעלות. חברו את המחט למזרק של one milliliter, ושאבו למזרק 0.8 milliliters של 2% low melting point agarose בטמפרטורה של 40 °C.
לאחר שכל האגרוז הוטען, הכניסו את הקצה האלכסוני של המהלך אל החתך, והזריקו לאט את האגרוז אל הריאות. מבלי להזיז את המחט או את המזרק, הדביקו את המזרק לבסיס הפוליסטירן כדי לקבע את המחט בתוך הקנה, והניחו את בעל החיים באחסון בטמפרטורה של 4 degrees Celsius למשך 10 דקות לפחות. לאחר שהאגרוז התמצק, השתמשו במספריים כדי להוציא בזהירות את הריאות, והניחו אותן בצלחת של שלושה סנטימטרים המכילה PBS קר מאוד.
לאחר מכן, סובב את האונה לצורך חיתוך הרקמה, כך שהחלק הפנימי של הריאה המתחבר לקנה הנשימה פונה כלפי מטה. כדי לחתוך את רקמת הריאה, הנח תחילה טיפה קטנה של דבק סופר All Purpose No Run gel על בוכנה של מזרק מתכת, והמרח את הדבק בתנועה מעגלית. כאשר כל הדבק נמרח, השתמש בפינצטה כדי לתפוס מיד אך בעדינות את האונה שהוצאה כאשר צד קנה הנשימה פונה מטה, וספוג את האונה בנייר סופג כדי להסיר את שאריות הנוזל.
הניחו בזהירות את האונה המיובשת על גבי הבוחנה, וגזרו כל רקמה מיותרת הבולטת מעבר לקצה הבוחנה. הזיזו את הבוחנה למטה כך שדפנות המזרק המתכתי יעלו ויכסו את הרקמה, ובכך תיצורו שקית שבה הריאה נמצאת בתחתית גוף המזרק, לעומק של לא יותר ממספר סנטימטרים. הדביקו סרט דביק מסביב לתחתית המזרק כדי לקבע את הבוחנה במקומה.
לאחר מכן, מזגו בזהירות אגרוז low melt בריכוז 2% בטמפרטורה של 40 degrees Celsius לתוך המזרק, כך שהחומר יכסה בדיוק את חלקו העליון של האונה, והקיפו את מזרק המתכת בבלוק קירור קר מאוד. לאחר דקה אחת עד שתיים, הכניסו את מזרק הדגימה אל הפרוס הממוכן (automated slicer), וכיילו את הלהב החדש. לאחר מכן, מלאו את מיכל הבאפר ב-PBS קר מאוד.
יישרו את מנוע ההנעה של מנוע הפסעות (step motor drive) עם מזרק הדגימה, והסירו את הסרט. העבירו את המתג למצב הנעה מהירה, עד שמנוע ההנעה של מנוע הפסעות רק יגע בחלק האחורי של הבוכנה. הגדירו את עובי הרקמה, חיתוך בודד רציף, תנודות ומהירות במכשיר החיתוך.
לאחר מכן לחצו על start והשתמשו בשפכטל דק כדי לאסוף כל PCLS בעת נפילתו למכל התמיכה (buffer tank), תוך הנחת הפרוסות לבארים בודדות בלוח 24 בארות המכיל PBS קר בקרח. לצילום סטטי של PCLS, העבירו את דגימות הריאה המכילות את האזור האנטומי הרלוונטי לצלחונות בודדים בקוטר שלושה סנטימטרים המכילים מיליליטר אחד של תערובת הנוגדנים המתאימה. לאחר 30 עד 60 דקות בקרח עם נדנוד ובהגנה מאור, שטפו את הפרוסות פעמיים במיליליטר אחד של PBS קר בקרח.
בשלב הבא, הוסיפו 50 µL של PBS לתוך צלחית זכוכית עגולה חדשה בעלת תחתית שטוחה ובקוטר שלושה סנטימטרים עבור כל דגימה, והעבירו במהירות את הפרוסות לתוך כל טיפה, תוך כדי מניפולציה עדינה של חלקי הרקמה כדי שיהיו פרוסות באופן שטוח. לאחר מכן, שאבו את ה-PBS באמצעות פיפטה, והניחו טיפה של מדיום קיבוע (mounting medium) בטמפרטורת החדר על השקף, ולאחריה מכסית זכוכית. כדי לצלם את הרקמה, הניחו את הצלחית על במה של מיקרוסקופ קונפוקאלי תחת עדשה של 20x, והשתמשו בכלי הרישום (tile tool) כדי לאתר ולסמן את קצוות הרקמה בהגדרת convex hull כדי לצמצם את זמן סריקת הרישומים.
לאחר מכן הגדירו את טווח ה-z-stack, תוך הקפדה שהטווחים שהוגדרו מתאימים לאזורים מרובים בתוך הפרוסה, ובמיוחד לאורך הקצוות. עבור דימוי תאים חיים, לאחר 30 דקות של אינקובציה בתערובת הנוגדנים הרלוונטית, שטפו את הפרוסות פעמיים עם 1 ml של Leibovitz 10 קר. לאחר מכן, הוסיפו 50 µl של Leibovitz 10 טרי לתוך חריץ אחד של זכוכית כיסוי עם תאים (chambered cover glass) לכל דגימה, ולאחריהם העבירו באופן מיידי כל PCLS אל המצע, תוך מניפולציה עדינה של הרקמות עד שיתפרסו בצורה שטוחה.
לאחר מכן, השתמשו בפיפט כדי לשאוב את המצע מכל תא וקבעו כל PCLS באמצעות משקולת פלטינה. טפטפו בזהירות באמצעות פיפט מטריקס חוץ-תאי (extracellular matrix) שהוכן טרי וקר (בטמפרטורת קרח) על כל PCLS, תוך הקפדה שהג'ל יונח מעל פרוסות הריאה ושהפרוסות לא יצופו מעל הג'ל. לאחר חמש דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius, העבירו את הזכוכית לתא של מיקרוסקופ קונפוקאלי שחומם מראש ל-37 degrees Celsius תחת עדשה של 20x.
לאחר מכן, הגדירו את טווחי ה-z-stack וה-tile בהתבסס על המרווח הרצוי בין הפריימים, תוך שימוש בכלי ה-tile לסימון אזור העניין ברקמה, ובהגדרת רשת ממורכזת (centered grid) כדי למרכז את הדגימה בשדה הראייה. תאי דנדריטיים קונבנציונליים עם ביטוי גבוה של CD11b ממוקמים בפרנכימה של הריאה, בעוד שתאי דנדריטיים קונבנציונליים חיוביים ל-CD103 שוהים בעיקר מסביב לנשמיות ובאזור התת-פלאורלי. צביעה משולבת של CD88 ו-CD172a מאפשרת להבחין בין מקרופאגים אלבולאריים שליליים ל-CD172a וחיוביים ל-CD88, לבין מקרופאגים אינטרסטיציאליים חיוביים ל-CD172a וחיוביים ל-CD88, כאשר האחרונים ממוקמים באופן מועדף בפרנכימה ולא באזור התת-אפיתליאלי.
סימון כפול עבור CD90.2, סמן ידוע לתאי T, וחלבון הפלואורסצנציה TdTomato, טרנסגן הנמצא תחת בקרה תעתוקית של פקטור תעתוק ראשי הנחוץ ללימפנגיוגנזה (lymphagiogenesis), מקל על זיהוי מבנים לימפטיים בריאה. תאי דנדריטיים קונבנציונליים חיוביים ל-CD103 נמצאים במספר אזורים אנטומיים, כולל אפיתל דרכי הנשימה המבטא CD324, מערכת הלימפה והאזור הסוב-פלורלי. ניתן להקליט תנועת תאים ואינטראקציות בין תאים באמצעות דימוי תאים חיים כפי שהודגם זה עתה.
לדוגמה, בניסוי מייצג, 16 שעות לאחר הזרקה פומית של ova-LPS, ניתן להבחין בבירור בתאים דנדריטיים חיוביים ל-CD103 המקיימים אינטראקציה עם תאי T ספציפיים ל-ova שהועברו באופן אדופטיבי לאורך תקופה של ארבע שעות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים את הכנת הרקמה ואת טכניקות הפריסה תוך שעתיים וחצי אם הן מבוצעות כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להשיג ניפוח ריאות תקין באמצעות אגרוז, ולאחר מכן לשמור על פרוסות הריאה העדינות שטוחות ככל האפשר לצורך הדמיה.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון טיפול ב-PCLS באמצעות acetylcholine או methacholine, כדי לענות על שאלות נוספות בנוגע לאיתות סידן וסגירות דרכי הנשימה תחת מצבי מחלה שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה באופן יצירת פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (precision cut lung slices) לצורך ויזואליזציה של המיקום, התנועה והאינטראקציות של תאי חיסון בריאה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה להפקת פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) לצורך ויזואליזציה של מיקום תאי מערכת החיסון בריאה. הטכניקה מאפשרת תצפית על סוגים שונים של תאי מערכת החיסון ועל האינטראקציות ביניהם בסביבה חיה ex vivo.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- פיזיולוגיה נשימתית
רקע
- פרוסות ריאה חתוכות בדיוק שומרות על המבנה התלת-ממדי של רקמת הריאה.
- שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של תנועה ומיקום של תאי מערכת החיסון.
- ניתן להשתמש בה גם להערכת התכווצות של דרכי הנשימה ושל רקמת השריר החלק.
- הטכניקה ישימה לחקר דלקת בריאה.
מטרת המחקר
- להמחשה של דפוסי הלוקליזציה והנדידה של תאי חיסון בריאה.
- לספק תובנות לגבי תגובות חיסוניות במהלך דלקת.
- לחקור אינטראקציות בין סוגים שונים של תאים ברקמת ריאה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף רקמת ריאה מעכברים בני שש עד 12 שבועות.
- שימוש במספריים לפתיחת חלל הבטן והגישה לריאות.
- ניקוז דם מהריאות באמצעות חיתוך של הווריד הנבוב התחתון (inferior vena cava).
- ניקוב הסרעפת כדי לאפשר התרחבות של כלוב הצלעות.
תוצאות עיקריות
- ויזואליזציה מוצלחת של מיקום תאי חיסון בחתכי ריאה.
- הדגמה של היכולת לעקוב אחר דפוסי נדידה של תאי חיסון.
- מתן תובנות לגבי האינטראקציות של תאי חיסון עם רקמת ריאה.
- הצגת פוטנציאל לחקר התכווצות דרכי הנשימה והשריר החלק.
מסקנות
- שיטת ה-PCLS היא כלי בעל ערך למחקר אימונולוגי.
- היא מאפשרת תצפית בזמן אמת על דינמיקה של תאי מערכת החיסון.
- טכניקה זו יכולה להעמיק את ההבנה של אימונולוגיה של הריאה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
פרוסות ריאה חתוכות בדיוק (PCLS) מאפשרות ויזואליזציה ישירה של מיקום תאי מערכת החיסון והאינטראקציות ביניהם בתוך מבנה ריאה שלם, ובכך הן ממלאות פער קריטי שנותר על ידי ציטומטריית זרימה ובדיקות כימוטקסיס in vitro. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי במודלים מוקדמים של מחלות נשימה ותומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית עבור פורט폴יו של גילוי תרופות ממוקדות אימונולוגיה. שילוב של PCLS בתהליכי גילוי מחזק את ההמשכיות התרגומית החל משלב תיקוף המטרה ועד להערכה פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיפוי מרחבי של תאי דנדריטיים ואוכלוסיות חיסוניות אחרות in situ.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת דפוסי נדידה ואינטראקציה של תאים במהלך דלקת.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי קישור מיקום תאי מערכת החיסון לאירועים רלוונטיים למחלה.
- משפר את הביטחון החזוי לבחירת מטרות אימונומודולטוריות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת פלטפורמה ex vivo רלוונטית פיזיולוגית להערכת תרכובות ברקמת ריאה שלמה.
- מאפשרת דימוג הדירות של אינטראקציות בין תאים ותגובות רקמה לגירויים.
- תומכת בסטנדרטיזציה של הבדיקה על ידי שמירה על הקשר רקמתי תלת-ממדי.
- מכינה מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף לצורך סריקות המשך ומחקרי מנגנון.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות עבור מצבים ריאתיים אלרגיים ודלקתיים.
- מאפשר ויזואליזציה של דינמיקת תאי חיסון הן במצב בסיס (steady-state) והן בתנאי דלקת.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי שילוב עם נתוני flow cytometry ו-qPCR.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכונים בהתבסס על קריאות (readouts) חיסוניות מרחביות ופונקציונליות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
מדורי רקמה של ריאה (PCLS) ממוקמים בין שלב הגילוי המוקדם לבין התיקוף הפרה-קליני, ומגשרים בין גישות in vitro ו-in vivo למחקר באימונולוגיה של מערכת הנשימה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על לוקליזציה ותנועה של תאי מערכת החיסון ברקמה שלמה.
- סריקה: מספקת פלטי דימות כמותיים וניתנים לשחזור לחקירת תרכובות ומסלולים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה מרחבית וזמנית של אינטראקציות בין תאים ודפוסי נדידה.
- מחקר תרגומי: מספקת הקשר רלוונטי למחלה עבור מחקרים מכניסטיים ומחקרים של סמני ביולוגיים ברקמת ריאה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר עבור חקירות מגוונות של תאי מבנה ותאי חיסון במודלים נשימתיים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקרי תאי מערכת החיסון.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של דימויי ריאה ex vivo ותמיכה בחזרתיות בין ניסויים.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go ומשפר את יעילות ההון על ידי הבהרה מוקדמת של מנגנוני חיסון.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכונים של נכסי נשימה ואימונולוגיה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברקמות, בדימות קונפוקלי ובזיהוי תאים מבוסס נוגדנים.
- דורש גישה לסכיכות רקמות אוטומטיות ותשתיות מיקרוסקופיה מתקדמות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולי הכנת רקמות ודימות.
- ניתן להתאמה לסממנים תאיים מבניים וחיסוניים שונים באמצעות פאנלים מתאימים של נוגדנים.
- תלוי בשמירה על חיות הרקמה והמבנה האנטומי עבור תוצרי דימות אמינים.
