תא שלם תיקון מהדק הקלטות עבור קביעת electrophysiological של יון סלקטיביות ב Channelrhodopsins
22 במאי 2017
מאמר זה מתאר כיצד נקבעת סלקטיביות היונים של channelrhodopsin באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים של Patch-Clamp של תאים שלמים באמצעות תאי HEK293. כאן, מודגם ההליך הניסיוני לחקירת סלקטיביות כלוריד של תעלה רודופסין סלקטיבי של אניונים. עם זאת, ההליך ניתן להעברה לתעלות רודופסינים אחרים בעלי סלקטיביות מובחנת.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לקבוע את סלקטיביות הכלוריד של תעלות יונים חדשות עם שער אור. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בביופיזיקה של תעלות רודופסינים כגון אמפליטודות פוטו-זרם, קינטיקה וסלקטיביות יונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא קריאה ישירה של פעילות תעלה ביופיזית מהירה וקלה לשכפול.
בדרך כלל אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש לבצע אופטימיזציה של כל שלב בהליך הניסוי, מהכנת תאי HEK ועד לרישום זרמי פוטו. זריעה והעברה של תאי HEK יודגמו על ידי אלטינה קליין. כדי להתחיל בהליך זה, שקלו את הרכיבים המוצקים עבור 100 מיליליטר של התוך תאי ו -500 מיליליטר של תמיסות המאגר החוץ-תאיות בכוסות נפרדות.
ואז להוסיף את הכמות המתאימה של פתרונות המלאי המוכנים. לאחר מכן הוסיפו מים טהורים במיוחד והתאימו בזהירות את ה-pH באמצעות חומצות ובסיסים. לאחר מכן התאם את האוסמולריות עם גלוקוז ל -290 מיליאוסמול ו -320 מיליאוסמול עבור התמיסות התוך-תאיות והחוץ-תאיות, בהתאמה.
בהליך זה הנח עד שלושה החלקות כיסוי זכוכית מצופות ליזין זו לצד זו בצלחת פטרי בגודל 35 מילימטר. לאחר מכן זרע 1.5 כפול 10 לתאי HEK החמישיים בשני מיליליטר של DMEM סטנדרטי בתוספת 10% FBS ורטינול מיקרומולרי אחד בכל מנה. כדי להעביר את התאים לכל מנה, הכינו תמיסה של שני מיקרוגרם של DNA פלסמיד ב -250 מיקרוליטר DMEM ללא FBS ושישה מיקרוליטר של מגיב טרנספקציה.
לאחר 15 דקות של דגירה, הוסיפו בעדינות את התמיסה לתאים. לפני המדידה, משוך כמה פיפטות תיקון עם התנגדות נמוכה באמצעות מושך מיקרופיפטות ולטש אותן באש. אחסן את הפיפטות בכלי נטול אבק ליום המדידה.
30 דקות לפני ההקלטות, הפעל את כל רכיבי ההתקנה כדי להתחמם לטמפרטורת העבודה. ודא שהמאגרים בטמפרטורת החדר. כדי להתחיל, אטום את תא המדידה בסיליקון כדי למנוע דליפה של המאגר החיצוני.
ואז הנח כיסוי אחדהחלקה לתוך החדר וסגור אותו. מלאו את החדר בזהירות במאגר חוץ-תאי כדי למנוע את ניתוק התאים. אחסן את צלחת הפטרי עם פתקי כיסוי אחרים בחממה לסדרת הניסויים הבאה.
לאחר מכן הנח את תא המדידה מתחת למיקרוסקופ באמצעות המטרה 40X להדמיית תאים. לאחר מכן, הניחו גשר מקדחה מעל אלקטרודת האמבטיה והניחו אותו בתא יחד עם חיישן מפלס הנוזל ויציאת הזלוף של מטפל האמבטיה. החלף את התמיסה החוץ-תאית פעמיים במיליליטר אחד של תמיסה חיצונית טרייה כדי להסיר את מדיום התרבות הנותר ואת התאים המנותקים.
הביאו את התאים למיקוד וחפשו תא שעבר טרנספטקט שצריך לבודד מתאים אחרים. לאחר מכן השתמש בסט מסננים משולש ובאור כתום כדי לרגש ולדמיין את mCherry. לאחר מכן, מלאו את אחת הפיפטות הנמשכות בתמיסה התוך תאית.
והסר את בועות האוויר על ידי היפוך הפיפטה מספר פעמים. לאחר מכן הרכיבו את הפיפטה על מחזיק הפיפטה והפעילו לחץ חיובי כדי למנוע סתימת קצה. אתר את קצה פיפטת התיקון מתחת למיקרוסקופ ונווט אותו קרוב לתא באמצעות המיקרומניפולטור.
בתוך תוכנת רכישת הנתונים התחל את בדיקת הממברנה במצב אמבטיה והחל שלב מתח. בדוק אם התנגדות הפיפטה היא בטווח הרצוי של 1.3 עד 3.0 מגה-אוהם. לאחר מכן אפס את זרמי ההיסט והתאם את פוטנציאל הפיפטה על ידי סיבוב כפתור קיזוז הפיפטה במגבר.
כדי ליצור טלאי בתצורת התא השלם, התקרב לאט לתא עם פיפטת המדבקה מלמעלה ושחרר את הלחץ החיובי ממש לפני שאתה נוגע בתא. לפעמים התצורה המחוברת לתא נוצרת לאחר מכן. לאחר ההתקרבות לתא, שנה את בדיקת הממברנה ממצב אמבטיה למצב תיקון.
פצה את קיבול הפיפטה על ידי סיבוב כפתור פיצוי קיבול הפיפטה כדי לקבל תגובה שטוחה של דופק הבדיקה. העבר את בדיקת הממברנה למצב תא. לאחר מכן קרע את המדבקה מבלי להרוס את האיטום על ידי הפעלת פולסים קצרים של לחץ שלילי או לחץ שלילי בעוצמה הולכת וגוברת כדי לקבל אישור של תא שלם.
התחל קיזוז התנגדות טורית על ידי הגדרת שני הפרמטרים של התא השלם, קיבול התא והתנגדות הסדרה. בלוח פיצוי ההתנגדות הסדרתי הפעל חיזוי ותיקון עד 90%ואז הפעל את מתג קיזוז התא כולו והתאם את הפרמטרים של התא כולו בצורה איטרטיבית כדי לקבל תגובת אטם בדיקה שטוחה באופן אידיאלי. לאחר קביעת תצורת תא שלם, המתן לפחות שתי דקות לפני ההקלטה כדי להבטיח החלפה מספקת של תמיסה תוך-תאית דרך פיפטת התיקון.
הקלט זרמים המושרים על ידי אור בפוטנציאל החזקה שונה. לאחר מכן, החלף את המאגר החוץ-תאי לכלוריד נמוך בתא לפחות חמש פעמים מבלי להרוס את המדבקה ורשום יחס מתח זרם נוסף בריכוז הכלוריד החדש. איור זה מראה שבמהלך ההארה באור ירוק, PsACR1 כולל זרם חולף מהיר אשר דועך במהירות לרמת זרם נייח.
לאחר כיבוי האור, זרמי הפוטו דועכים לאפס תוך אלפיות השנייה. הפחתת ריכוז הכלוריד החוץ-תאי מבטלת לחלוטין זרמי צילום מכוונים כלפי חוץ. החלפת ריכוז הכלוריד החוץ-תאי גורמת לשינוי של פוטנציאל ההיפוך שניתן להסיק מעלילת מתח זרם.
הערכת פוטנציאל ההיפוך ממדידות מרובות מכמתת את השינוי הדרמטי בפוטנציאל ההיפוך הנגרם על ידי השונות של ריכוז הכלוריד החיצוני. באופן מדהים, פוטנציאלי ההיפוך הנמדדים תואמים ישירות לפוטנציאלי נרנסט המחושבים עבור כלוריד, מה שמאשר את סלקטיביות הכלוריד הגבוהה של PsACR1. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של זרמי אור המושרים על ידי אור על תאי HEK המבטאים channelrhodopsin.
לאחר השליטה, ניתן לבצע את כל ההליך תוך ארבעה ימים בעוד שהקלטת זרמי האור אורכת מספר שעות. כהשלמה להליך זה, ניתן לבצע מוטגנזה מכוונת אתר ושיטות ספקטרוסקופיות כדי להבהיר עוד יותר תכונות מבניות ומנגנונים תאיים של תעלותרודופסינים. האפיון וההנדסה המולקולרית של channelrhodopsin סללו את הדרך לחוקרים במדעי המוח לתמרן את הריגוש של נוירונים נבחרים על ידי אור.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מפרט פרוצדורה ניסויית לקביעת הסלקטיביות לכלוריד של channelrhodopsin סלקטיבי לאניונים, באמצעות רישומים אלקטרופיזיולוגיים בשיטת patch-clamp של תא שלם בתאי HEK293. השיטה מספקת תובנות לגבי הביופיזיקה של channelrhodopsins, כולל אמפליטודות וקינטיקה של זרמי פוטו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביופיזיקה
- מדעי המוח
רקע
- Channelrhodopsins הם תעלות יונים המופעלות על ידי אור.
- הבנת הסלקטיביות ליונים היא קריטית ליישומם במדעי המוח.
- טכניקות אלקטרופיזיולוגיות מאפשרות מדידה ישירה של פעילות התעלות.
- תאי HEK293 משמשים בדרך כלל לניסויים מסוג זה.
מטרת המחקר
- לבחון את הסלקטיביות לכלוריד של תעלות יונים חדשות המופעלות על ידי אור.
- לחקור תכונות ביופיזיקליות מרכזיות של channelrhodopsins.
- לספק פרוטוקול ניסיוני הניתן לשחזור עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הקלטות patch-clamp של תא שלם.
- הכנת תאי HEK293.
- הקלטה של זרמי פוטו.
- אופטימיזציה של שלבי הניסוי.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של סלקטיביות לכלוריד ב-channelrhodopsin שנבדק.
- תובנות לגבי אמפליטודות וקינטיקה של זרמי פוטו (photocurrents).
- ביסוס של שיטה מהימנה לחקר של channelrhodopsins.
- יכולת העברה של הפרוצדורה ל-channelrhodopsins אחרים.
מסקנות
- השיטה קובעת ביעילות את הסלקטיביות היונית ב-channelrhodopsins.
- נהלים שעברו אופטימיזציה משפרים את ההדירות במחקרים אלקטרופיזיולוגיים.
- מחקר זה תורם להבנת תעלות יונים המופעלות על ידי אור.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
קביעה אלקטרופיזיולוגית של סלקטיביות יונים ב-channelrhodopsins היא קריטית להפחתת סיכונים בשלבים מוקדמים של פיתוח כלים אופטוגנטיים ולאישוש היפותזות מכניסטיות בנוירוביולוגיה. הקלטות patch-clamp כמותיות מספקות ראיות ישירות וניתנות לשחזור לתפקוד התעלות, ובכך תומכות בביטחון ניבוי באישור המטרה ומאפשרות סינון מושכל של פורטפוליו עבור מודולטורים של תעלות יונים. סבב עבודה זה מהווה בסיס לרציפות תרגומית משלב הגילוי ועד לאופטימיזציה של כלים פרה-קליניים במדעי המוח ובתחומים טיפוליים קשורים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מכמת באופן ישיר את הסלקטיביות ליונים ואת תפקוד התעלה, ובכך מבהיר היפותזות מכניסטיות.
- מאפשר תיקוף תפקודי של channelrhodopsins מהונדסים או חדשים במערכות הטרולוגיות.
- תומך בביטחון ניבוי לצורך פיתוח כלים או טיפולים בהמשך.
- מקל על מיון הפורטפוליו על ידי הבחנה בין מועמדים בעלי סלקטיביות גבוהה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס בדיקות אלקטרופיזיולוגיות מתוקתקות וניתנות לשחזור לאפיון של תעלות יונים.
- מספק מדידות כמותיות של יחסי זרם-מתח ופוטנציאל היפוך.
- מאפשר סטנדרטיזציה של תהליכי סריקה לתעלות המופעלות באור.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה להערכת וריאנטים מהונדסים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתוני סלקטיביות יונית in vitro לאסטרטגיות של מודולציה נוירונלית הרלוונטיות למחלה.
- מבטיחה רציפות משלב התיקוף של שלב הגילוי להערכת כלים אופטוגנטיים פרה-קליניים.
- מפחיתה עמימות מנגנונית ביישומים של נוירוביולוגיה תרגומית.
- תומכת בקידום מותאם-סיכונים של התערבויות מבוססות channelrhodopsin.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים לזיהוי המולקולות המובילות (lead identification), ומספקת בסיס להפחתת סיכונים מכניסטיים ולהכנת בדיקות (assay readiness) בפיתוח כלים אופטוגנטיים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת השערות לגבי סלקטיביות יונית ותפקוד תעלות במבנים מהונדסים.
- סריקה: מספקת פלטים אלקטרופיזיולוגיים כמותיים וניתנים לשחזור לצורך השוואת מועמדים.
- אנליטיקה: מספקת גרפי זרם-מתח ונתוני פוטנציאל היפוך לתמיכה בניתוח סטטיסטי של הסלקטיביות.
- מחקר טרנסלציונלי: מגשרת בין תיקוף in vitro לאופטימיזציה של כלים פרה-קליניים במערכות נוירונליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת תהליך עבודה סטנדרטי שניתן להתאימו לווריאנטים חדשים של channelrhodopsin ולתעלות יוניות קשורות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של תעלות יונים.
- ערך תפעולי: מקדם סטנדרטיזציה, שחזוריות ויכולת הרחבה של בדיקות אלקטרופיזיולוגיות.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון בקווי פיתוח של כלים אופטוגנטיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים ל-channelrhodopsin בעלי סלקטיביות גבוהה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של patch-clamp electrophysiology ותרביות תאים.
- דורש גישה למקורות אור מדויקים, מגברים ותוכנות ניתוח.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לתנאי הבדיקה ולניתוח הנתונים.
- ניתן להתאמה למבני channelrhodopsin שונים ומערכות ביטוי הטרולוגיות.
- תלוי באופטימיזציה של שלבי ההכנה וההקלטה לצורך הדירות (reproducibility).
