Name: פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: למד תיוג תאי דם באמצעות צבע פלואורסצנטי לחקירת דינמיקת זרימה ברשתית עכבר. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני מחלות רשתית כמו רטינופתיה סוכרתית באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט המחקר מומן על-ידי מענק מחקר חדש מטעם המועצה הלאומית למחקר רפואי (NMRC), סינגפור. הצוות יאהה להכיר את ההכשרה המחקרית שניתנה לד&quot;ר אגרוול במכון לרפואת עיניים (IoO), אוניברסיטת קולג &#39;בלונדון (UCL), במסגרת המחקר הלאומי של המועצה למחקר רפואי (NMRC), מחודש נובמבר 2012 ועד אוקטובר 2014, בהנחיית פרופ&#39; דוד שימה. ד&quot;ר אגרואל רכש את הקונספט ואת הכישורים לתיוג התאים והדמיה חיה במעבדה של ד&quot;ר שימא. לכן, הצוות יכיר בהדרכה ובהדרכה במהלך הדרכתו של פרופ &#39;דוד שימה, פרופ&#39; קית &#39;מייסנר, ד&quot;ר פיטר לונד וד&quot;ר דאיו איוואטה.

פרוטוקולים של בעלי חיים המשמשים במחקר זה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת SingHealth, סינגפור והם בהתאם להנחיות של האגודה לחקר חזון ורפואת עיניים (ARVO) הצהרה לשימוש בבעלי חיים עיניים או חזון מחקר. 1. תיוג של Erythrocytes ו leukocytes עם צבעים ניאון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה של ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ICG (1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) על ידי המסת 3 מ&quot;ג ICG ב 1800 μL של מים מזוקקים מעוקרים. הוסף 200 μL של 10x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 40% 1x PBS ידי הוספת 4 מ&quot;ל של 1x PBS ל 6 מ&quot;ל של מים מזוקקים מעוקרים. הכן 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ב PBS על ידי הוספת 100 מ&quot;ג של BSA ל 10 מ&quot;ל של 1x PBS. מערבבים היטב עד BSA הוא מומס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של אריתרוציטים ו leukocytes באמצעות צנטריפוגה שיפוע צפיפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים (פרוע tyPE C57BL / 6) באמצעות שילוב של קטמין הידרוכלוריד (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine hydrochloride (0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) (על פי לוח זמנים 1, תחת הנחיות ARVO). אישור הרדמה על ידי רפלקס נסיגה רפלקס ( כלומר , קמצוץ הבוהן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להכניס את המחט 29 מד (מחובר מזרק 1 מ&quot;ל) בזווית costal מכוונת כלפי הלב. כדי לאשר את המחט הוא בתוך הלב, למשוך את הבוכנה מעט לבדוק אם הדם הוא נסוג לתוך המזרק. Exsanguinate 0.8 - 1 מ&quot;ל של דם ישירות מהלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את הדם לתוך ethylene diamine tetra חומצה אצטית (EDTA) (1.8 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של דם) המכיל צינור איסוף דם ומערבבים בעדינות כדי למנוע קרישה של הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים על ידי מתן pentobarbital (80 מ&quot;ג / ק&quot;ג) על ידי הזרקה intraperitoneal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבת הדם כולו על גבי פוליסוקרוז ונתרן פתרון diatrizoate (יחס 01: 1, צפיפות 1.077 גרם / מ&quot;ל) בצינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל ו centriFuge (450 xg, 30 דקות) כדי לאפשר את ההפרדה של leukocytes ו אריתרוציטים מהפלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לבטל את supernatant (פלזמה) באמצעות פיפטה. בזהירות להעביר את המעיל באפי (leukocytes) ו אריתרוציטים (אדום תא דם שכבת) לתוך צינורות חדשים נפרדים באמצעות טפטפות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ICG (1.5%) תיוג של אריתרוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את אריתרוציטים עם 1x PBS להסיר כל מזהמים. Resuspend את אריתרוציטים 1x PBS (1: 1) לעשות 50% hematocrit. 0.5 מ&quot;ל Aliquot של 50% hematocrit (~ 250 μL אריתיות ארז) לתוך צינורות microcentrifuge. צנטריפוגה אריתרוציטים (750 xg, 5 דקות) וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μL של 40% 1x PBS ל אריתיות pelleted, לערבב היטב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הוסף 100 μL של ICG (1.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) ההשעיה אדומה, לערבב בעדינות על ידי הפיכת הצינור, ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. הוסף 300 μL של 1x PBS ו דגירה ב37 מעלות צלזיוס חממה שייקר במשך 60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה אריתרוציטים המוביל (750 xg, 3 דקות) ו resuspend ב 1 מ&quot;ל 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את התאים ~ 3 - 5 פעמים עם 1x PBS עד supernatant ברור (שלב 1.3.3). לאחר לשטוף האחרון, לסלק את supernatant ולהוסיף 1% BSA PBS (1: 1) כדי שכותרתו מראש מסומנת אריתרוציטים כדי להשיג 50% hematocrit (1.25 x 10 8 תאים / מ&quot;ל) של ICG שכותרתו אריתרוציטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתרן פלואורסצין (1%) תיוג של לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרדת המעיל באפי מן הדם באמצעות צנטריפוגה שיפוע שיפוע (משלב 1.2.6), לשטוף את התאים פעם עם 10 מ&quot;ל של 1x PBS על ידי צנטריפוגה ב XG 450 למשך 10 דקות כדי להסיר כל מזהמים. Resuspend גלולה ב 900 μL של 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100 μL של 10% נתרן פלואורסצין μL 900 ההשעיה של ליקוציט ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. לשטוף את התאים שכותרתו שלוש פעמים עם 10 מ&quot;ל 1X PBS על ידי centrifugiNg (450 xg, 10 דקות). Resuspend התאים 100 μL 1x PBS. </li></ol></li></ol> 2. Live הדמיה של תאים תווית fluorescently <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Live-cell הדמיה של ICG שכותרתו אריתרוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין תאים להזרקת דרך וריד זנב או מסלול רטרו מסלולית, לדלל את 50% hematocrit של ארתרוציטים שכותרתו ICG ידי פי 10 ו -50 פי עם 1x PBS לעשות 5% ו 1% hematocrit תאים, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר תחת אור אינפרא אדום (עוצמת 250W) במשך 5 דקות לתת וריד הזנב להתרחב. להרדים את העכבר עם קטמין הידרוכלוריד (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine hydrochloride (0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג) באמצעות הזרקת intraperitoneal (כאן, על פי לוח זמנים 1, תחת הנחיות ARVO). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשמיד כל תלמיד של העיניים עם ירידה של 0.5% tropicamide ו 2.5% phenylephrine hydrochloride. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את עדשת המגע מעל עין אחת עבור הדמיה. השתמש ג&#39;ל עיניים כ מדיום עבור הדמיה כדי למנוע drynesS של הקרנית. תקן את לייזר confocal סריקה ophthalmoscopy (SLO) מצלמה עם עדשה דיופטר +25 כדי לפצות על שבירה של העין העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר על פלטפורמת הדמיה SLO. ודא כי הקרנית של העכבר פונה ישר לכיוון הראש האופטי של מכונת SLO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מודול ההדמיה. באמצעות תוכנת מודול הדמיה המשויך, לחץ על כפתור &quot;חולה חדש&quot; ולהוסיף פרטים זיהוי בעלי חיים כגון מספר תג אוזן העכבר, תאריך הלידה, אחוז של צבע פלואורסצנטי וסוג התא שכותרתו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקום עצב הראייה של החיה במרכז המסך הדמיה על ידי תמרון מודול הדמיה. באמצעות תוכנת מודול ההדמיה המשויכת, לחץ על הלחצן &#39;רכש&#39; כדי לצלם את תמונות הפונדוס אינפרא אדום (IR) באמצעות הגדרת הזווית של 30 ° או 15 °. ודא כי מרכז הרשתית, את התלמיד ואת הנתיב האופטי של הלייזר מיושרים כדי להשיג את התמונה באיכות הטובה ביותר. <br/&gt; הערה: הנתיב האופטי מיושר על ידי תמרון הג&#39;ויסטיק כדי לקבל את התמונה החדה ביותר ואת החשיפה התאורה הטובה ביותר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הווידאו ICG ICG. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מסנן ה- ICG (790 ננומטר), הגדר את המצלמה למצב מהירות גבוהה עם תצוגת הזווית של 30 ° או 15 ° והגדר את עוצמת ICG ב -85 עבור כל הקריאות עבור סטנדרטיזציה. בלוח הבקרה, לחץ על כפתור &quot;רכש&quot; כדי לקחת את הווידאו (שליטה בסיסית) ב 8.8 / 15 מסגרות / s במשך 1 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 100 μL של ארתרוציטים ICG שכותרתו לתוך מזרק אינסולין המצורפת מחט 30 מד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקת דרך דרך הווריד הזנב, להכניס את המחט שפוע למעלה לתוך הווריד הזנב. אישור גישה תוך ורידי על ידי בדיקת זרימת הדם לתוך המזרק ולהזריק את התאים שכותרתו לתוך השאלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזרקת דרך מסלול רטרו מסלולית, הכנס את המחט הסמוכה העין לתוך רטרו מסלולית spacה. לאשר את הגישה רטרו מסלולית על ידי בדיקת זרימת הדם לתוך המזרק ולהזריק את התאים שכותרתו לתוך השאלה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזריקה, מקם מחדש את העכבר וקח את תמונות ה- IR של ה- IR (ראה שלב 2.1.6.1) וסרטון באמצעות מסנן ה- ICG (ראה שלב 2.1.7.1). תאים שכותרתו במחזור הרשתית ניתן דמיינו מיד לאחר הזרקת התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר רכישת מסגרות וידאו, לחלץ. תמונות Tiff של רצפי וידאו על ידי בחירת פורמט .tiff בעת ייצוא וידאו באמצעות תוכנת מודול צפייה SLO. שמור את הקבצים בתיקייה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את עדשות המגע, הנח אותו מעל העין השנייה, והשלם את ההדמיה כמתואר בשלבים 2.1.4 - 2.1.7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההדמיה, במקום חיה הרדים תחת אור אינפרא אדום (250W) כדי לשמור על טמפרטורת הגוף עד שהוא מתאושש מהרדמה. כאשר החיה הוא התאושש לחלוטין, במקום את העכבר בחזרה לכלוב מחזיק.</li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Live- הדמיה תא של 1% נתרן פלואורסצין שכותרתו לויקוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את העכבר ואת הגדרת המכשיר כמתואר בסעיף 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את העכבר וקחו את תמונות ה- IR של ה- IR כפי שמתואר בשלבים 2.1.4 - 2.1.6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את angiogram פלואורסצין של העכבר באמצעות מסנן פלואורסצין (488 ננומטר) עם מצב מצלמה במהירות גבוהה עם 30 ° או 15 ° זווית תצוגה ועוצמת פלואורצין ב 85 עבור כל הקריאות עבור סטנדרטיזציה. הקלט את הווידאו (בקרת בסיס) ב 8.8 / 15 מסגרות / s (ראה שלב 2.1.7.1). הערה: כאן, רצועות מרובות של קטעי וידאו (1 דקות קטעי וידאו) נרכשו במרווחי זמן שונים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 100 μL שכותרתו leukocytes לתוך העכבר דרך הווריד הזנב או הזרקת מסלול רטרו כמתואר בסעיף 2.1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר ההזרקה, מקמו את העכבר ולקחו את התמונות IR פונדוס (ראה צעדים 2.1.5 ו 2.1.6) ואת פלואResiin angiogram של העכבר (ראה סעיף 2.2.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לתאים שכותרתו ברשתית או בכלי הדם של הצורואידים על ידי התאמת מוקד הלייזר הסורק על ידי סיבוב כפתור המיקוד על מודול ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש את מסגרות וידאו ותמונות באמצעות SLU צפייה מודול תוכנה (ראה שלב 2.1.10) ולשמור אותו בתיקיה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההליך, בצע את שלב 2.1.12 לטיפול בבעלי חיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תמונה על ידי תוכנת MtrackJ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את רצף התמונה ב- ImageJ על ידי לחיצה על &quot;קובץ&quot;. בחר &quot;ייבוא&quot; ובחר &quot;רצף תמונות&quot;, בחר את תיקיית התמונה הרצויה, ולחץ על &quot;פתח&quot;. חלון מוקפץ הנקרא &quot;אפשרויות רצף&quot; יופיע על המסך. לחץ על &quot;אישור&quot;; רצף התמונות ייפתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המרווח מסגרת של וידאו התמונה על ידי לחיצה על &quot;תמונה&quot; ובחר &quot;מאפיינים&quot; עבור מדידות מהירות. הנה, זה 8.8 מסגרתEs / s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוסף MTrackJ על ידי בחירת &quot;Plugins&quot;. בחר &quot;מעקב&quot; ולאחר מכן בחר &quot;MtrackJ&quot;. התפריט אמור להופיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשנות את הגדרות המעקב, בחר &quot;מעקב&quot; (תחת תפריט) וסמן את התיבה &quot;מעבר לאינדקס מסגרת הזמן הבאה לאחר הוספת נקודה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר התא הראשון. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר תא אחד ולעקוב אחר התא אותו במסגרות הבאות. בתפריט לחץ על &quot;הוסף&quot; כדי להוסיף רצועה חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הסמן מעל התמונה (+ הירשם) ולחץ על התא המתאים. הערה: MTrackJ יקפוץ באופן אוטומטי למסגרת הזמן הבאה ומוסיף מעגל קטן, המסמן את המיקום של הנקודה הראשונה במסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ללחוץ על המיקום הנוכחי של התא תוך כדי תנועה דרך המסגרות של רצף התמונה. הערה: לעתים, המעגלים המסמנים את הנקודות הקודמות במסלול מפריעים ליכולת להציג את המיקום הנוכחי. במקרה זה,המשך לשלב 2.3.5.3.1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את האפשרות להציג את המסלול על ידי לחיצה על &quot;תצוגה&quot; בתפריט ובחירה באפשרות &quot;להציג רק לעקוב אחר נקודות בזמן הנוכחי&quot;. כדי לראות את כל המסלולים, בטל בחירה באפשרות זו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ללחוץ עד שיופיע המסלול של התא הראשון. לאחר מכן שמור את המסלול על ידי לחיצה על &quot;שמור&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר התא השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתפריט, לחץ על &quot;הוסף&quot; כדי להתחיל רצועה חדשה. חזור על שלבים 2.3.5.1 - 2.3.5.4 למעקב אחר התא החדש. לחץ על &quot;שמור&quot; כדי לשמור את המסלול השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך שלבים אלה עבור כל התאים הניתנים למעקב נצפו. לאחר מעקב אחר התאים, לחץ על &quot;מדוד&quot; ו &quot;אישור&quot; בכרטיסייה התפריט כדי לקבל את התוצאות. הערה: חלון תוצאות נפתח באופן אוטומטי, אשר ניתן לשמור ולפתוח בגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף. </li></ol></li></ol></li></ol>

למחברים אין מה לגלות. ללא ניגוד עניינים.

לימוד המודינמיקה במחזור הרשתית והקורואידאל חיוני להבנת הפתופיזיולוגיה של מחלות עיניים רבות. זרימת הדם הדינמיקה במחזור הרשתית ניתן ללמוד על ידי טומוגרפיה קוהרנטית אופטית של תחום פורייה (FD-OCT), לייזר speckle flowgraphy (LSFG) ו oximetry רשתית. למרות ששיטות אלה משתמשות בגישות שונות כדי לחקור את זרימת הדם הכוללת במחזור הרשתית 40 , 41 , 42 , 43 ,...

לימוד דינמיקה הזרימה של תאי הדם במחזור הרשתית והקורואידית היא הכרחית להבנת הפתוגנזה של מחלות עיניים אפשריות המסתכנות בראייה ובעיות דלקתיות אחרות. עם זאת, טכניקות אנגיוגרפיה קונבנציונאלי, אשר כרוך מחייב של צבעים פלואורסצנטי חלבונים פלזמה, אינם מספקים כל מידע לגבי הדינמיקה של אריתרוציטים או לויקוציטים 1 . דינמיקה זרימת כדורית הדם החשמלית חשובים לחקר זרימת הדם ביעילות מטבולית ברשתית, ואת הדינמיקה זרימת לויקוציטים, להבנת נדידת תאים, הכרה, הדבקה והרס בתנאים דלקתיים שונים 2 . ישנן מספר מולקולות ניאון המשמשים זיהוי ואפיון של סוגי תאים שונים 3 . המודינמיקה של תאי הדם ניתן למדוד על ידי מכתים אותם עם fluores המתאיםCent צבע ויישום טכניקות הדמיה נאותה 4 . נוכחות של תגובות דלקתיות במחלות תוך עינית כמו ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ו רטינופתיה סוכרתית (DR) כרוך הצטברות של לימפוציטים באזור חולה 5 , 6 . מעקב אחר תאי החיסון ברקמות יכול לעזור להבין את האירועים המורכבים המעורבים במנגנון של מחלה פתוגנזה. איזוטופים רדיואקטיביים כמו 51 Cr ו 125 שימשו כמחקרי תאים במחקרים מוקדמים. צבעים אלה רעילים ומשפיעים על הכדאיות התא. למרות שהסמנים הרדיואקטיביים 3 H ו- 14 C פחות רעילים לתאים, בשל אנרגיית הפליטה התחתונה שלהם, קשה לזהות את האותות שלהם במערכת 7 , 8 . מספר צבעים fluorochrome הוכנסו כדי להתגבר על הבעיות הפוטנציאליות הקשורות wIth סמנים רדיואקטיביים ו לימפוציטים מסלול המעבר במבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי cytometry זרימה 9 , 10 . Hoechst 33342 ו thiazole כתום הם DNA צבע מחייב ניאון, אשר משמשים כדי לעקוב אחר לימפוציטים in vivo. Hoechst 33342 נקשר אזורים עשירים ב- DNA, הוא קרום חדיר, שומרת על אותות ניאון עבור 2 - 4 ימים והוא עמיד מרווה 9 , 10 . החסרונות של Hochcht 33342 וכתום thiazole הם עיכוב של התפשטות לימפוציטים 11 ואת מחצית חיים קצר, בהתאמה 9 . Calcein-AM, פלואורסצין diacetate (FDA), 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxyethyl) -5- (ו- 6) - carboxyfluorescein, אצטוקסימטיל אסתר (BCECF-AM), 5- (ו -6) Carposyfluorescein diacetate (CFDA), ו 5- (ו -6) - carboxyfluorescein אצטט acetoxymethyl diacetate (CFDA-AM)הם הצבעים ניאון cytoplasmic המשמש ללימודי לימפוציטים הגירה. עם זאת, ה- FDA, CFDA ו CFDA-AM יש שמירה נמוכה יותר בתאים 9 . BCECF-AM מפחית את התגובה שגשוג משפיע על chemotaxis ו superoxide ייצור 9 , 12 . Calcein-AM הוא צבע פלואורסצנטי ושימושי לטווח קצר ללימודים לימפוציטים vivo vivo . הוא פולט אותות ניאון חזקים, אינו מפריע לרוב הפונקציות הסלולר ושומר על אותות ניאון עד 3 ימים 12 , 13 . פלואורסצין isothiocyanate (FITC) ו carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA-SE) הם צבעים קוולנטיים צימוד פלואורסצנטי, אשר משמשים ללימודים הגירה לימפוציטים. FITC מציג שום השפעה על הכדאיות התא ויש לו זיקה חזקה עם לימפוציטים B מאשר לימפוציטים 14 , 15 , </suP&gt;. CFDA-SE לימפוציטים שכותרתו ניתן לעקוב אחר in vivo במשך יותר מ 8 שבועות ועד 8 חטיבות תא 9 , 16 . C18 DiI (1,1&#39;-dioctadecyl-3,3,3 &#39;, 3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), DiO (3,3&#39;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate), פול קרל הוראן (PKH) 2, PKH3 ו- PKH26 הם קרום- הוספת צבעי lbophilic carbocyanine lipophilic המשמשים תווית leukocytes ו אריתרוציטים. C18 דיל ו DiO התערוכה אותות גבוהים יותר כאשר שולבו לתוך קרום התא הם יחסית לא רעילים 12 , 17 . PKH2, PKH3 ו PKH26 שכותרתו התאים שמירה טובה של אותות ניאון עם פחות רעילות 18 , 19 , 20 , 21 , 22 . עם זאת, PKH2 למטה מסדיר את הביטוי CD62L ומקטין את ly<html> 23 . רוב המחקרים הנ&quot;ל בוצעו למעקב אחר הגירה הלימפוציטים והתפשטות הלימפה וללמוד את אריתרוציטים שכותרתו במחזור הלא עיני. יש מעט מאוד מחקרים החלים את הטכניקות תיוג ללמוד את תאי הדם במחזור העין. יישום של סריקה לייזר ophthalmoscopy (SLO) יש יתרון גדול בלימוד התאים שכותרתו את זרימת הרשתית ואת choroidal in vivo על ידי אנגיוגרפיה פונדוס 24 . ישנם מספר צבעים פלורסנט, כגון ICG, כתום אקרידין, FITC, פלואורסצין נתרן, CFDA המשמשים ללמוד את הלייקוציטים של זרימת הרשתית על ידי SLO 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 ,Class = &quot;xref&quot;&gt; 31 , 32 , 33 , 34 . Phototoxicity ו מסרטן של כתום acridine 26 , 27 , הפרעה של FITC עם פעילות הסלולר, ואת הדרישה של סוכן ניגוד intravascular לפתרון של כלי הדם ברשתית הרשתית ו choroidal מגביל את היישום שלהם בניסויים בבעלי חיים vivo 29 . נתרן פלואורסצין ICG אינם רעילים, אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות, ובטוח לבדיקות על בני אדם 32 , 35 . רוב הזרימה הדינמית מחקרים קשורים תיוג של leukocytes או אריתרוציטים והדמיה שלה כלי הדם ברשתית הרשתית 36 , 37 , 38 , 39 </sUp&gt;. כאן, אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי של תיוג ICG של אריתרוציטים, תיוג פלואורסצין נתרן של leukocytes, ומעקב אחר תאים שכותרתו דמיינו את זרימת הרשתית העכבר באמצעות SLO.

<table><tbody><tr><td>צבע פולימתין קרדיוגרין (ירוק אינדוציאנין)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>12633-50 מ"ג</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצאין 100 מ"ג/מ"ל</td><td>נוברטיס</td><td>U1705A/H-1330292</td><td></td></tr><tr><td>10x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) אולטרה טהור דרגה</td><td>1 בסיס</td><td>BUF-2040-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוטיינר עם K2E (K2EDTA) - ריכוז EDTA - 1.8 מ"ג/מ"ל דם</td><td>BD, USA</td><td>REF</td><td></td></tr> 365974 <tr><td>תמיסת Histopaque 1077 Sigma</td><td>Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>05-413-401</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td> מערבל מערבולת <td></td></tr><tr><td></td><td>Insta BioAnalytik pte. בע"מ</td><td>FINE VORTEX</td><td></td></tr><tr><td>חממת שייקר</td><td>Lab Tech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ceva הזרקת קטמין (קטמין הידרוכלוריד 100 מ"ג/מ"ל)</td><td>Ceva</td><td>KETALAB03</td><td></td></tr><tr><td>ILIUM XYLAZIL-20 (קסילזין הידרוכלוריד 20 מ"ג/מ"ל)Troy</td> <td>Laboratories PTY. Limited</td><td>LI0605</td><td></td></tr><tr><td>1% Mydriacyl 15 מ"ל (טרופיקמיד 1%)</td><td>אלקון&nbsp; מעבדות בע"מ ארה"ב</td><td>NDC&nbsp; 0998-0355-15</td><td></td></tr><tr><td>2.5% מידפרין 5 מ"ל (פנילפרין הידרוכלוריד 2.5%)</td><td>אלקון&nbsp; מעבדות בע"מ ארה"ב</td><td>NDC&nbsp; 0998-0342-05</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Terumo עם מחט 1 סמ"ק/מ"ל Tuberculin</td><td>Terumo (Philippenes) Corporation, הפיליפינים</td><td>SS-01T2613</td><td></td></tr><tr><td>Vidisic Gel 10 G</td><td>Dr. Gerhard Mann, Chem.-Pharm, Fabrik Gmbh, ברלין, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ספוגיות אלכוהול</td><td>Assure חד פעמי רפואי</td><td>7M-004-L-01</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אנגיוגרפיה לסריקת לייזר קונפוקלית (היידלברג רטינה אנגיוגרף 2)</td><td>היידלברג הנדסה, GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת מודול הצפייה Hiedelberg Spectralis, v4.0</td><td>Heidelberg Engineering, GmbH, היידלברג, גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>ZEISS</td><td>דגם: axio imager z1</td><td></td></tr></tbody></table>

פלואורסצנטי dye תיוג של erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

דינמיקה זרימת הדם של הרשתית והקורואידאלית עשויה לספק תובנה לגבי הפתופיזיולוגיה והשלכות של מחלות עיניים שונות, כגון גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי הקשור לגיל (AMD) ותנועות דלקתיות אחרות. זה עשוי גם לעזור לפקח על התגובות הטיפוליות בעין. התיוג הנכון של תאי הדם, יחד עם הדמיה תא חי של תאים שכותרתו, מאפשר חקירה של דינמיקה הזרימה של הרשתית ואת זרימת הדם הצורואידית. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקולים סטנדרטית של 1.5% indocyanine ירוק (ICG) ו 1% תיוג פלואורסצין נתרן של עכברים אריתרוציטים ו leukocytes, בהתאמה. סריקה לייזר ophthalmoscopy (SLO) הוחל לדמיין את התאים שכותרתו במחזור הרשתית של עכברים C57BL / 6J (סוג בר). שתי השיטות הפגינו תאים שונים שכותרתו fluorescently במחזור הרשתית של העכבר. שיטות תיוג אלה יכולות להיות יישומים רחבים יותר במחלות עיניים שונותמודלים.

Erythrocytes שכותרתו עם ICG 1.5% היו דמיינו את זרימת הרשתית של עכברים C57BL / 6J (סוג בר). הן 1% ו 5% hematocrit של 1.5% ICG שכותרתו אריתרוציטים היו להבדיל במחזור הרשתית. עם זאת, אדם שכותרתו תאים היו בבירור יותר דמיינו עם 1% hematocrit של 1.5% ICG שכותרתו אריתרוציטים ( איור 1 ). ב 5% hematocrit, בשל המספר הגדול של תאים שכותרתו בכלי הרשתית, לא ניתן היה לסמן את התא הפרט. כמה אריתרוסטזיס נצפתה באזור peripapillary בשני התנ...

הדמיה חיה של תאי הדם המסומנים במחזור העין יכולה לספק מידע על דלקת ואיסכמיה ברטינופתיה סוכרתית וניוון מקולרי הקשור לגיל. פרוטוקול לתווית תאי דם ותמונה תאים שכותרתו במחזור הרשתית מתואר.

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להמחיש את סירקולציית תאי הדם ברשתית של עכבר באמצעות אופתלמוסקופ לייזר סורק. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בנוגע למחלות רשתית, כגון מהי הדינמיקה של WBCs ו-RBCs ברצפת הרשתית וכיצד דינמיקת הזרימה שלהם עשויה לתרום לפתוגנזה של המחלה. היתרונות המרכזיים של טכניקה זו הם כי היא יכולה לשקף פנוטיפים שונים של מחלות והיא גם קלה מאוד לביצוע.הליך זה יודגם על ידי חברי הצוות שלנו, Praveen, Bo Bo ו-Neha. כדי לבודד את שכבת תאי הדם של העכבר, יש להניח דם מלא שנאסף לאחרונה מעל תמיסת polysucrose ו-sodium diatrizoate ביחס של 1:1 בתוך מבחנה של שני מיליליטר. לאחר מכן, סבבו את המבחנה בצנטריפוגה למשך 30 דקות.בשלב הבא, שאבו והשליכו את העל-נוזל (supernatant) של הפלזמה. לאחר מכן, אספו בזהירות את שכבת ה-buffy coat, המורכבת מלויקוציטים, ואת השכבה התחתונה של האריתרוציטים לשפופרות נפרדות. לאחר מכן, שטפו את האריתרוציטים ב-1XPBS כדי להסיר מזהמים וסספנדו אותם מחדש בנפח אחד של PBS.לאחר מכן, העבירו מנות של חצי מיליליטר מהסוספנזיה למבחנות מיקרו-צנטריפוזות. סובבו את המנות כדי לשקיע את התוכן, השליכו את הנוזל העליון והוסיפו כ-200 מיקרוליטר של 40%1XPBS לכריתיציטים השקועים. ערבבו אותם היטב.והדגריו אותם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, הוסיפי 100 µL של ICG לכל תרחיף. ערבבי את המבחנות על ידי היפוך ולאחר מכן הדגרי אותם בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.לאחר מכן, הוסיפו 300 µL של 1XPBS והדריגו למשך שעה תחת ערבול עדין בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, סובבו את התשעיות בצנטריפוגה, שמרו את משקע התאים והשעיקו אותם מחדש ב-1 mL של 1XPBS. המשיכו לשטוף את התאים ב-1XPBS עד שהנוזל העליון (supernatant) יהיה צלול.לאחר מזיגת הנוזל העליון, יש להוסיף נפח אחד של 1%BSA ו-PBS כדי להגיע ל-50% hematocrit של כדוריות דם אדומות המסומנות ב-ICG. לאחר מכן, יש לבצע את איסוף שכבת ה-buffy coat. ראשית, שטפו את התאים פעם אחת עם 10 milliliters של 1XPBS כדי להסיר זיהומים כלשהם.סבבו את הדגימות שוב בצנטריפוגה ולאחר מכן השעו את המשקע ב-900 microliters של 1XPBS. לאחר מכן, הוסיפו 100 microliters של sodium fluorescein בריכוז של 10% והדגרו את התאים בטמפרטורת החדר למשך שתי דקות. לסיום, שטפו את הלימפוציטים המסומנים שלוש פעמים עם 10 milliliters של 1XPBS.סנטריפוגו ושחזרו אותם ב-100 µL של 1XPBS. כדי להכין את האריתרוציטים המסומנים ב-ICG להזרקה, דללו תחילה מנה להזרקה עד להמטוקריט של 5% או 1%. הרדימו את העכבר והרחיבו את אישוניו.לאחר מכן, מרחו פומדת עינית בשתי העיניים. הניחו עדשה מגעית על אחת העיניים. כעת, דמיינו את העכבר באמצעות מצלמת SLO קונפוקלית עם עדשה בעלת כוח שבירה חיובי של 25 דיופטר כדי לפצות על שבירת האור של העין.כוון במדויק את הקרנית אל הראש האופטי של מכשיר ה-SLO. לאחר מכן, הפעל את מודול ההדמיה ותמרן אותו עד שהעצב האופטי נמצא במרכז מסך ההדמיה. לאחר מכן, צלם תמומות אינפרא-אדום של קרקעית העין בזווית של 30 מעלות.בשלב הבא צלם וידאו של קרקעית העין באינפרא-אדום. הפעל את מסנן ה-ICG ב-790 ננומטר, הגדר את מצב המצלמה למהירות גבוהה ושמור על זווית צפייה של 15 עד 30 מעלות. לאחר מכן, הגדר את עוצמת ה-ICG ל-85 עבור כל הקריאות.בלוח הבקרה, לחץ על כפתור ה-acquire כדי להקליט סרטון בסיס (baseline) בקצב של 8.8 עד 15 פריימים לשנייה למשך דקה אחת. לאחר מכן, טען 100 µL של אריתרוציטים המסומנים ב-ICG למזרק אינסולין עם מחט במידה 30, והזרק את התאים לווריד הזנב או הזרק אותם באופן רטרו-אורביטלי. מיד לאחר ההזרקה, צלם תמונת קרקית באינפרא-אדום חדשה והקלט סרטון חדש עם מסנן ICG.לאחר השגת הסרטונים, ייצאו אותם בפורמט TIFF לצורך ניתוח תמונות. עבדו את התמונות באמצעות חבילת תוכנת הדימיון הזמינה בחינם, MHJ. לאחר פתיחת הקובץ, הגדירו את מרווח הפריימים של סרטון התמונה למדידות מהירות.לאחר מכן פתחו את התוסף MtrackJ. מהתפריט, בחרו ב-tracking והפעילו את האפשרות למעבר למספר הפריים הבא לאחר הוספת נקודה. כעת אתרו תא רלוונטי ועקבו אחריו בכל פריים.מהתפריט, לחצו על add כדי להוסיף עקבה חדשה ואז לחצו על התא הנבחר. לאחר מכן, המשיכו ללחוץ על המיקום הנוכחי של התא ככל שהתמונות מתקדמות פריים אחרי פריים. לאחר השלמת העקיבה, שנו את אפשרות התצוגה עבור המסלול מתוך אפשרויות התצוגה ובחרו להציג רק את נקודות העקיבה בנקודת הזמן הנוכחית.המשך ללחוץ עד שהמסלול של התא יוצג, ולאחר מכן שמור את העקבה. כעת המשך במעקב אחר התא הבא, החל בפקודת ההוספה (add) ובהמשך כפי שנעשה עם התא הראשון. לאחר מעקב אחר כל התאים הרלוונטיים, פתח את התצוגה של כל מדידות העקבה באמצעות אפשרות המדידה (measure).לאחר מכן, שמרו את הפלט לצורך ניתוח נוסף. אריתרוציטים המסומנים ב-1.5%ICG הודגמו בזרימה הרטינלית של עכברי C57 black 6J באמצעות 1% או 5% hematocrit; התאים היו ניתנים להבחנה, אך בריכוז של 1% hematocrit התאים המסומנים נצפו בקלות רבה יותר. בשני ריכוזי ההזרקה ניתן היה להבחין במידה מסוימת של erythrostasis באזור הפארא-פפילרי, דבר שהיה בולט יותר ב-5% hematocrit.לוקוציטים סומנו ב-1% sodium fluorescein והוצגו כתאים מסומנים בירוק באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. נצפתה התגבשות מסוימת. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע טכניקה זו בתוך שש שעות אם היא מבוצעת כהלכה.בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להרחיב את אישוני העיניים כדי להשיג תמונות וסרטונים איכותיים של הרשתית.

fluorescent-dye-labeling-erythrocytes-leukocytes-for-studying-flow

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מיקרוסקופיה Intravital לעקוב אחרי האירועים hemodynamic ו דלקתיות ומרחב ב microcirculation pial.

מיקרוסקופית Intravital של microcirculation המוח עכבר באמצעות חלון גולגולתי סגור

שיטות הדמיה שפותחו לאחרונה באמצעות פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום (NIRF) עשויות לעזור להבהיר את תפקיד מערכת הלימפה משחקת בהתפשטות גרורה סרטני, תגובה חיסונית, תיקון פצע, ומחלות אחרות הקשורים לימפטי.

דימות אופטי לא פולשנית של כלי דם הלימפה של עכבר

סרטון זה מדגים ציטומטריית זרימה למדידת ספיגת מיקרוגליה של חלקיקים פלואורסצנטיים לאחר מסירה תוך ויטריאלית בעין עכבר. ציטומטריית זרימה מזהה תאים חיים המבטאים CD11b ומבדילה תאי מיקרוגליה פגוציטיים המציגים פלואורסצנטיות ירוקה מתאים מיאלואידים אחרים, כולל מונוציטים המבטאים Ly6C ונויטרופילים המבטאים Ly6G.

מדידת ספיגה מיקרוגליאלית של חלקיקים פלואורסצנטיים המועברים תוך ויטראלית באמצעות ציטומטריית זרימה

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה תוך-חיונית בבעלי חיים כדי להמחיש ולמדוד את קוטר כלי הדם ברשתית, מהירויות זרם הדם וזרימת הדם הכוללת ברשתית.

מדידות מיקרוסקופ וידאו תוך-חיוני של זרימת הדם ברשתית בעכברים

phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

הדמיית in vivo היא כלי רב עוצמה לחקר הביולוגיה בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה מתאר הדמיה טרנס-אימונית של רשתית העכבר באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של שני פוטונים. הוא גם מדגים שיטות שונות של הדמיה חיה כדי לתייג פלואורסצנטיות קבוצות תאים מרובות של הרשתית.

הדמיה טרנס-אימונית של שני פוטונים In vivo של רשתית העכבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת להכנה וצביעה אימונופלואורסצנטית של תושבות שטוחות רשתית של עכברים וניתוח. השימוש באנגיוגרפיה פלואורסצנטית פונדוס (FFA) עבור גורי עכברים ועיבוד תמונה מתוארים בפירוט גם כן.

ניטור צמיחה דינמית של כלי רשתית במודל עכבר רטינופתיה המושרה על ידי חמצן

ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית כדי לחקור אינטראקציות לויקוציטים-אנדותל וזלוף נימי בזמן אמת. פרוטוקול זה מתאר שיטות לדמות ולכמת פרמטרים אלה במיקרו-סירקולציה ריאתית באמצעות מערכת הדמיית ריאות המיוצבת בריק.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית תוך-ורידית של מיקרו-סירקולציה ריאתית בפגיעה חריפה ניסיונית של הריאות באמצעות מערכת הדמיה מיוצבת ואקום

כלי דם ברשתית עכבר מעניינים במיוחד בהבנת המנגנונים של היווצרות תבניות כלי דם. פרוטוקול זה מודד באופן אוטומטי את הקוטר של כלי הדם ברשתית העכבר מתמונות פונדוס אנגיוגרפיה פלואורסצנטית במרחק קבוע מהדיסק האופטי.

מדידת קוטר כלי הדם ברשתית מתמונות אנגיוגרפיה פלואורסצנטית של עכבר

אנו מדגימים שיטה לתיוג דפנות כלי הדם ברשתית ולויקוציטים דביקים. לאחר מכן ניתן לספור את הלויקוציטים הדבקים הללו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כפרמטר לדלקת או לתגובה של דלקת זו לטיפולים.

כימות של לויקוציטים דבקים המושרים על ידי סוכרת בכלי הדם ברשתית

למד תיוג תאי דם באמצעות צבע פלואורסצנטי לחקירת דינמיקת זרימה ברשתית עכבר. שיטה זו מאפשרת לחקור מנגנוני מחלות רשתית כמו רטינופתיה סוכרתית באמצעות מיקרוסקופ לייזר סורק.

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

גלה סרטונים נוספים