Transcriptomic ניתוח C. elegans RNA רצף נתונים באמצעות Suite טוקסידו על פרויקט גלקסי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לסייע לחוקרי C.elegans ללא מומחיות בביואינפורמטיקה לבצע ניסוי ריצוף RNA ולנתח את הנתונים באמצעות פלטפורמת הגישה הפתוחה Galaxy. שיטה זו יכולה לעזור לנתח נתוני ריצוף גבוהים מורכבים כדי לספק תובנות לגבי החתימות הטרנסקריפטומיות מאחורי פנוטיפים ב-C.elegans. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת למדענים ללא הכשרה קודמת בביואינפורמטיקה לנתח נתוני ריצוף גולמיים ולייצר רשימה של גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי, יחד עם מונחי אונטולוגיה גנטית הקשורים אליהם.

למרות ששיטה זו מכוונת במיוחד לניואנסים של נתוני ריצוף C.elegans, ניתן ליישם אותה גם על אורגניזמים אחרים והקשר ביולוגי שבו יש לבחון את שינויי השעתוק העיקריים של הגנום. סרטון זה עוסק בשימוש מבוסס האינטרנט בצינור גלקסי. במידת האפשר, הפעל את זרימת העבודה באופן מקומי.

הורידו והתקינו את Galaxy בהתאם להוראות בדף הוויקי. לאחר שימוש במדריך התחל כאן המסופק בדף הבית של Galaxy, עקוב אחר הסרטון הזה. זה קריטי למשתמש להכיר ולהתמצא בממשק המשתמש של Galaxy ובכלים המשמשים בזרימת העבודה.

כדי להתחיל, לחץ על ניתוח נתונים בלוח הכותרת כדי לגשת לתצוגת הבית של הניתוח. מד ההתקדמות בפינה השמאלית העליונה עוקב אחר כמות שטח הדיסק שנעשה בו שימוש. לאחר מכן, גש לתפריט הכלים בחלונית השמאלית ולחץ על ניתוח NGS RNA.

זה מספק אפשרויות להשתמש בכל הכלים הנדרשים לניתוח נתוני רצף RNA. כעת, התחל היסטוריית ניתוח חדשה. עבור לחלונית ההיסטוריה משמאל.

לחץ על סמל גלגל השיניים ובחר באפשרות צור חדש מהתפריט המוקפץ. לאחר מכן, ספק שם תחת היסטוריה כדי לזהות את הניתוח. כדי להמשיך, עבור לתפריט הכלים, ותחת קבל נתונים, לחץ על פונקציית העלאת קובץ כדי להעלות קבצי תור מהיר גולמיים.

לאחר פתיחת המשימה בממשק הניתוח, לחץ על בחר קובץ מקומי, או בחר קובץ FTP כדי לנווט ולבחור את נתוני הרצף המתאימים. כברירת מחדל, Galaxy יזהה באופן אוטומטי את סוג הקובץ. לאחר מכן בחר את האורגניזם מהתפריט הנפתח שבמקרה זה הוא C.elegans.

לאחר מכן, לחץ על התחל כדי להתחיל את העלאת הנתונים. לאחר העלאת הקובץ, הפעולה נשמרת בחלונית ההיסטוריה שממנה ניתן לבחור את הנתונים ולגשת אליהם. כעת, המר קבצים מפורמט התור המהיר בזה אחר זה לפורמט התור המהיר על ידי גישה לתפריט NGS QC ומניפולציה, בחירת מספרת תור מהירה, בחירת הקובץ תחת קובץ לטיפוח.

בחר את סוג ציוני השוויון המהיר של הקלט המתאים והפעל את הכלי באמצעות פרמטרי ברירת המחדל. כעת ניתן לנתח את קובץ הנתונים. שימו לב במיוחד לפורמטים של קבצים ופרמטרי הבדיקה המשמשים לאורך הפרוטוקול.

ידע זה הוא בעל ערך לפתרון בעיות בבדיקות שנכשלו ובבעיות אחרות. ניתן להשתמש בבדיקות בקרת איכות לפני שתמשיך. פרטים על הפעלתם מסופקים בפרוטוקול הטקסט.

לאחר שקובץ מוכן לניתוח, מפה את נתוני הרצף על ידי פתיחת קטע ניתוח ה-RNA של NGS ולאחר מכן לחיצה על כלי הכובע העליון. מהתפריט הנפתח, מלא את התשובה לשאלה האם אלה נתוני קצה בודדים או מזווגים? לאחר מכן, בחר את קובץ התור המהיר המתאים.

בחר השתמש בגנום מובנה בתפריט הנפתח הבא ובחר את נתוני הגנום של C.elegans. בחר ברירת מחדל עבור כל אפשרויות הפרמטרים האחרות ולאחר מכן לחץ על ביצוע. כדי להעריך את השפע היחסי של תמלילים במערך הנתונים, בחר בכלי קישורי השרוול בקטע ניתוח RNA של NGS ומהתפריט הנפתח הראשון בחר את קובץ פורמט הלהיטים המקובלים הממופה שהתקבל מניתוח כובע עליון.

מהתפריט הנפתח השני, הגדר את הערת ההפניה לקובץ GTF המכיל את נתוני הגנום הנוכחיים. כאשר מוצגת לך האפשרות בצע תיקון הטיה, בחר כן והפעל את המשימה באמצעות הגדרות ברירת המחדל. לאחר מכן, מתפריט ניתוח ה-RNA של NGS פתח את כלי מיזוג השרוול כדי למזג את התמלילים המורכבים המיוצרים עבור כל דגימות רצף ה-RNA.

התיבה הראשונה בכלי טוענת את כל קבצי ה-GTF שהופקו באמצעות חפתים בשלב הקודם. כעת, בחר את קובץ התמלילים המורכב עבור כל אחד מהזנים או התנאים שנבדקו, כולל השכפולים הביולוגיים של אותו מצב זן. בחר כן לביאור הפניה למשתמש, ובחר את קובץ נתוני הגנום של הפניה.

לאחר מכן, בחר כן עבור האפשרות השתמש בנתוני רצף. זה יזהה ויבחר אוטומטית את גנום הייחוס המתאים. השאר את כל הפרמטרים האחרים בהגדרת ברירת המחדל שלהם ולחץ על ביצוע.

קובץ GTF יחיד יופק. כדי להשוות זנים או תנאים מרובים, חזור לסעיף ניתוח RNA של NGS ובחר בכלי div השרוול. לאחר מכן, מתפריט התמלילים בכלי div השרוול, בחר את קובץ הפלט הממוזג ממיזוג השרוול.

לאחר מכן הזן תוויות עבור שני התנאים. עבור כל תנאי, עבור אל שכפולים ובחר את קבצי הפלט של ההיטים המקובלים הבודדים מהכובע העליון התואמים לשכפולים הביולוגיים השונים של אותו תנאי. כדי לבחור קבצים מרובים בו-זמנית, החזק את מקש Command או Control לחוץ.

לאחר בחירת הקבצים, השתמש בהגדרות ברירת המחדל של הפרמטרים ולחץ על ביצוע כדי להפעיל את המשימה. הורד נתונים המבוטאים באופן דיפרנציאלי על ידי לחיצה על סמל השמירה בתיבת בדיקת דיפרנציאלי הגנים שנוצרה בחלונית ההיסטוריה. כדי להתחיל, גש לדיוויד מהאתר.

בכותרת העליונה של דף האינטרנט, בחר התחל ניתוח. העתק את רשימת הגנים שהתקבלו מגלקסי לתיבה A ובדוגמה זו בחר את מזהה הגן כמזהה גן בסיס תולעת.לאחר מכן תחת סוג רשימה בשאלה 3 בחר רשימת גנים ולחץ על סמל רשימת השליחה. כעת ייפתח דף הבית של אשף הניתוח ממנו ניתן לבחור משימות דוד.

קטע וידאו זה מתאר כמה מהאפשרויות הללו. תחילה, בחר אשכולות ביאורים פונקציונליים כדי לעבור לדף הסיכום. השאר את קטגוריות ההערות בהגדרות ברירת המחדל שלהן ולחץ על אשכולות הערות פונקציונליות.

אפשרות זו יוצרת אשכולות של מונחי ביאור דומים המדורגים לפי ציון ההעשרה שלהם. כעת, חזור לאשף הניתוח ובחר באפשרות תרשים ההערות הפונקציונליות כדי לזהות מונחים ביולוגיים בעלי ייצוג יתר משמעותי הקשורים לרשימת הגנים. תכונה חשובה של David היא האפשרות ליצור טבלת ביאורים פונקציונלית.

זה מפרט את כל ההערות הקשורות לגנים מבלי להציג חישובים סטטיסטיים. זה יכול להיות שימושי לניתוח גן אחר גן ולמציאת גנים ספציפיים מעניינים. כלי שימושי נוסף של דיוויד לסקירה הוא הסיווג הפונקציונלי של הגנים.

אפשרות זו מפרידה את הגנים לרשימה של קבוצות קשורות מבחינה תפקודית המדורגות לפי ציון ההעשרה שלהן. הפרוטוקול המתואר שימש לזיהוי גנים שהביטוי שלהם מווסת על ידי tcer-1 לאחר אובדן קו הנבט. הטרנסקריפטום של מוטציות glp-1 ברשימת קו הנבט ארוכות החיים הושווה למוטציות כפולות tcer-1 glp-1 שקו הנבט שלנו מפרט אך אינן מציגות הארכת תוחלת חיים.

בדיקת איכות של הרצפים לא מצאה קריאות באיכות ירודה, תוכן GC של 48 עד 49% ואורך קריאת רצף קבוע של 51 זוגות בסיסים. הכיסוי הגנומי של הדגימות הוערך בין פי שבעה ל-11. גלקסי אפשרה שילוב של נתוני NGS משני השכפולים של כל זן ולבצע ניתוח דיפרנציאלי כדי ליצור רשימות גנים המדגישות את פרופיל הביטוי הרחב של הגנום.

בסך הכל, 835 גנים באו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בין שני הזנים באמצעות ערך P שנחתך של 0.05. ניתוח הערות פונקציונליות של הגנים המווסתים למעלה חשף ארבעה אשכולות הערות עם ציוני העשרה גבוהים. הגבוה ביותר כולל ציטוכרום P450 וגנים של תגובה קסנוביוטית, ואחריו גנים המעורבים בשינויים בשומנים.

אשכולות הערות פונקציונליות של היעדים המוסדרים למטה זיהו גם מגוון אשכולות ביאורים. אלה כללו אשכולות מועשרים לתפקוד השלד התא, ויסות חיובי של גדילה, רבייה והזדקנות. צינור הגלקסיה סלל את הדרך לחוקרים במגוון רחב של דיסציפלינות ביולוגיות, לנתח שינויים בביטוי גנים בקנה מידה גדול במהירות וביעילות.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות מסוגל לערוך ניסוי חיפוש RNA, ולנתח את נתוני ריצוף ה-PUT הגולמיים באמצעות צינור הגלקסי. אתה אמור גם להיות מסוגל לחלץ מידע רלוונטי מבחינה ביולוגית מנתוני הגלקסיה באמצעות פלטפורמת David.