Name: In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס גין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: חקור מנגנוני סיגנל תאי לא-אוטונומיים בנוירוגנזה של הרשתית באמצעות הדמיה חיה של תאי אב זברה. השיטה מאפשרת מעקב אחרי תאי אב בודדים בסביבות גנטיות שונות וחושפת את השפעת התאים השכנים על גורל התאים המתפתחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ARC DECRA כדי PRJ (DE120101311) ועל ידי (DFG) מענק מחקר כדי LP (PO 1440 / 1-1). המכון לרפואה רגנרטיבית האוסטרלי נתמכת על ידי קרנות מממשלת מדינת ויקטוריה הממשלה הפדרלית האוסטרלית. אנו מכירים ד&quot;ר ג&#39;רמי נג צ&#39;י Kei, שניהל הניסויים שתוארו כאן כפי שפורסם Kei et al. 2016. אנו מודים על הוראות דג מהונדס מפרופ Higashijima ותודה פרופ. טרנר רופ למתן של pCS2 + פלסמיד וד&quot;ר וילקינסון להפקת בונה H2B-RFP ו H2A-GFP. אנו מודים צוות המתקן FishCore (אוניברסיטת מונאש) עבור מטפלת החיות שלנו.

<ol><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).</li>
<li>Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+on+the+stage+-+spotlight+on+nervous+system+development+in+zebrafish%3A+EMBO+practical+course%2C+KIT%2C+Sept.+2013%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013.</a> Neural Dev. 8, 23(2013).</li>
<li>Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lineage in the vertebrate retina.</a> Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).</li>
<li>Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+on+neural+lineage+and+mode+of+division+in+the+zebrafish+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo.</a> J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).</li>
<li>Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-lapse+analysis+of+retinal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Time-lapse analysis of retinal differentiation.</a> Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biasing+amacrine+subtypes+in+the+Atoh7+lineage+through+expression+of+Barhl2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2.</a> J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).</li>
<li>Jusuf, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+determination+of+inhibitory+cell+lineages+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina.</a> J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).</li>
<li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+retinal+progenitor+lineages+in+developing+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+transgenic+zebrafish+embryos+for+imaging+the+developing+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).</li>
<li>Vitorino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vsx2+in+the+zebrafish+retina%3A+restricted+lineages+through+derepression%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression.</a> Neural Dev. 4, 14(2009).</li>
<li>Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+regulation+of+neuronal+production+in+the+larval+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina.</a> J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).</li>
<li>Reh, T. A., Tully, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tyrosine+hydroxylase-containing+amacrine+cell+number+in+larval+frog+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina.</a> Dev Biol. 114, 463-469 (1986).</li>
<li>Livesey, F. J., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vertebrate+neural+cell-fate+determination%3A+lessons+from+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina.</a> Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).</li>
<li>Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarization+and+orientation+of+retinal+ganglion+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo.</a> Neural Dev. 1, 2(2006).</li>
<li>Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alx%2C+a+zebrafish+homolog+of+Chx10%2C+marks+ipsilateral+descending+excitatory+interneurons+that+participate+in+the+regulation+of+spinal+locomotor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits.</a> J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).</li>
<li>Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V2a+and+V2b+neurons+are+generated+by+the+final+divisions+of+pair-producing+progenitors+in+the+zebrafish+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord.</a> Development. 135, 3001-3005 (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2007).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+from+each+retinal+neuron+population+drives+expression+of+subsequent+fate+determinant+genes+without+influencing+the+cell+cycle+exit+timing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing.</a> J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Zou, J., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+GFP-expressing+blastomeres+for+live+imaging+of+retinal+and+brain+development+in+chimeric+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
<li>Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chimeric+zebrafish+embryos+by+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Schier, A. F., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+of+axis+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics of axis formation in zebrafish.</a> Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).</li>
<li>De Luca, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep04898">ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos.</a> Sci Rep. 4, 4898(2014).</li>
<li>Lin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+requirement+for+ptf1a+in+endocrine+and+exocrine+lineages+of+developing+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas.</a> Dev Biol. 274, 491-503 (2004).</li>
<li>Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+retina+in+the+killifish%2C+Fundulus+heteroclitus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus.</a> J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).</li>
<li>La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1894769">Cytogenesis in the monkey retina.</a> J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).</li>
<li>Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+and+topography+of+cell+genesis+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Timing and topography of cell genesis in the rat retina.</a> J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).</li>
<li>Sharma, S. C., Ungar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+goldfish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the goldfish retina.</a> J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).</li>
<li>Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+birthdays+in+Xenopus+laevis+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Cell birthdays in Xenopus laevis retina.</a> Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הבנתי את המידה שבה תאי שכנים להשפיע עיתוי של הביטוי של גורמים בקביעת גורל תא חיוני חיוני כאשר מכוונים להורות עוברי או מושרה ביעילות תאי גזע מולטיפוטנטיים להתמיין לסוג תא ספציפי שלאחר mitotic או אפילו רקמה בדוגמת. יתר על כן, בחינת האירועים המולקולריים האלה בתאים המתפתחים של החי בנוסף מספק דינמית רלוונטי (זמן ומרחב) מידע על הקשרים הסלולר המסוימים בקשר עם אירועים אלה in vivo. מחקרים כאלה לא ניתן להשיג בקלות בכל דגמי החוליות. <p class="jove_content" style=";text-align:rig...

<html> היכולת לחזות תהליכים התפתחותיים חשובים בתוך חוליות vivo ב תרמה להפיכת דג הזברה כמודל מפתח ללימוד תנאים נורמלים ומחלות (הנסקרת ב 1, 2). בפרט, הרשתית העצבית היא חלק בלתי נגיש של מערכת העצבים המרכזית. הרשתית משאיל את עצמו לבצע מחקרים בקלות הנוירוגנזה בשל מבנהו מאורגן, אך פשוט יחסית, וסוגים נוירון שלה שמור ביותר על פני מינים בעלי חוליות 3. דינמיקה של התנהגויות הסלולר כגון התפשטות, יציאת מחזור התא, חלוקת תא סימטרית, מפרט גורל, בידול, והיווצרות מעגלים עצבית ניתן בעקבות לאורך כל התהליך של retinogenesis, אשר הושלם ברשתית המרכזית של דג הזברה על ידי 3 ד postfertilization ( 4 DPF), 5,נ&quot;צ &quot;&gt; 6, 7. יתר על כן, הדרישות הפונקציונליות של גנים שונים בכל השלבים שהוזכרו לעיל ניתן להעריך בו זמנית ברשתית דג הזברה, מתן יתרון על פני דגמים חוליות אחרים בהם פנוטיפים וכתוצאה מיישום של טכניקות נוקאאוט גנטי ניתן להעריך רק בבדיקה שלאחר המוות של קבוע רקמות. בפרט, השימוש בקווים מהונדסים שבו אנו יכולים לחזות את ולנטר את הביטוי של חלבוני ניאון כמו transgenes כתב ברשתית, מאפשר לנו להשיג החלטה זמנית של ביטוי גנים העומדים בבסיס ראשיתו של סוג תאים עצבי בפרט. בשל ההתפתחות המהירה של דג זברה, אירועים אלה ניתן דמיינו בתקופה התפתחותית כולו, ובכך לספק תובנה עמוקות יותר את החשיבות הזמנית של ביטוי גנים ביחס לרכישת זהות תאים עצבית ועל התנהגות תא. לבסוף, גישות אלה ניתן לשלב ביעילות של דג הזברה עם הדור של הכימרה באמצעות השתלות, וכתוצאה מכך תובנות שני היבטים מרכזיים של תפקוד הגן. ראשית, בחינת תאים המושתלים מעובר תורם, שבו גן מסוים ופל תוך שהם מפתחים בסביבת סוג ברה ללא תווית, מאפשר לנו להשיג מידע רלוונטי על תפקוד גן באופן תא אוטונומי. זה מוביל לתובנות חשובות לגבי הפונקציה של גורמים הקובע גורל רשתית בתוך ובתאים הם באים לידי ביטוי בדרך כלל. זה בא לידי ביטוי על ידי בחינה של התוצאה גורל התפתחותי של אבות כי כבר לא יכול ליצור חלבון פונקציונלי מן הגנים האלה 4, 6, 8, 9. ניצול גישה זו, הראינו כי גורמים הקובעים גורל רב (למשל, Vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) לפעול תא-autonomously לנהוג גורלות עצביים ברשתית ספציפית; חוסר ביטוי גנים מוביל בעיקר למתג גורל, כך התאים עם גן המציאה להישאר קיימא על ידי אימוץ גורל 4 תאים חלופי, 6, 7, 10. שנית, ניסויי כימרי כזה יכול לשמש כדי להעריך כמה פרא סוג אבות להתנהג כאשר הם מפתחים בתוך סביבות גנטיות שונות. לדוגמא, על ידי השוואת התפתחות תאי WT שבדרך כלל לבטא את גן של עניין (ו transgene כתב) בתוך WT לעומת סביבת מארח מניפולציות (למשל, נוקאאוט גנטי / מציאה), את ההשפעות הנובעות על ביטוי גני גורל תא ניתן להעריך . חוסר סוגי נוירונים מסוימים בסביבת המארחת, למשל, מוכיח להשפיע על התנהגות אב סוג בר באופן תאים שאינם אוטונומי, להטות אותם לכיוון הבחנה לתוך o מיוצגת כראויr חסר סוגי נוירונים 4, 7, 11, 12. בהתחשב בכך נוירונים ברשתית נולדים צו histogenic נשמר על ידי ביטוי מתוזמן ברצף של גנים הקובעים גורל ספציפיים עצביים (ביטוי גני גורל) (הנסקרת ב 13), השתמשנו בשיטות אלה כדי להדגים כיצד התזמון של ביטוי גני גורל אבות סוג ברים מושפע כאשר אבות כאלה לפתח בסביבות מארח רשתית עם קומפוזיציות הסלולר סוטות מושרות. כאן, אנו מתארים גישות אלה כעדות איך השילוב לסטנדרטים יחסית בשימוש נרחב בטכניקות מאפשר בחינת המועדים של ביטוי גני גורל בפיתוח אבות רשתית 8, 9. פרוטוקול זה מתאר גישה ניסויית שילוב הדמיה זמן לשגות עם הקלות של לכללהרכיב השתלת בעובר דג הזברה פיתוח vivo לשעבר כדי לעקוב אחר תאים בודדים mosaically שכותרתו לאורך כל תקופת retinogenesis התפתחותית. על ידי ביצוע מניפולציות גן פונקציונלי או בעובר המארח, העובר התורם, שניהם או אף אחד, אפשר להעריך את האוטונומיה תאים של תפקוד הגן. גישה זו ניתן להתאים נרחבת לשאלות מחקר דומות בכל מערכת אחרת עבורו הרכיבים הבודדים המפורטים כאן מתאימים.

<table><tbody><tr><td></td> ניתן להכין מנות מצופות אגרוז <td>ביולין</td><td>BIO-41025</td> מספר <td>ימים לפני, לאטום בפרפילם למניעת ייבוש ולאחסן ב-4 & #176; C</td></tr><tr><td>אגרוז נמס נמוך</td><td>Sigma</td><td>A9414-100G</td><td>ניתן להכין בנפח גדול יותר, לחמם במיקרוגל לנוזל ולאחר מכן לשמור מותך ב 40 & # 176; C אמבט מים. ניתן להכין 1 מ"ל אליקוטים (אחד לכל קבוצת עוברים שהורכבו).</td></tr><tr><td>ניתן להשתמש בצינור נימי זכוכית borosillicate ללא נימה</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0035</td><td>חלופות בקוטר דומה&nbsp;</td></tr><tr>ניתן להשתמש <td>בצינור נימי זכוכית borosillicate עם נימה</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0038</td><td>חלופות בקוטר דומה&nbsp;</td></tr><tr><td>צלחות פטרי מזכוכית (קוטר 60 מ"מ)</td><td>אספקת מדע</td><td>1070506</td><td>כל חלופת זכוכית בכל גודל</td></tr><tr><td>צינור הזרקה (2 מ')</td><td>Eppendorf</td><td>524616004</td><td>זה מחבר את מחזיק המחט למזרק במהלך ההשתלה</td></tr><tr><td>תבנית מיקרו-הזרקה (תבנית פלסטיק עם בליטות בצורת טריז)</td><td>כלי מדע אדפטיביים</td> חלופות <td>PT-1</td><td>עם צורה דומה יכולות להיות שימוש</td></tr><tr><td>במיקרו-מחט מחזיק</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>כל חלופה המתאימה לקוטר החיצוני של מחטי ההזרקה ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>במזרק מיקרו</td><td>Narishige או Eppendorf Femtojet</td><td></td><td>מזרק פנאומטי באמצעות</td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור</td> לחץ גז <td>Coherent Scientific</td><td>M330IR</td><td>ניתן להשתמש בחלופות דומות</td></tr> קצה <tr><td>מיקרו-מעמיס</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>מושך מחטים</td><td>Sutter Instruments</td><td>דגם P-2000</td><td>ההגדרות המשמשות לחולץ זה הן: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. ניתן להשתמש בכל מושך מחט אם הוא מביא לממד קצה מתאים</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Interpath</td><td>PM996</td><td>כל סרט פרפין</td></tr><tr><td>פסטר פיפטה פלסטיק</td><td>Samco Scientific</td><td>202</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur פיפטה זכוכית</td><td>Hirschmann Laborgeraete</td><td>9260101</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5942-25MG</td><td>&nbsp; פרוטאז מסוג XIV</td></tr><tr><td>N-phenyl thiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTU הוא רעיל וניתן להכין אותו כתמיסת מלאי כדי למנוע חשיפה תכופה לאבקה, התייעץ עם MSDS לפני הרכישה/שימוש.</td></tr><tr><td>מיצוי ג'ל Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>ניתן להשתמש בכל חלופה לטיהור DNA</td></tr> ערכת <tr><td>Rneasy Mini</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>ניתן להשתמש בכל חלופה לטיהור RNA ניתן להשתמש בערכת</td></tr><tr><td>SP6 mMessage</td><td>Qiagen</td><td>AM1340</td><td>כל חלופה לתמלול DNA באמצעות SP6</td></tr></tbody></table>

in vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות cell nonautonomous

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

החוזק הגנטי וטכני הפכו את חוליות דג הזברה אורגניזם מודל מפתח אשר ההשלכות של מניפולציות הגן ניתן לייחס in vivo לאורך כל תקופת ההתפתחות המהירה. ניתן ללמוד מספר רב של תהליכים כולל התפשטות תאים, ביטוי גנים, נדידת תאים ומורפוגנזה. חשוב לציין, הדור של מפלצות באמצעות השתלות יכול להתבצע בקלות, ומאפשר תיוג פסיפס ומעקב של תאים בודדים תחת שפעת הסביבה המארחת. לדוגמא, על ידי שילוב של מניפולציות גן פונקציונליות של עובר המארח (למשל, באמצעות microinjection morpholino) ו הדמיה לחיות, את ההשפעות של חיצוני, אותות nonautonomous תא (המסופקים על ידי הסביבה המהונדסת הגנטי) על תאי תורם מושתלים בודדים ניתן להעריך. כאן אנו מדגימים כיצד גישה זו משמשת כדי להשוות את התחלתה של ביטוי transgene ניאון כמדד עיתוי determin גורל התאation בסביבות מארח גנטי שונה. במאמר זה, אנו מספקים פרוטוקול עבור microinjecting עוברי דג זברה כדי לסמן תאים תורמים לגרום מציאת גן בעוברים מארחים, תיאור של טכניקת ההשתלה השתמשה כדי ליצור עבר chimeric, ואת הפרוטוקול להכנה והפעלה בתוך confocal הזמן לשגות vivo הדמיה של עוברים מרובים. בפרט, ביצוע הדמיה multiposition הוא קריטי כאשר משווים עיתוי אירועים כגון התפרצות של ביטוי גנים. זה דורש איסוף נתונים מתוך שליטה מרובה ועובר ניסיוני מעובד בו זמנית. גישה כזו ניתן להרחיב בקלות ללימודים של השפעות חיצוניות בכל איבר או רקמה של בחירה נגישה לחיות הדמיה, ובלבד השתלות ניתן לכוון בקלות על פי מפות גורל עובריות הוקמו.

עבודה זו מציגה פרוטוקול ניסוי להעריך שינויים בעיתוי ביטוי גנים כאשר אבות רשתית סוג בר להתפתח בתוך עובר מארח morphant. עובר מארח ניסיוני הם morphants Ptf1a, אשר חסרים את interneurons האופקי amacrine ביניים הנולד של הרשתית 7, 26. אלה היו לעומת שליטה לארח עוברי, אשר הוזרקו עם morpholino שליטה סטנדרטי. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;directi...

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

המטרה הכוללת של הליכים אלו היא לבחון כיצד שינויים בביטוי גנים, בין אם בתוך תאים המתפתחים ובין אם בסביבתם, משפיעים על תהליכים זמניים במהלך ההתפתחות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח, כגון האם העיתוי של קביעת גורל התא נשלט על ידי גנים המובעים באופן תא-אוטונומי בתוך תא, או באופן לא תא-אוטונומי בתאים שכנים. היתרון המרכזי של טכניקה זו טמון ביכולת לעקוב אחר תאי אב בודדים בחולייתן in vivo בעוד התאים מתפתחים בסביבות מובחנות גנטית.את הפרוצדורה תדגים סטפני דודצ'יג (Stefanie Dudczig), עוזרת מחקר מהמעבדה שלי. לאחר הכנתו שלו של עוברים של zebrafish, וכן של מחטי מיקרו-הזרקה עם Morpholinos או mRNA, בהתאם לפרוטוקול הכתוב, טבול את קצה המחט בטיפה של שמן מינרלי בתוך צלחת. מדוד את נפח ההזרקה על ידי לחיצה על דום הרגל, וכוון את לחץ הגז ו/או את משך הזמן עד שנפח ההזרקה יהיה שווה ל-1 nanoliter, כפי שנמדד באמצעות שקופית מיקרומטר, או לחלופין, באמצעות סרגל העדשה (eyepiece graticule).הניחו זכוכית מיקרוסקופ בתוך צלחת פטרי, ובעזרת פפית העברה, הניחו עוברים בשלב התא הבודד לאורך קצה הזכוכית. לאחר מכן, בעזרת פפית העברה דקה, הסירו כמה שיותר נוזל כדי למנוע תנועות במהלך ההזרקות. לאחר מכן, באמצעות טיפ של Microloader שחצית מהקצה הדק שלו הוסרה, יישרו את העוברים לעמודה אחת.לאחר מכן, הרהירו את המחט לעבר עובר בשלב תא בודד והחדירו אותה דרך הכוריון והחלמון בתנועה אחת חלקה. ברגע שקצה המחט ממורכז בחלמון, לחצו פעם אחת על דוושת הרגל והזריקו במיקרו-הזרקה ננוליטר אחד של mRNA של H2AGFP או H2BRFP אל תוך החלמון של העובר בשלב התא הבודד. הוציאו את מחט ההזרקה, הזריזו את הצלחת המכילה את העוברים כדי להביא את העובר הבא למקומו, והמשיכו בהזרקה עד להזרקה של כל עמודת העוברים.לאחר הזרקת כל העוברים, הטו את הצלחת בזווית של 30 עד 45 מעלות, והשתמשו בזרם עדין של תווך E3 בבקבוק לחיצה כדי להעביר את העוברים המוזרקים לצלחת פטרי נקייה וחדשה. שלוש שעות לאחר ההפריה, תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 2X עד 5X, השתמשו במסנן RFP כדי לבדוק את עוברי התורם לאיתור אות סימון. בחרו עוברים מפותחים היטב עם אות פלואורסצנטי חזק.לאחר הכנת פלטות ההזרקה והצלחות הפטרי בהתאם לפרוטוקול הכתוב, חתכו את הקצה של פיפטת פסטור מזכוכית בעלת צורה ארוכה ודפנה דקה לאורך המאפשר תמרון נוח, וזאת באמצעות שריטת המחט בסכין יהלום תוך כדי סיבובה עד שנשירה של הקצה. ודאו שהחתך ישר. לאחר מכן, כדי שלא לפגוע בעובריות שעברו דקוריון (dechorionated), בצעו ליטוש באש של פיפטת ההעברה מזכוכית על ידי סיבוב המשטח החתוך בלהבת מבער בנזן ליצירת קצוות חלקים.כדי לבצע דה-כוריונה (dechorionate) לעוברים, העבירו עוברים של מארח ותורם מפותחים היטב לשתי כוסות Erlenmeyer מזכוכית בנפח 10 מיליליטר, והסירו כמה שיותר מהנוזל. הוסיפו לכל כוס 5 מיליליטר מתמיס הפרוטאזאריז בריכוז 0.5 מיליגרם למילליטר שהוכן מראש, וסובבו בעדינות את העוברים תוך התבוננות בהם תחת מיקרוסקופ סטריאו (dissecting microscope). תוך כדי המשך הסיבוב, ברגע שהעובר הראשון יוצא מהכוריון, השתמשו במצע E3 לביצוע שלושה שטיפות מהירות להסרת תמיסת הפרוטאזאז, על ידי שפיכת רוב הנוזל ומילוי מחדש של הכוס באמצעות מזיגה עדינה של E3 לאורך הדופן.הפסיקו את דה-הכוריון האנזימטי (dechorionation) על ידי שטיפה מהירה אך עדינה ברגע שניתן להבחין במספר העוברים הראשונים שסוכו מהכוריון. לצורך ההשתלות, בחרו רק עוברים שסוכו מהכוריון בעלי מסת תאים סימטרית וללא עיוותים ברורים או נזקים לחלמון. כדי לבצע השתלת בלאסטולה, התקינו את המחט במחזיק המחטים וחברו אותה לצינוריות של מערך ההשתלה.בדקו את האטימות על ידי הפעלת המזרק באופן ידני לשאיבה של נוזל פנימה והחוצה מהמחט. לאחר מכן, העבירו באמצעות פיפטת זכוכית את העוברי התורמים לעמודה הראשונה של תבנית האגרוז. לאחר מכן העבירו את העוברי המארחים לעמודות שתיים עד שש של תבנית האגרוז.הניחו בעדינות את מחט ההשתלה על תאי הבלסטומרים של עובר תורם, ושאבו באיטיות כ-20 עד 50 תאים לתוך מחט ההשתלה. הימנעו משאיבת החלמון. באמצעות המיקרו-מניפולטור, הרימו את מחט ההשתלה מהעובר התורם.העבירו את צלחת ההזרקה שמאלה, והחדירו את קצה מחט ההשתלה דרך צד מסת התאים, אל הקוטב החייתי של עובר המאכסן הראשון. הפקידו בין חמישה ל-10 תאים סמוך לפני השטח, בהתאם למיפוי גורל (fate mapping) המראה כי אזור זה הופך לשדה העין של המוח הקדמי. כדי לקבע את העוברים לצורך הדמיה, שאבו מקסימום חמישה עוברים לתוך פיפטת העברה מפלסטיק והניחו לעוברים להצטבר בקצה הפיפטה באמצעות כוח הכבידה.השקיפו את פיפט ההעברה על פניו של מבחנה פלסטית שהוכנה מראש ומכילה 1% low-melt agarose, ואפשרו לעוברים לשקוע לתוך המבחנה תוך הגבלת כמות ה-E3 המועברת. לאחר מכן, העבירו את חמשת העוברים ממבחנת האגרוז לתוך צלחת פטרי עם 0.5 עד מיליליטר אחד של אגרוז, ובאמצעות אותה פיפט העברה, הסירו את עודפי האגרוז כך שתישאר רק טיפה קטנה. השתמשו בפיפט טעינה מיקרוסקופית (micro-loading pipette) שקצהו שבור כדי לסדר את העוברים במקביל, עד שהאגרוז יתמצק.לאחר מכן, המשיכו להניח עד חמישה עוברים בכל פעם, בטיפות אגרוז נפרדות. אם משתמשים במיקרוסקופ אנכי, הימנעו מהנחת עוברים במרחק של פחות מסנטימטר אחד מהיקף פטרי dish. השתמשו ב-1% low-melt agarose נוסף כדי לחבר את טיפות האגרוז זו לזו בצד הכלי, כדי למנוע תזוזה או תזוזות לצדדים במהלך ההדמיה.בחרו עוברים בעלי זווית קיבוע נכונה ודופק חזק, המכילים מספר תאי תורם מושתלים בעיקר ברביע הבטני-קדמי (anterior ventral quadrant) של הרשתית המתפתחת, שם מתחיל גל ביטוי הגנים. בצעו את הדימוי בהתאם לפרוטוקול הכתוב. כפי שמוצג באיור זה, הזרקה מיקרוסקופית של 1 nanoliter של mRNA לחלמון של עוברים בשלב התא הבודד גורמת לביטוי של חלבון דווח פלואורסצנטי עד שלוש שעות לאחר ההפריה, שלב שבו נבחרים התורמים הבהירים ביותר.ב-24 שעות לאחר ההפריה, עוברים עם תאי תורם שהושתלו במיקומים רטינליים רלוונטיים הוכפפו לדימיוג במקצבי זמן (time-lapse imaging) למשך 16 עד 24 שעות. תמונה קונפוקאלית זו של חיתוך אופטי בודד בציר Z מראה חפיפה של השדה הבהיר בערוצים אדומים בעין המתפתחת, כאשר מספר תאי תורם מסומנים באדום בתוך סביבת מאחס שאינה מסומנת. מיקרוגרפים אלו הם מדימיוג במקצבי זמן של תאי תורם מסוג wild-type מתפתחים מעוברים טרנסגניים של atoh7:gapGFP שהושתלו במאחס wild-type שאינו מסומן.תחילת ביטוי של הגן המעובר (transgene) מודגמת עבור מספר תאים כפי שניתן לראות כאן. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע את ההזרקות המיקרוסקופיות תוך שעתיים, ואת בחירת העובריים, הכבנתם והשתלתם ניתן להשלים תוך שלוש שעות באותו היום. בעקבות הליכים אלו או במקביל להם, ניתן לקבע עובריים בגילים ספציפיים לצורך ניתוח פוסט-מורטם.לדוגמה, אנו יכולים לכמת אילו פרופורציות של תאי תורם מבטאות גן או חלבון מסוים, בעלות מורפולוגיה ספציפית, או הגירה למיקום מסוים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע מניפולציה גנטית לעוברים של דגי זברה וליצור כימרות בין תורם למארח הנבדלים גנטית. כמו כן, אתם תהיו מסוגלים להרכיב את העוברים לצילום time-lapse in vivo כדי לענות על שאלות שלא ניתן לענות עליהן ברקמה מקובעת.

in-vivo-imaging-transgenic-gene-expression-individual-retinal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

דג הזברה השתלת מאפשר שילוב של גנטיקה אמבריולוגיה ליצור מפלצות רקמות ספציפיות. וידאו זה מדגים gastrula מבוים השתלות תא אפשרו במעבדה שלנו כדי לחקור את התפקידים של אוכלוסיות astroglial ו רמזים הנחיות ספציפיות במהלך היווצרות השליכה בקידמתו.

ממוקד רקמות מפלצות עובריים: דג הזברה Gastrula השתלת תאים

פרוטוקול זה מתאר הדמיה של נוירונים בודדים או תאים הרכס העצבי החיים עוברים דג הזברה. שיטה זו משמשת כדי לבחון התנהגויות הסלולר לוקליזציה אקטין פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה confocal זמן לשגות.

הדמיה חיה של תנועתיות התא ואת cytoskeleton אקטין של נוירונים בודדים לבין תאים קרסט עצבית בעוברים דג הזברה

אנו להדגים פרוטוקול ליצור עוברי דג הזברה chimeric להתנהגות הדמיה לחיות הסלולר במהלך embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

בסרטון הזה, טכניקות הדמיה ססגוניות זמן לשגות confocal ו אבלציה תא ממוקד מסופקים. זמן לשגות הדמיה משמש כדי לפקח על התנהגותם של תאים מסוגים שונים של...

ססגוניות זמן לשגות הדמיה של דג הזברה טראנסגנטי: חזותי בתאי גזע רשתית הופעל על ידי אבלציה ממוקד תאים עצביים

הסרטון הנוכחי מדגים שיטה אשר מנצל שילוב של electroporation ו מיקרוסקופיה confocal לבצע הדמיה לחיות על הפרט ובתאים עצבית forebrain דג הזברה מתפתח.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

שיטה א 'תנאי מציאה ביטוי חלבון המטרה ברשתית דג הזברה מבוגר מתואר, הכוללת הזרקת intravitreally morpholinos antisense ו electroporating אותם לתוך הרשתית. החלבון המתקבל הוא הפיל במשך כמה ימים, אשר מאפשר בדיקת תפקידו של החלבון או התחדשות הרשתית ללא פגע.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

הדמיית ההתנהגות הדינמית של אברונים ומבנים תת-תאיים אחרים in vivo יכולה לשפוך אור על תפקודם במצבים פיזיולוגיים ומחלות. כאן, אנו מציגים שיטות לתיוג גנטי של שני אברונים, צנטרוזומים ומיטוכונדריה, והדמיית הדינמיקה שלהם בעוברי דג זברה חיים באמצעות מיקרוסקופיה רחבת שדה וקונפוקלית.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

בשילוב של השתלת תאים, תיוג שלד ציטו וגישות אובדן/רווח תפקוד, פרוטוקול זה מתאר כיצד ניתן להשתמש בצלחת הקדם-כורדלית הפוטנציאלית של דג הזברה הנודד כדי לנתח את תפקודו של גן מועמד בנדידת תאים in vivo.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

התחדשות רשתית דג זברה בעיקר נחקרה באמצעות רשתית קבועה. עם זאת, תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית interkinetic להתרחש במהלך תגובת המשובים ודורשים דימות תאי חיים כדי לחקור את המנגנונים. כאן אנו מתארים תנאי תרבות והדמיה לפקח הגירה הגרעינית Interkinetic (INM) בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופ multiphoton.

תרבות של מבוגר דג הזברה טראנסגנטי רשתית Explants עבור Live- תא הדמיה ידי multiphoton מיקרוסקופי

הדמיה רקמת רשתית יכול לספק מידע מתא בודד לא יכול להיות שנאספו שיטות ביוכימיות מסורתיות. פרוטוקול זה מתאר הכנה של הרשתית פרוסות דג זברה הדמיה קונפוקלי. פלורסנט מקודדים גנטית חיישנים או מחוון צבע לאפשר הדמיה של תהליכים ביולוגיים רבים סוגי תאים ברשתית ברורים.

הכנת פרוסות דג זברה למבוגרים עבור לשעבר Vivo הדמיה ניסויים ברשתית טריים

חקור מנגנוני סיגנל תאי לא-אוטונומיים בנוירוגנזה של הרשתית באמצעות הדמיה חיה של תאי אב זברה. השיטה מאפשרת מעקב אחרי תאי אב בודדים בסביבות גנטיות שונות וחושפת את השפעת התאים השכנים על גורל התאים המתפתחים.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג'ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

גלה סרטונים נוספים