Name: כוח מיקרוסקופי אטומי חקירות של דלקת הנגע הכרה תיקון כריתה נוקליאוטידים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: חקור מנגנוני תיקון DNA באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי לזיהוי נזקי נוקליאוטידים. השיטה מאפשרת הדמיה ישירה של אינטראקציות חלבון-DNA ברמת מולקולה בודדת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

PUC19N, oligonucleotides המכיל CPD, ו- p44 סופקו בחביבות על ידי סמואל וילסון, Korbinian Heil ותומאס קארל, ואת Gudrun Michels ו Caroline Kisker, בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 ו TE-671/4 ל- IT.

<ol><li>Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+machines+of+DNA+repair%3A+scanning+force+microscopy+analysis+of+their+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture.</a> J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+bending+and+unbending+by+MutS+govern+mismatch+recognition+and+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">DNA bending and unbending by MutS govern mismatch recognition and specificity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14822-14827 (2003).</li>
<li>Tessmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+MutS+searching+for+DNA+mismatches+and+signaling+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of MutS searching for DNA mismatches and signaling repair.</a> J. Biol. Chem. 283 (52), 36646-36654 (2008).</li>
<li>Wagner, K., Moolenaar, G., van Noort, J., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+reveals+two+separate+DNA-binding+domains+in+the+Escherichia+coli+UvrA+dimer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis reveals two separate DNA-binding domains in the Escherichia coli UvrA dimer.</a> Nucleic Acids Res. 37 (6), 1962-1972 (2009).</li>
<li>Buechner, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strand-specific+recognition+of+DNA+damages+by+XPD+provides+insights+into+nucleotide+excision+repair+substrate+versatility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Strand-specific recognition of DNA damages by XPD provides insights into nucleotide excision repair substrate versatility.</a> J Biol. Chem. 289 (6), 3613-3624 (2014).</li>
<li>Van der Linden, E., Sanchez, H., Kinoshita, E., Kanaar, R., Wyman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD50+and+NBS1+form+a+stable+complex+functional+in+DNA+binding+and+tethering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RAD50 and NBS1 form a stable complex functional in DNA binding and tethering.</a> Nucleic Acids Res. 37 (5), 1580-1588 (2009).</li>
<li>Fuentes-Perez, M. E., Dillingham, M., Moreno-Herrero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AFM+volumetric+methods+for+the+characterization+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">AFM volumetric methods for the characterization of proteins and nucleic acids.</a> Methods. 60, 113-121 (2013).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+binding+of+single-stranded+DNA-binding+protein+to+its+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target.</a> Biochemistry. 51, 1500-1509 (2012).</li>
<li>Wirth, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+and+Divergence+in+Nucleotide+Excision+Repair+Lesion+Recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conservation and Divergence in Nucleotide Excision Repair Lesion Recognition.</a> J. Biol. Chem. 291 (36), 18932-18946 (2016).</li>
<li>Kuper, J., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damage+recognition+in+nucleotide+excision+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Damage recognition in nucleotide excision DNA repair.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 22, 88-93 (2012).</li>
<li>Buechner, C. N., Tessmer, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+substrate+preparation+for+atomic+force+microscopy+studies+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Recognit%22%5BJournal%5D)">DNA substrate preparation for atomic force microscopy studies of protein-DNA interactions.</a> J. Mol. Recognit. 26 (12), 605-617 (2013).</li>
<li>Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+RecG+Helicase+at+the+DNA+Replication+Fork+by+SSB+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein.</a> Sci. Rep. 5, 9625(2015).</li>
<li>Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Crampton, N., Kirkham, J., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+DNA+transcription+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of DNA transcription using atomic force microscopy.</a> Phys. Biol. 9 (2), 021001(2012).</li>
<li>Maurer, S., Fritz, J., Muskhelishvili, G., Travers, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+polymerase+and+an+activator+form+discrete+subcomplexes+in+a+transcription+initiation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">RNA polymerase and an activator form discrete subcomplexes in a transcription initiation complex.</a> EMBO J. 25 (16), 3784-3790 (2006).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. 1, 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).</li>
<li>Theis, K., Chen, P. J., Skorvaga, M., Van Houten, B., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+UvrB%2C+a+DNA+helicase+adapted+for+nucleotide+excision+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of UvrB, a DNA helicase adapted for nucleotide excision repair.</a> EMBO J. 18 (24), 6899-6907 (1999).</li>
<li>Kuper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+TFIIH%2C+XPD+helicase+is+exclusively+devoted+to+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">In TFIIH, XPD helicase is exclusively devoted to DNA repair.</a> PLoS Biol. 12 (9), e1001954(2014).</li>
<li>Shlyakhtenko, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silatrane-based+surface+chemistry+for+immobilization+of+DNA%2C+protein-DNA+complexes+and+other+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Silatrane-based surface chemistry for immobilization of DNA, protein-DNA complexes and other biological materials.</a> Ultramicroscopy. 97, 279-287 (2003).</li>
<li>Roth, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XPB+helicase+regulates+DNA+incision+by+the+Thermoplasma+acidophilum+endonuclease+Bax1%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">XPB helicase regulates DNA incision by the Thermoplasma acidophilum endonuclease Bax1.</a> DNA Repair. 11 (3), 286-293 (2012).</li>
<li>Ratcliff, G. C., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Single-Molecule+Study+to+Determine+Protein-Protein+Association+Constants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A Novel Single-Molecule Study to Determine Protein-Protein Association Constants.</a> J. Am. Chem. Soc. 123 (24), 5632-5635 (2001).</li>
<li>Yang, Y., Sass, L. E., Du, C., Hsieh, P., Erie, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+protein-DNA+binding+constants+and+specificities+from+statistical+analyses+of+single+molecules%3A+MutS-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of protein-DNA binding constants and specificities from statistical analyses of single molecules: MutS-DNA interactions.</a> Nucleic Acids Res. 33 (13), 4322-4334 (2005).</li>
<li>Caron, P. R., Grossman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+a+cryptic+ATPase+activity+of+UvrB+and+its+proteolysis+product%2C+UvrB%2A+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of a cryptic ATPase activity of UvrB and its proteolysis product, UvrB* in DNA repair.</a> Nucleic Acids Res. 16 (22), 10891-10902 (1988).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UvrB+domain+4%2C+an+autoinhibitory+gate+for+regulation+of+DNA+binding+and+ATPase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">UvrB domain 4, an autoinhibitory gate for regulation of DNA binding and ATPase activity.</a> J. Biol. Chem. 281 (22), 15227-15237 (2006).</li>
<li>Chammas, O., Billingsley, D. J., Bonass, W. A., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+loops+as+fiducial+markers+for+exploring+DNA-protein+interactions+in+single+molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA loops as fiducial markers for exploring DNA-protein interactions in single molecule imaging.</a> Methods. 60 (2), 122-130 (2013).</li>
<li>Truglio, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+DNA+recognition+and+processing+by+UvrB%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for DNA recognition and processing by UvrB.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 13 (4), 360-364 (2006).</li>
<li>Kuper, J., Wolski, S. C., Michels, G., Kisker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+studies+of+the+nucleotide+excision+repair+helicase+XPD+suggest+a+polarity+for+DNA+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Functional and structural studies of the nucleotide excision repair helicase XPD suggest a polarity for DNA translocation.</a> EMBO J. 31 (2), 494-502 (2012).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+two+UvrB+subunits+in+the+UvrAB+complex+ensures+damage+detection+in+both+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The presence of two UvrB subunits in the UvrAB complex ensures damage detection in both DNA strands.</a> EMBO J. 21 (15), 4196-4205 (2002).</li>
<li>Verhoeven, E. E., Wyman, C., Moolenaar, G. F., Hoeijmakers, J. H., Goosen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+nucleotide+excision+repair+complexes%3A+DNA+is+wrapped+by+UvrB+before+and+after+damage+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Architecture of nucleotide excision repair complexes: DNA is wrapped by UvrB before and after damage recognition.</a> EMBO J. 20 (3), 601-611 (2001).</li>
<li>Moolenaar, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+ATP+Binding+and+Hydrolysis+by+UvrB+during+Nucleotide+Excision+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The Role of ATP Binding and Hydrolysis by UvrB during Nucleotide Excision Repair.</a> J. Biol. Chem. 275, 8044-8050 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ניתוח סטטיסטי AFM של עמדות מחייב של חלבונים על שברי דנ&quot;א ארוכים המכילים אתרים ספציפיים היעד יכול לחשוף פרטים מעניינים על אסטרטגיות מסוימות המשמשים את החלבון לזהות אתרים אלה 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . כדי לפרש את הפצות המיקום וכתוצאה מכך, את המיקום של המטרות ב- DNA צריך להיות מוכר במדויק. זו מושגת על ידי הצגת אתרים ספציפיי...

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא טכניקה רבת עוצמה לניתוח אינטראקציות DNA-חלבון 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . זה דורש רק כמויות נמוכות של חומר המדגם ישירות לדמיין דוגמאות הטרוגניות עם רזולוציה ברמת מולקולה אחת. ההטרוגניות יכולה לנבוע ממצבים קונפורמיים או אוליגומריים שונים של חלבון. בפרט, בהקשר של דגימות DNA חלבון, מתחמי חלבון יכול להציג stoichiometries שונים ו / או קונפורמיות המושרה על ידי DNA מחייב בכלל או מחייב לאתר יעד מסוים בתוך DNA. דגימות הטרוגניות עשויות להכיל גם שני סוגי חלבונים שונים (או יותר), וחלבונים שונים( למשל , המורכבת מסוג אחד בלבד של חלבון לעומת קומפלקסים heteromeric) עשויים לתקשר באופן שונה עם DNA. מחקרים שנדונו כאן לנצל AFM הדמיה באוויר על דגימות סטטי, מיובש של חלבונים לתקן דנ&quot;א כרוך ארוך (~ 900 זוגות, bp) שברי DNA המכילים נגע, המייצג יעד של חלבונים אלה. רזולוציה גבוהה, מולקולרית של AFM מאפשר את ההבחנה בין סוגים שונים של קומפלקסים חלבונים כדי לקבוע את עמדות מחייב של חלבונים על שברי דנ&quot;א. חשוב לציין, נגעים הם הציגו לתוך מצעים דנ&quot;א בעמדות מוגדרים היטב. מכיוון שמיקומו של אתר הנגע בדנ&quot;א ידוע, התפלגות החלבונים הכרוכים בדנ&quot;א מספקת תובנה למאפייני ההזיה השונים (השונים) של מכלולי החלבון (השונים), למשל , עד כמה הם מזהים סוג מסוים של נגע (בהשוואה כדי DNA פגום) 2 , 3 , <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 4 , 5 , 6 . עמדותיהם על הדנ&quot;א גם מאפשרות את ההבחנה בין מתחמי חלבון הקשורים ספציפית לנגעים ולמתחמים שאינם קשורים באופן ספציפי למקום אחר בדנ&quot;א. אפיון נפרד של סוגים מורכבים אלה שונים (מתחמים קשורה במיוחד הנגע לעומת קומפלקסים שאינם ספציפיים) יכול לחשוף שינויים קונפורמציה פוטנציאליים במתחמים הנגרמת על זיהוי האתר היעד. חלבונים התיקון DNA התמקדו כאן הם helicases כי הם אחראים להכרה נגע תיקון נוקליאוטיד תיקון כריתה (NER) מסלול. בחיידקים, NER מושגת על ידי חלבונים UvrA, UvrB, ו UvrC. UvrA אחראי על חישה ראשונית של הנגע במכלול UvaA 2 / UvrB 2 . עם אימות הנגע על ידי UvrB זה מורכב ממיר מונומריק UvrB כבול באתר הנגע זה מורכבים ספציפיים יכולים ואז לגייס את pNR. UvrC מכסה טווח קצר (12-13 nt) של DNA בודד תקוע (ssDNA) המכיל את הנגע. החסר החסר הוא מילא לאחר מכן על ידי פולימראז DNA. לבסוף, ה- DNA ligase חותמת את המסור החדש מסונתז עם המקורי DNA 9 , 10 . ב eukaryotes, רוב החלבונים של מפל NER הם חלק גדול, multimeric גורם שעתוק II H (TFIIH) מורכבת. לאחר הנגע הראשונית חישה באמצעות trimeric CEN2-XPC-HR23B מורכבים, TFIIH הוא גויס לאתר היעד DNA. כאשר XPD בתוך המתחם מאמת את נוכחותו של נגע מטרה NER, האנדוקלאס NER האיקריאטי NG ו XPF הם גויסו לבלו קצר (24-32 nt) מתיחה של ssDNA המכיל את הנגע 9 , 10 . כאן, במיוחד, את helicases UvrB ו XPD מ prokaryotic ו eukaryotic NER, בהתאמה, נחקרו. אלה helicases דורשים unaired באזורDNA (בועת דנ&quot;א) על חוט אחד של שני גדילי דנ&quot;א יחיד ולאחר מכן לתרגם לאורך זה גדיל מונעת על ידי הידרוליזה ATP. בנוסף נגעים דנ&quot;א, בועה דנ&quot;א היה ולכן הציג את המצעים המתפקדים כמו טעינת האתר עבור החלבונים. ההליך להכנת מצע DNA ספציפי מצעים תוארה בעבר 11 . זה דורש מבנה דנ&quot;א עגול (פלסמיד) עם שני אתרי הגבלה מקרוב מרווחים עבור nickase. בהקשר של מחקר זה, נעשה שימוש ב- pUC19N (2729 bp) פלסמיד (שנוצר על ידי המעבדה של ס &#39;וילסון, NIEHS). זה פלסמיד מכיל שלושה אתרי הגבלה מקרוב עבור ntase Nbase כי מסגרת 48 נוקלאוטיד (nt) למתוח. לאחר הדגירה עם nickase, את המתיחה של ssDNA בין האתרים האלה ניתן להסיר והוחלף על ידי oligonucleotide המכיל כל תכונה היעד. לאחר כל צעד, עיכול אנזימטי מלא נבדק באמצעות ג&#39;ל agaroseאלקטרופורזה. DNA מעוגל DNA ניתן להבחין בשל הניידות האלקטרופורטית נמוכה יותר לעומת פלסמיד המקורי supercoiled. Gapping של הדנ&quot;א והחלפת מתיחה להסיר על ידי oligonucleotide המצע הספציפיים ניתן להעריך באמצעות עיכול עם אנזים הגבלה אשר חותך את המצע באופן בלעדי באזור בין nicks. לינאריזציה של פלסמיד מעגלי על ידי האנזים ולכן יהיה מדוכא עבור ה- DNA gapped ומשוחזר לאחר החדרת oligonucleotide ספציפיים. לבסוף, שני אתרי הגבלת endonuclease (אידיאלי חותכי יחיד) לאפשר את הדור של מצע דנ&quot;א ליניארי, עם אורך כנדרש ועם אתר היעד הספציפי במיקום מוגדר, כמו גם בועת דנ&quot;א במרחק מן הנגע או 5 &#39;או&#39; 3 &#39;. הכרה של lesions על ידי nlic helicases ניתן לחקור באמצעות הדמיה AFM. טרנספוקציה דנ&quot;א נתקע של helicases ב tהוא אתר lesion גלוי כמו שיא בחלבון הפצה מיקום על הדנ&quot;א ומצביע על זיהוי הנגע. מאחר שהטרנספוקציה של דנ&quot;א של הליקזים אלה היא גם כיוונית, עם קוטביות של 5&#39;עד 3, התלות של זיהוי הנגע על המיקום של אתר הטעינה (בועת ה- DNA במעלה הזרם או במורד הזרם מן הנגע) גם מציינת אם הנגע מוכר באופן מועדף על transocated או על ההפך, לא transocated ssDNA strand 5 , 9 . בסעיפים הבאים, השיטות שיושמו יובאו, וממצאים מרכזיים מניסויים אלה יידונו בקצרה. חשוב לציין, מקביל לעבודה המופתית על תיקון דנ&quot;א המוצג כאן, הדמיה AFM ניתן ליישם את המחקר של מערכות שונות אינטראקציה DNA, כגון שכפול דנ&quot;א או שעתוק 8 , 12 , 13 , 14 </22pl

<table><tbody><tr><td>בדיקת כוח מולקולרית (MFP) מחקר מקלט תלת מימד</td><td></td><td>N/A</td><td>מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)</td></tr> <tr><td>Precision 390</td><td>DELL</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>מחשב ThermoMixer ובלוק 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>בלוק חום להכנת DNA</td></tr><tr><td>Rotilabo Block-Heater H 250 & בלוקים לצינורות 0.5 מ"ל</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>Y264.1 & Y267.1</td><td>בלוק חום לדגירת חלבון-DNA</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td></td><td>תא אלקטרופורזה 1704467 עם גלגלת ג'ל וספק כוח</td></tr><tr><td>Power Pac Basic</td><td>Bio-Rad Laboratories GmbH</td><td>1645050</td><td>ספק כוח אלקטרופורזה</td>Centifuge</tr><tr><td>5415 D עם רוטור</td><td>Eppendorf</td><td>2262120-3</td><td>צנטריפוגה שולחנית</td></tr><tr><td>Ultra-Lum אלקטרונית UV transillumonator MEB-15</td><td>Ultralum</td><td>900-1322-02</td><td>שולחן קרינת UV</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH</td><td>N/A</td><td>UV ספקטרופוטומטר</td></tr><tr><td>TKAX-CAD עם 0.2 &mu; מסנן קפסולה m</td><td>Unity Lab Services</td><td>N/A</td><td>יחידת דה-יוניזציה ומסנן מים</td></tr> <tr><td>שם</strong<></td><td>strong>חברה</td><td>מספר קטלוגי</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MFP תוכנה בתוכנת Igor Pro</td><td>Asylum Research</td><td>N/A</td><td>AFM תוכנה</td></tr><tr><td>ImageJ (עיבוד תמונה Java בקוד פתוח)</td> <td>NIH Image</td><td>N/A</td><td>תוכנה לניתוח תמונות</td></tr><tr><td>Excel (Microsoft Office)</td> <td>Microsoft Corporation</td><td>N/A</td><td>תוכנת ניתוח נתונים</td></tr><tr><td>Origin9 / Origin2016</td><td>OriginLab Corporation</td><td>N/A</td><td>תוכנת ניתוח נתונים סטטיסטיים וגרפים</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>מספר קטלוגי</td><td>הערות</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMCL-AC240TS</td><td>Olympus</td><td>OMCL-AC240TS</td><td>AFM ctellevers</td></tr><tr><td>כיתה V-5 מוסקוביט</td><td>SPI אספקה</td><td>1805</td><td>גיליונות נציץ</td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 מ"ל 50k Ultracell</td><td>Millipore אירלנד בע"מ</td><td>UFC505096</td><td>מסנני צנטריפוגות</td></tr><tr><td>NucleoSpin Extract II&nbsp;</td><td>&nbsp; Macherey-Nagel GmbH</td><td>740 609.250</td><td>ערכת מיצוי ג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>נייר תאית Rotilabo סוג 111A</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>AP59.1</td><td>נייר תצהיר AFM</td></tr><tr><td>Anatop 25 (0.02 &mu; m)</td> <td>Whatman GmbH</td><td>6809-2102</td><td>מסנן מזרק</td></tr><tr><td>SSpI, BspQI</td><td>New England Biolabs (NEB)</td> <td>R0132, R0712</td><td>אנזימי הגבלה להכנת מצע DNA</td></tr><tr><td>XhoI, BglII</td><td></td><td>R0146, R0144</td><td>אנזימי הגבלה להכנת DNA בקרות</td></tr><tr><td>אנזים הגבלת ניקינג, Nt.BstNBI</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס (NEB)</td><td>R0607</td><td>ניקאז</td></tr><tr><td>T4 DNA ליגאז</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס (NEB)</td><td>M0202S</td><td>ליגאז</td></tr><tr><td>טריס, HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855, 9105</td><td>כימיקלים חוצץ</td></tr><tr><td>NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3957, HN03, HN02, P026</td><td>כימיקלים מלח</td></tr><tr><td>NaAc</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH</td><td>32318</td><td>כימיקלים</td></tr><tr><td>מלח DTT, TCEP, EDTA</td><td></td><td>6908, HN95, 8040</td><td>כימיקלים/ ריאגנטים</td></tr><tr><td>אגרוז, חומצה אצטית, HCl</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>2267, 3738, K025</td><td>ריאגנטים</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>K054</td><td>נוקלאוטידים</td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטיד #1 בטבלה 1</td><td>Biomers</td><td>מותאם אישית</td><td>DNA משלים אוליגונוקלאוטידים אוליגונוקלאוטידים</td></tr><tr><td>#2, #3 ו-#6 בטבלה 1</td><td>טכנולוגיות DNA משולבות (IDT)</td><td></td> <td>פלואורסצאין מותאם אישית המכיל אוליגונוקלאוטידים</td></tr><tr><td>אוליגונוקלאוטידים #4&nbsp; ו-#5 בטבלה 1</td><td>פרטי (זמין למשל מ-TriLink או GlenResearch)</td><td></td> <td>CPD המכיל אוליגונוקלאוטידים</td></tr><tr><td>צינור תגובה SafeSeal 0.5 מ"ל ו-1.5 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72.704 ו-72.706</td><td>צינורות דגירה</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>סולם DNA</td></tr><tr><td>6x טעינת ג'ל מרוכז צבע סגול</td><td>חדש אנגליה Biolabs (NEB)</td><td>51406</td><td>צבע טעינת DNA</td></tr><tr><td>Midori Green&nbsp;</td><td>Nippon Genetics Europe GmbH</td><td>999MG28055</td><td>כתם DNA</td></tr></tbody></table>

כוח מיקרוסקופי אטומי חקירות של דלקת הנגע הכרה תיקון כריתה נוקליאוטידים

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

הדמיית AFM היא טכניקה רבת עוצמה לחקר אינטראקציות חלבון-DNA. שיטת מולקולה בודדת זו מאפשרת רזולוציה בו זמנית של מולקולות ומכלולים מולקולריים שונים בדגימה הטרוגנית. בהקשר הספציפי של מערכות חלבון המקיימות אינטראקציה עם DNA, ניתן להבחין בצורות שונות של קומפלקס חלבונים ומיקומי הקישור המתאימים שלהן באתרי יעד המכילים שברי DNA. כאן, מוצג יישום של AFM לחקר זיהוי נגעי DNA במערכות תיקון DNA של כריתת נוקלאוטידים פרוקריוטית ואאוקריוטית (NER). מתוארים ההליכים של הכנת דגימות DNA וחלבון וניתנים פרטים ניסיוניים כמו גם אנליטיים של הניסויים. הנתונים מאפשרים מסקנות חשובות לגבי האסטרטגיות שבאמצעותן ניתן להשיג אימות אתר יעד על ידי חלבוני ה-NER. מעניין לציין שהם מצביעים על גישות שונות לזיהוי וזיהוי נגעים עבור מערכת ה-NER האיקריוטית, בהתאם לסוג הנגע. יתר על כן, תכונות מבניות מובהקות של שני ההליקזים השונים המעורבים ב-NER פרוקריוטי ואאוקריוטי מביאות ומסבירות את האסטרטגיות השונות שנצפו עבור שתי מערכות אלה. חשוב לציין, ניתן ליישם גישות ניסיוניות ואנליטיות אלה לא רק לחקר תיקון ה-DNA, אלא גם באופן דומה מאוד למערכות חלבון אחרות הפועלות באינטראקציה עם DNA כגון אלה המעורבות בתהליכי שכפול או שעתוק.

הבחנה בין סוגים מורכבים שונים המבוססים על כמויות מורכבות של חלבון פעילות helicase של NER helicase prokaryotic UvrB הוא מגורה על ידי DNA מחייב 22 , 23 . UvrB דורש אזור לא מזוהה בדנ&quot;א (בועת דנ&quot;א) כדי לטעון נכונה על אחד משני גדילי ssDNA יחיד. ב vivo , מבנה ה- DNA הזה מסופק על י...

כאן, המחקר של גישות שונות לזיהוי נגעי DNA באמצעות הדמיית AFM של מולקולה בודדת מודגם עם מערכת תיקון כריתת נוקלאוטידים כדוגמה. מתוארים ההליכים של הכנת דגימות DNA וחלבון ופרטים ניסיוניים כמו גם אנליטיים עבור ניסויי AFM.

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

המטרה הכוללת של ניסוי מיקרוסקופ כוח אטומי זה היא לפתור אינטראקציות של חלבוני תיקון DNA עם אתרי נזק ב-DNA ולהבחין בין אינטראקציות DNA שונות על ידי קומפלקסים שונים של חלבונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA, כגון כיצד מערכת תיקון DNA מסוימת משיגה את הזיהוי של נגעי המטרה שלה ב-DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שאנו יכולים לראות ולנתח ישירות את סוגי המתחמים השונים המעורבים בתהליך זיהוי נגעי ה- DNA.מי שידגים את ההליך יהיה ניקולס ווירת', שהשתמש בגישה זו במהלך מחקר התואר הראשון שלו. כדי להתחיל, הכינו מצע DNA מתאים על ידי יצירת פער DNA חד-גדילי בפלסמיד. מלא מחדש את הפער באוליגונוקלאוטידים של DNA חד-גדילי שונה, ולבסוף, ליניאריזציה של ה-DNA של הפלזמה באמצעות אנזימי הגבלה מתאימים.עבור ניסויים אלה, מצעי ה-DNA הדו-גדיליים הם באורך של כ-1,000 זוגות בסיסים ומכילים נגע DNA וכן אזור לא מזווג הנקרא בועת DNA להעמסת חלבון על ה-DNA. לאחר מכן, הכינו דגימת DNA של חלבון לניתוח AFM על ידי פיפטינג ראשון של מאגר תגובה פי 10 ומים לתוך צינור מיקרו-תגובה. לאחר מכן, הוסף את ה-DNA והחלבונים הנחקרים.לדוגמה, כאן, 100 ננו-מולרית של דגימת ה-DNA ומיקרו-מולרית אחת או כל אחד מחלבוני תיקון כריתת הנוקלאוטידים האוקריוטיים XPD ו-p44. לאחר מכן, דגרו על התגובה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלו

atomic-force-microscopy-investigations-dna-lesion-recognition

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

אנו מתארים את שיטת מדידה כמותית בזמן אמת, של ה-DNA glycosylase ופעילויות איי פי endonuclease ב lysates גרעיני התא. Assay מניב שיעורי פעילות תיקון דנ"א מקובל ניתוח הקינטית ניתנת להתאמה עבור כימות של פעילות ה-DNA תיקון רקמות lysates הגידול או עם חלבונים מטוהרים.

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות ללמוד אינטראקציות חלבון-חלבון וקינטיקה ב DNA נגעים מתקדמות

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית לזיהוי יעיל של תאי S-phase למחקרי מיקרוסקופיה במורד הזרם, כגון מדידת גיוס חלבונים לתיקון דנ"א באמצעות הקרנת מיקרו-קרינה בלייזר.

הקרנת מיקרו לייזר לחקר גיוס DNA במהלך שלב S

עבודה זו מציגה שיטה פשוטה וחזותית לזהות פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולצית אגל פנאומטי. עם השיטה המוצעת, הניסוי כולו, כולל מניפולציה אגל וזיהוי של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד, יכול להתבצע ליד 23 מעלות צלזיוס ללא סיוע של מכשירים מתקדמים.

החזותי איתור מדד-צבע של פולימורפיזם רב-נוקלאוטיד על פלטפורמת מניפולציה אגל פניאומטיים

Drosophila oogenesis ממשיכה להיות שימושית במיוחד בחקר התפשטות מיטוכונדריאלית ותורשה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט המשמש לתיוג ה-DNA המיטוכונדריאלי המשכפל (mtDNA) בשחלות בוגרות של דרוזופילה עם 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), המאפשר לחשוף מנגנונים הקשורים לתורשה מיטוכונדריאלית שהיו שנויים במחלוקת בעבר.

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

חקור מנגנוני תיקון DNA באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי לזיהוי נזקי נוקליאוטידים. השיטה מאפשרת הדמיה ישירה של אינטראקציות חלבון-DNA ברמת מולקולה בודדת.

כוח מיקרוסקופי אטומי חקירות של דלקת הנגע הכרה תיקון כריתה נוקליאוטידים

גלה סרטונים נוספים