כוח מיקרוסקופי אטומי חקירות של דלקת הנגע הכרה תיקון כריתה נוקליאוטידים

המטרה הכוללת של ניסוי מיקרוסקופ כוח אטומי זה היא לפתור אינטראקציות של חלבוני תיקון DNA עם אתרי נזק ב-DNA ולהבחין בין אינטראקציות DNA שונות על ידי קומפלקסים שונים של חלבונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA, כגון כיצד מערכת תיקון DNA מסוימת משיגה את הזיהוי של נגעי המטרה שלה ב-DNA. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שאנו יכולים לראות ולנתח ישירות את סוגי המתחמים השונים המעורבים בתהליך זיהוי נגעי ה- DNA.

מי שידגים את ההליך יהיה ניקולס ווירת', שהשתמש בגישה זו במהלך מחקר התואר הראשון שלו. כדי להתחיל, הכינו מצע DNA מתאים על ידי יצירת פער DNA חד-גדילי בפלסמיד. מלא מחדש את הפער באוליגונוקלאוטידים של DNA חד-גדילי שונה, ולבסוף, ליניאריזציה של ה-DNA של הפלזמה באמצעות אנזימי הגבלה מתאימים.

עבור ניסויים אלה, מצעי ה-DNA הדו-גדיליים הם באורך של כ-1,000 זוגות בסיסים ומכילים נגע DNA וכן אזור לא מזווג הנקרא בועת DNA להעמסת חלבון על ה-DNA. לאחר מכן, הכינו דגימת DNA של חלבון לניתוח AFM על ידי פיפטינג ראשון של מאגר תגובה פי 10 ומים לתוך צינור מיקרו-תגובה. לאחר מכן, הוסף את ה-DNA והחלבונים הנחקרים.

לדוגמה, כאן, 100 ננו-מולרית של דגימת ה-DNA ומיקרו-מולרית אחת או כל אחד מחלבוני תיקון כריתת הנוקלאוטידים האוקריוטיים XPD ו-p44. לאחר מכן, דגרו על התגובה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בגוש חום. לאחר הדגירה, סובב בקצרה את הדגימה.

לאחר מכן, הכינו מצע נציץ כדי להניח עליו את הדגימה. השתמש באזמל כדי לחתוך חתיכת נציץ בגודל סנטימטר על סנטימטר מרצועה גדולה יותר. לאחר מכן, השתמש בפיסת סרט דבק כדי להסיר את השכבות העליונות של הנציץ כדי לחשוף משטח מצע נקי, שטוח וחלק מבחינה אנטומית.

הרחב את דגימת ה-DNA של החלבון פי חמישים עד מאה במאגר תצהיר AFM, והפקיד מיד 20 מיקרוליטר מהדגימה המדוללת על פני הנציץ. גורם הדילול תלוי בריכוז הדגימה. מיד לאחר הפקדת הדגימה על משטח הנציץ, שטפו את הדגימה שלוש עד ארבע פעמים בכמה מיליליטר של מים מסוננים ונטולי יונים ומחקו עודפי נוזלים.

השתמש בזרם עדין של חנקן כדי לייבש את הדגימה. לבסוף, השתמש בנייר דבק כדי לקבע את הדגימה בקצוותיה על שקופית מיקרוסקופ. הנח את הדגימה באמצע ה-AFM tagה והשתמש ברפידות מגנטיות כדי לתקן את שקופית המיקרוסקופ על הבמה.

לאחר מכן, הכנס את קצה ה-AFM למחזיק הקצה. תקן את הקצה במחזיק מתחת למהדק על ידי הידוק הבורג כך שיהיה הדוק לאצבע. לאחר הקיבוע, הזן את מחזיק הקצה לראש המדידה של AFM.

השתמש בברגי המיקום כדי להזיז את הדגימה במצב מרכזי. הנח את ראש המדידה AFM על גבי הדגימה, וודא שהראש עומד ביציבות עם רגליו בתוך חריצי הבמה. לאחר מכן, יישר את לייזר ה-AFM בגב השלוחה לעוצמת אות אופטימלית.

צפה באות ההשתקפות בחלון הווידאו AFM כדי למקם את הלייזר בגסות. עבור דגם AFM זה, סובב את הגלגלים בצד ימין ובחלק האחורי של ראש המדידה AFM כדי לכוונן את מיקומי ה-X וה-Y של לייזר ה-AFM על מנת לכוון אותו למרכז אל קצה השלוחה לאחר מכן, בצע אופטימיזציה של אות סכום הגלאי על ידי כוונון עדין של מיקום הלייזר עם שני הגלגלים.

כוון את השתקפות הלייזר AFM אל מרכז הגלאי על ידי אפס האות השונה מהדיודות העליונות והתחתונות של מערך הגלאי. עבור שלב זה, סובב את הבורג בצד שמאל של ראש המדידה עבור דגם AFM זה. לאחר מכן, קבע את תדר המגורים של השלוחה על ידי כניסה לחלון כוונון הלוח הראשי בתוכנה.

בחר משרעת המתאימה לכניסה של וולט אחד עבור ה-Piezo המניע את תנודת השלוחה ולאחר מכן הגדר את תדר התנודה ל-5% שלילי, מעט נמוך מתדר המגורים. כעת בצע כוונון תדרים אוטומטי ואפס את שלב התנודה. השאירו את המערכת כדי להגיע לשיווי משקל תרמי כשעה לפני תחילת ההדמיה, על מנת למנוע סחיפה.

כאשר אתה מוכן להתחיל בהדמיה, בלוח הראשי של התוכנה, הגדר נקודת הגדרה מגנה והתכונן להתקרב לקצה למשטח הדגימה על ידי בחירה ב-engage. הורד את הגלגל הקדמי של ראש ה-AFM באופן ידני עד שתגיע להגדרת ההגנה, או לנקודת ההגדרה. לאחר מכן, הורד בזהירות את הגלגל הקדמי עוד יותר עד שאות חיישן Z מורחב במלואו שמאלה.

הפעל את שולחן תנודות הרטט וסגור את מארז הבידוד האקוסטי. לאחר מכן, הורד את נקודת ההגדרה בתוכנת AFM באמצעות גלגל האוגר כדי לחבר את קצה ה-AFM עם הדגימה. כדי לבצע הדמיית מצב הקשה במשטר הדוחה, הורד את נקודת ההגדרה עד שאות הפאזה יהיה מעט נמוך יותר משלב הרמה החופשית.

לאחר מכן, התחל לסרוק את הדגימה. השתמש במהירות סריקה של 2.5 מיקרומטר לשנייה בשטחי פנים של תמונה של ארבעה מיקרומטר על ארבעה מיקרומטר או שמונה מיקרומטר על שמונה מיקרומטר ריבועים עם רזולוציות פיקסלים של 2, 048 או 4, 096, בהתאמה; ולחץ על כפתור בצע סריקה. בחר מראש קומפלקסים רלוונטיים של DNA חלבוני על ידי בדיקה ויזואלית ישירה של התמונות בתוכנת AFM.

עבור דגימות XPD, קומפלקסים אפשריים כוללים XPD p44 DNA, כמו גם XPD DNA ו-p44 DNA בגדלים שונים באופן מובהק בשל המסות המולקולריות השונות של XPD ו-p44. מדוד נפחים של פסגות חלבון בודדות על ה-DNA באמצעות כלי החתך בחלון הניתוח כדי למדוד את הגובה והקוטר של קטעי שיא החלבון עם סמני חלון החתך. השתמש בערכים אלה כדי לקבוע את נפח הפסגות באמצעות מודלים מתמטיים פשוטים כדי לאמת את הסוג המורכב.

לבסוף, כייל את מערכת ה-AFM שלך עם מגוון חלבונים עם משקלים מולקולריים ידועים כדי לתרגם את הנפחים הללו למשקלים מולקולריים משוערים של חלבונים ומתחמי חלבונים. על מנת לקבוע תכונות נוספות, כגון אורכי מקטעי DNA, מיקומי קומפלקסי החלבון על ה-DNA וספציפיות אתר המטרה שלהם או זוויות פס ה-DNA, ראה פרוטוקול הטקסט הנלווה. מוצגת כאן תמונת AFM עם שלושה סוגים שונים של קומפלקסים הקשורים ל-DNA שניתן להבחין ביניהם על סמך הגדלים השונים שלהם.

קומפלקסים מדרגה ראשונה תואמים רק את הקו-פקטור המפעיל את ההליקאז p44, קומפלקסים מדרגה שנייה מורכבים רק מחלבון XPD, וקומפלקסים מדרגה שלוש מורכבים גם מ-XPD וגם מ-p44 מכיוון שזיהוי לגיון על ידי XPD דורש הפעלה של פעילות ההליקאז שלו על ידי p44, ורק קומפלקסים מדרגה שלוש מראים זיהוי נגעים. על מנת לזהות אסטרטגיות שונות לזיהוי נגעים, מיקומי החלבונים על מצעי ה-DNA נמדדו להעמסת חלבון בבועת DNA בחמשת הכיוונים הראשוניים או בשלושת הכיוונים הראשוניים מנגע DNA המוצג באדום עבור הליקאזים NER פרוקריוטיים ואאוקריוטיים. בהתפלגות מיקום החלבון, ניתן לראות את זיהוי נגעי ה-DNA כשיא עקב קשירה משופרת במיקום נגע ה-DNA.

הליקאז ה-NER הפרוקריוטי UVRB ומקבילו האיקריוטי, XPD, מראים אסטרטגיות שונות של זיהוי נגעי CPD המצביעות על העדפות שונות של גדיל DNA. באופן ספציפי, נגעי CPD מזוהים על הגדיל הטרנסלוקציה על ידי UVRB, אך עדיפות על הגדיל הנגדי, שאינו מועבר על ידי XPD. לאחר שליטה, ניתן לבצע שיטה זו תוך מספר שעות או ימים כולל ניתוח.

חשוב לעבוד עם דגימות חלבון ו-DNA טהורות מאוד כדי להיות מסוגלים לפרש את התכונות בתמונות AFM ולעצב בקפידה את מצע ה-DNA בהתאם למערכת הביולוגית ולשאלה שאתה רוצה להתייחס אליה. בנוסף, שיטות אנסמבל, כגון חלל אלקטרופורזה של ג'ל, היסט אלקטרו-ניידות או בדיקות חתך DNA משלימות, כמובן, מאוד לניסויי AFM אלה; ושיטות אלה יכולות לעזור לענות על שאלות נוספות, כגון על זיקות קשירת DNA או פעילויות כריתת נגעי DNA. טכניקה זו היא גישה מהירה ופשוטה יחסית להמחשה ישירה של קומפלקסים של DNA חלבוני, וקומפלקסים אלה נותנים לנו תמונה טובה של התהליכים המתרחשים במערכת ביולוגית.

כמובן, זה לא רק שימושי בהבנת תהליכי תיקון DNA, אלא ניתן ליישם אותו גם על מערכות DNA חלבונים אחרות. לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לך מושג די טוב כיצד להכין דגימה על מערכת ה-DNA החלבונית המועדפת עליך, כיצד לדמות אותה על ידי AFM, וכיצד לחלץ פרמטרים שימושיים לפרשנות הנתונים שלך.