ספקטרומטריית מסה וגישות מבוססי Luminogenic לאפיון שלב I מטבולית כשירות של

מטרת פרוצדורה זו היא לקבוע את הפעילות של ציטוכרום P450s, או CYPs, בתאים תרביתיים. CYPs הם אנזימים מרכזיים המעורבים במטבוליזם של תרופות וחומרים רעילים, וביטוים לרוב אינו נשמר in vitro. ביטוי נורמלי של אנזימי CYP אובד לעיתים קרובות כאשר תאים גודלים בתרבית in vitro.

לפיכך, דגמי in vitro רבים עלולים להגביל את הרלוונטיות להבנת חילוף החומרים של תרופות וחומרים רעילים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא פשטותה בעת הערכת פעילות CYP בתאים בתרבית. באמצעות שימוש בסובסטראטים גלאים (probe substrates) ובמעכבים, מוצגות פלטפורמות כימות שונות, כולל ספקטרומטריית מסות.

כדי להתחיל, השג מבחנות קריוגניות עם תאים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הפרוטוקול המסופק משתמש בשורת תאי כבד כדוגמה. תוך עבודה בתנאים סטריליים, פתח בזהירות את המבחנה הקריוגנית כדי לשחרר לחץ עודף, ולאחר מכן העבר באמצעות פיפט את תכולת המבחנה הקריוגנית למבחנה של 10 milliliter הממולאת בתשעה milliliters של מצע Williams'E שחומם מראש ל-37 degrees Celsius.

סבבו את התמיסה בצנטריפוגה למשך 10 דקות ב-400 ×g בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הנוזל העליון (supernatant), השהו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של תוצר הפשרה קנייני, שחומם מראש ל-37 °C והועשר ב-glutamine. לאחר ספירת התאים החיוניים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, זרעו את התאים בלוחית 24 בארות מצופה בקולגן בצפיפות של 60,000 תאים חיוניים לבאר ובנפח סופי של 0.5 מיליליטר של תוצר הפשרה.

לאחר מספר ימי תרבית, התאים יוצרים מבנה טרבקולרי (trabecular) תת-צפוף. הפעילות המטבולית האופטימלית נצפית בדרך כלל בין הימים השביעי והעשירי, והיא הנמוכה ביותר ביום הרביעי. להכנת תרביות של אפיתל דרכי נשימה מובהן, השתמש באפיתל ראשוני של דרכי נשימה מובהן באופן מלא הזמין מסחרית, אשר גודל בממשק אוויר-נוזל (air-liquid interface) על גבי אינסרט (insert).

בעזרת פינצטה סטרילית, שחרר בעדינות את תבנית התאים (cell insert) מהמטריצה של האגרוז והעבר אותה לצלחת החדשה, שטעונה מראש ב-700 microliters של מצע גידול קנייני. הערך את שלמות רקמת דרכי הנשימה באמצעות שיטות המוזכרות בפרוטוקול הטקסט, כגון התנגדות טראנס-אפיתליאלית או תדירות דפיקת השרישריים (cilia beat frequency). לפני הניסוי, הכן שתי סדרות של תבניות תאים עבור תאי דרכי הנשימה ובארות עבור תאי הכבד, עם מינימום של שלושה חזרות.

השתמש בסדרה אחת עבור ניסוי העיכוב ובסדרה השנייה עבור הגשוש המטבולי בלבד. הכן סדרה שלישית של תאים כביקורת מדיום ריק (blank). ביום הניסוי, החלף את מדיום תרבית התאים ב-450 µL של מדיום טרי.

הוסף 50 µL של מצע המכיל מעכב CYP בריכוז 10x לסדרת התאים שהוכנה לניסוי העכבה, והדגר מראש למשך 30 דקות. לאחר מכן, החלף את המצע בסדרת העכבה ב-450 µL של מצע טרי, והוסף 50 µL של מצע המכיל הן את מעכב ה-CYP בריכוז 10x והן את תסבסב הבדיקה (probe substrate) בריכוז 10x. הוסף 50 µL של מצע עם תסבסב הבדיקה בריכוז 10x לשאר התאים, ולאחר מכן הוסף כמות שווה של נשא (vehicle) מדולל במצע לבקרי התאים הבלנקים.

לאחר דגירה של התאים למשך אפס עד חמש דקות עבור נקודת הזמן הראשונה, בקרת רקע אפס, אספו את המצע לשפופרות נפרדות ומסומנות והקפיאו את המצע לעיבוד עתידי. לאחר מכן, דגרו את התאים של נקודת הזמן השנייה למשך 16 שעות באינקובטור תאים. בתום תקופת הדגירה, אספו את המצע באותה שיטה לצורך כימות של התוצר המטבולי.

העבר 250 µL של מצע דגירה למיקרוטוב של 1.5 mL, והוסף תמיסת סטוק של סטנדרט פנימי 4-methylumbelliferone כדי להגיע לריכוז סופי של 100 nM. כוון את ה-pH של המצע לטווח שבין 4.5 ל-5.0 על ידי הוספה של HCl בריכוז 1 M, בנפח של 1 µL בכל פעם. ודא את ה-pH על ידי טפטוף של 2 עד 10 µL מהמצע על סרט pH, ולאחר מכן הוסף 150 units של betaglucuronidase arylsulfatase מ-Helix pamatia.

לאחר דגירה של שעה אחת ב-37 °C, יש לעצור את התגובה על ידי הוספת 250 µL של מתנול קר. יש לאדות את הממס באמצעות צנטריפוגת ואקום ב-45 °C. יש להמיס מחדש את הדגימות ב-500 µL של תמיסת אצטוניטריל במים בריכוז 30%.

לביצוע כימות מבוסס ספקטרומטריית מסות, העבירו 250 µL מכל סטנדרט של דילול סדרתי לבקבוק זכוכית ענברי עבור כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (UPLC) להזרקה במדגם האוטומטי של ה-UPLC-MS. העבירו גם את דגימות הבדיקה לבקבוקי UPLC ענבריים והניחו אותם במדגם האוטומטי של ה-UPLC. לאחר ערבוב אקראי של כל הבקבוקים, הפעילו את ה-UPLC-MS בהתאם להגדרות המפורטות בפרוטוקול הכתוב, בהתאם לגרסון (probe) הספציפי שיש לכמת.

השתמש בכלי Quantitate, Build Quantitation Method בערכת כלי הכימות של ספקטרומטר המסות כדי להפיק את עקומת הכיול מהסטנדרט הסינתטי ומהסטנדרט הפנימי שנרכשו, ולאחר מכן השתמש ב-Quantitation Wizard כדי לבחור את סדרת הדגימות ואת הדגימות לכימות ולהפעיל את שיטת הכימות. כדי להשרות את CYP1A1 ו-CYP1B1, השתמש בפריסת הפלטה המופיעה בפרוטוקול הטקסט. דגרי את התאים המיועדים להשראה עם ריכוז סופי של 10 nanomolar TCDD במצע למשך 72 שעות.

לאחר תקופה זו, הסיר את המצע, שטוף את הבארות ב-PBS שלוש פעמים, והוסף מצע טרי. לפני דגירה של התאים עם הגשוש (probe) המדווח הלומינוגני, דגור מראש את תת-הקבוצה המיועדת של התאים המודuces למשך 30 דקות עם מעכב CYP1A1, CYP1B1 במצע. הוסף את הגשוש הלומינוגני, luciferin 6'chloroethyl ether בריכוז סופי של 50 micromolar לתאים שאינם מודuces, לתאים המודuces ולתאים המודuces בתוספת מעכב.

דגרו למשך ארבע שעות ולאחר מכן העבירו 25 µL של מצע תרבית לפלטת 96 בארות לבנה ואטומה, והוסיפו 25 µL של ריאגנט גילוי לוציפרין המסופק על ידי היצרן. לאחר דגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, קראו את הפלטה באופן מיידי באמצעות לומינומטר. כאן מוצגת הלומינסנציה היחסית הנוצרת מדאלקילציה של luciferin 6'chloroethyl ether, המזורזת על ידי CYP1A1 ו-CYP1B1.

הדוגמה מראה היעדר פעילות אנזימטית בהיעדר השראה של TCDD. בעקבות השראה של TCDD, נצפית פעילות של CYP1A1, CYP1B1 הן בסוגי תאי הכבד והן בסוגי תאי מערכת הנשימה. לבסוף, הוספה של המעכב alpha-naphthoflavone של CYP1A1, CYP1B1 מפחיתה או מבטלת את פעילות ה-CYP.

כדי להעריך את הפעילות של CYP2A6 ו-2A13 בסוגי תאים של הכבד ודרכי הנשימה, נמדדה כמות ה-7-hydroxycoumarin שהופקה באמצעות הידרוקסילציה של coumarin על ידי האנזים, באמצעות UPLC LC-MS. בזמן אפס דקות של אינקובציה עם coumarin, מזוהה רק רקע. לאחר 16 שעות, נצפתה הידרוקסילציה של coumarin עם היווצרות של 7-hydroxycoumarin בשני סוגי התאים.

לבסוף, הוספה של מעכב CYP2A, 2A13 מונעת את היווצרותו של 7-hydroxycoumarin. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע את חלקי דגירת הפרובה והכימות של שיטה זו בתוך מספר שעות ועד יום אחד ברוב המקרים. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה של אופן ביצוע בדיקות שונות של מטבוליזם פאזה אחת באמצעות סוגי תאים שונים, תוך אישור הספציפיות של האנזים באמצעות עיכוב ו/או השראה לפי הצורך.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור שסוגי תאים שונים עשויים לדרוש זמני דגירה ארוכים יותר, וחיוני לכלול סוג תאים שניתן להשתמש בו כביקורת חיובית. אין לשכוח שעבודה עם TCDD עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון ציוד מגן אישי מלא, בעת ביצוע פרוצדורה זו. השלכותיה של טכניקה זו משתרעות על שימוש במודלים מתאימים in vitro להערכה פרה-קלינית של תרופות חדשות ולהערכת סיכונים של כימיקלים ומרכיבים המשמשים במוצרי צריכה.