פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer
27 במרץ 2017
בזאת אנו מדווחים על פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי התשואות בטא עמילואיד טוהר גבוהה 42 (Aβ42) ו עמילואיד בטא 40 (Aβ40) פפטידים, מסוגל היווצרות oligomer. בטא עמילואיד הוא פפטיד צבירה נוטה, הידרופובי מאוד מעורב מחלת אלצהיימר. אופי amyloidogenic של הפפטיד עושה הטיהור שלה אתגר.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בטיהור HPLC כדי לייצר פפטידים של עמילואיד בטא 42 ועמילואיד בטא 40 בטוהר גבוה המסוגלים ליצור אוליגומרים. התכונות הביוכימיות של פפטיד בטא עמילואיד יכולות לעתים קרובות להקשות על טיהורו. לכן, השגת פפטיד בטוהר גבוה המסוגל להיווצרות אוליגומרים יכולה להיות מאתגרת. הליך זה עוזר להקל על האתגר הזה. עבור פרוטוקול HPLC זה, הכינו מלאי של מאגרים A ו-B מוכנים וכן את המאגר לפירוק הדגימה. כדי להגדיר את ה-HPLC, התקן תחילה את בקבוקי המאגר A ו-B לכניסות המשאבה. השתמש בצינורות פולימרים ובאביזרי מקשה אחת ואל תערבב את השסתומים. חבר את צינור הפולימר משקע המשאבה לכניסה של עמוד ההכנה. הפוך את החלק האחד המתאים לאצבע חזקה, וודא שהעמוד נמצא בכיוון הנכון. כעת אבטח צינור פולימרי נוסף מיציאת העמוד לגלאי אורך הגל הכפול. השתמש באביזרי מקשה אחת הדוקים לאצבע, ולאחר מכן, בתוכנת ההתקנה של HPLC, הגדר את גלאי אורך הגל למדידת פסגות ב-214 ו-280 ננומטר. לאחר מכן, חבר את שסתום הפלט של גלאי אורך הגל לשסתום היציאה של גלאי HPLC באמצעות צינורות פולימרים ואביזר מקשה אחת שנעשה מהודק לאצבע. זה ישמש כצינור איסוף הדגימות. כעת תכנת את תוכנת HPLC להפעלת שיטת הטיהור. מהאפשרות הגדר שיטת מכשיר, הזן את שיטת הטיהור על ידי שינוי פרמטר לוח הזמנים של הממס. לבסוף, הפעל את משאבת HPLC מתוכנת HPLC. כעת המשאבה תתחיל לספק את יחס ההתחלה של מאגר A ומאגר B דרך עמודת ההכנה במכשיר ה-HPLC. חיוני כעת לתת למערכת להתאזן למשך 30 דקות לפני שתמשיך בדגימות. כדי להתחיל, ממיסים שלושה מיליגרם של A גולמי
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול טיהור מותאם ב-HPLC עבור פפטידים של amyloid beta 42 (Aβ42) ו-amyloid beta 40 (Aβ40) בדרגת טוהר גבוהה. פפטידים אלו ידועים בנטייתם לאגרגציה ומעורבים במחלת האלצהיימר, דבר ההופך את טיהורם לאתגר משמעותי.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- מחקר על מחלת אלצהיימר
רקע
- פפטידים של עמילואיד בטא הם הידרופוביים ונוטים לאגרגציה.
- טיהור פפטידים אלה הוא קריטי לחקר תפקידם במחלת האלצהיימר.
- פפטידים בדרגת טוהר גבוהה נחוצים למחקרי היווצרות אוליגומרים.
- שיטות טיהור קיימות עשויות שלא להניב רמה מספקת של טוהר.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול טיהור אמין באמצעות HPLC.
- השגת פפטידים של Aβ42 ו-Aβ40 בדרגת טוהר גבוהה.
- סיוע במחקרים עתידיים על אוליגומרים של עמילואיד בטא.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- כרומטוגרפיה נוזלית בעוצמה גבוהה (HPLC)
- פרוטוקולי טיהור מותאמים אישית
- אפיון של טוהר הפפטיד
- הערכת היכולת ליצירת אוליגומרים
תוצאות עיקריות
- טיהור מוצלח של פפטידים Aβ42 ו-Aβ40.
- השגת רמות טוהר גבוהות באמצעות הפרוטוקול החדש.
- הפפטידים הפגינו יכולת ליצור אוליגומרים.
- יעילות הפרוטוקול בהשוואה לשיטות קיימות.
מסקנות
- פרוטוקול ה-HPLC המותאם יעיל לטיהור פפטידים.
- פפטידי amyloid beta בדרגת טוהר גבוהה חיוניים למחקר על מחלת האלצהיימר.
- מחקר זה מספק בסיס לחקירות עתידיות של אוליגומרים של amyloid beta.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך ניהולי
השגת פפטידים של עמילואיד בטא בדרגת טוהר גבוהה מהווה צוואר בקבוק קריטי בתיקוף מטרות ובמחקרי אוליגומריזציה של מחלת האלצהיימר. פרוטוקול טיהור זה באמצעות HPLC מאפשר ייצור הדיר של פפטידים מסוג Aβ42 ו-Aβ40 בטוהר של >95%, התומך בבדיקות מהימנות של היווצרות אוליגומרים. השיטה מספקת גישה סטנדרטית וניתנת להרחבה להפחתת סיכונים בבדיקות של מעורבות מטרה (target engagement) ומחקרים מכניסטיים בגילוי תרופות למחלות ניווניות של מערכת העצבים.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני האוליגומריזציה של עמילואיד בטא באמצעות פפטידים בדרגת טוהר גבוהה.
- ערך תפעולי: מספק חומר פפטידי הניתן לשחזור עבור בדיקות תיקוף מטרה עקביות.
- ערך חיזוי: תומך במחקרי קורלציה בין מבנה לתפקוד, החיוניים לביסוס הוודאות לגבי המטרה בתוכניות מחקר על מחלת האלצהיימר.
סקר ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות לבדיקה: מייצר פפטידים מטוהרים המתאימים לבדיקות אוליגומריזציה וקישור.
- שחזוריות: מבטיח עקביות בין מנות עבור קמפיינים של סריקה בתופעת גבוהה.
- יכולת הרחבה: ניתן להתאמה לקנה מידה אנליטי וחצי-פרפרטיבי, בהתאם לצורכי הכמות של הפפטיד.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מייצר פפטידים המשחזרים מינים פתולוגיים מרכזיים במודלים של מחלת אלצהיימר.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין ייצור פפטידים בשלב הגילוי לבין מחקרי רעילות של אוליגומרים בשלב הפרה-קליני.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: מפחית את השונות במדדי היווצרות האוליגומרים, ובכך משפר את הביטחון בתוצאות החיזוי.
אינטגרציה של תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
הפרוטוקול משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי אספקת ריאגנטים פפטידיים מתוקתפים לבדיקות של מעורבות המטרה (target engagement), אוליגומריזציה ורעילות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות על מסלולי אגרגציה של amyloid beta באמצעות סטנדרטים של פפטידים טהורים.
- פיתוח בדיקות (Assays): מאפשר הכנה של ריאגנטים עקביים ליצירת אוליגומרים ובדיקות קישור של נוגדנים.
- אנליטיקה: מספק תשומות כמותיות בדרגת טוהר גבוהה עבור HPLC, ספקטרומטריית מסות ואפיון ביופיזיקלי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין טיהור פפטידים לבין תהליכי אוליגומריזציה ומודלים של רעילות תאית בשלבים הבאים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמת טיהור ניתנת לשימוש חוזר עבור מספר איזופורמים של amyloid beta בפרויקטים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: פפטידים בדרגת טוהר גבוהה מאפשרים מחקרי אוליגומריזציה מהימנים והבהרה של מנגנוני המטרה.
- ערך תפעולי: שיטת HPLC סטנדרטית מבטיחה הדירות ומפחיתה את שיעורי הכשל בטיהור.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי הפחתת רעש ביולוגי במבחני אוליגומריזציה.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מטרות במחלת האלצהיימר באמצעות איכות פפטידים עקבית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בפיתוח שיטות HPLC ובטיפול בפפטידים.
- נדרשת גישה למערכות HPLC להכנה (preparative HPLC) עם עמודי PLRP-S וגילוי באורך גל כפול.
- דורש פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת תמיסות בופר ולהמסת דגימות.
- דורש שיקולי התאמה עבור כמויות פפטידים וספי רמת טהרה שונים.
- מוגבל על ידי המסיסות והנטייה לאגרגציה של פפטידי עמילואיד בטא בתנאי טיהור.
