ספקטרומטריית מסה וגישות מבוססי Luminogenic לאפיון שלב I מטבולית כשירות של במבחנה תא תרבויות

מטרת הליך זה היא לקבוע את הפעילות של ציטוכרום P450s, או CYPs, בתאים מתורבתים. CYPs הם אנזימי מפתח המעורבים בחילוף החומרים של תרופות וחומרים רעילים וביטוים אינו נשמר לעתים קרובות במבחנה. ביטוי תקין של אנזימי CYP אובד לעתים קרובות כאשר תאים מתורבתים במבחנה.

לכן, מודלים רבים במבחנה עלולים להגביל את הרלוונטיות להבנת חילוף החומרים של תרופות וחומרים רעילים. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא הפשטות שלה בהערכת פעילות CYP בתאים מתורבתים. באמצעות מצעי בדיקה ומעכבים, מוצגות פלטפורמות כימות שונות, כולל ספקטרומטריית מסה.

כדי להתחיל, השג בקבוקונים קריוגניים עם תאים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. הפרוטוקול המסופק משתמש בקו תאי כבד כדוגמה. תוך כדי עבודה בתנאים סטריליים, פתח בזהירות את הבקבוקון הקריוגני כדי לשחרר לחץ עודף, ולאחר מכן פיפטה את תכולת הבקבוקון הקריוגני לתוך צינור של 10 מיליליטר מלא בתשעה מיליליטר של מדיום Williams'E שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס.

צנטריפוגה את התמיסה למשך 10 דקות ב 400 פעמים גרם בטמפרטורת החדר. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את התאים בחמישה מיליליטר של מדיום הפשרה קנייני, שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס ותוסף גלוטמין. לאחר ספירת התאים בני הקיימא כמתואר בפרוטוקול הטקסט, זרע את התאים בצלחת מצופה קולגן 24 באר בצפיפות של 60,000 תאים ברי קיימא לבאר ונפח סופי של 0.5 מיליליטר של מדיום הפשרה.

לאחר מספר ימים בתרבית, התאים יוצרים מבנה טרבקולרי תת-קונפלונטי. הפעילות המטבולית האופטימלית נצפית בדרך כלל בין היום השביעי ל-10, והיא הנמוכה ביותר ביום הרביעי. כדי להכין את תרביות האפיתל המובחנות של דרכי הנשימה, השתמש באפיתל דרכי הנשימה הראשוני המובחן במלואו הזמין מסחרית שגדל בממשק האוויר-נוזל על גבי תוספת.

בעזרת פינצטה סטרילית, עקרו בעדינות את תוספת התא ממטריצת האגרוז והעבירו אותה לצלחת החדשה הטעונה מראש ב-700 מיקרוליטר של מדיום תרבית קנייני. העריכו את תקינות רקמת דרכי הנשימה באמצעות שיטות המוזכרות בפרוטוקול הטקסט, כגון עמידות טרנסאפיתל או תדירות פעימות ריסים. לפני הניסוי, הכינו שתי סדרות של תוספות תאים לתאי דרכי הנשימה ובארות לתאי הכבד עם מינימום של שלושה שכפולים.

השתמש בסדרה אחת לניסוי העיכוב ובשנייה לבדיקה המטבולית בלבד. הכן סידרה שלישית של תאים כפקד ריק של מדיה. ביום הניסוי, החלף את מדיום תרבית התאים ב -450 מיקרוליטר של מדיום טרי.

הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום המכיל את מעכב CYP 10x לסדרת התאים שהוכנו לניסוי העיכוב ודגירה מוקדמת למשך 30 דקות. לאחר מכן, החלף את המדיום בסדרת העיכוב ב-450 מיקרוליטר של מדיום טרי, והוסף 50 מיקרוליטר של מדיום המכיל גם מעכב CYP פי 10 וגם את מצע הבדיקה פי 10. הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום עם מצע הבדיקה פי 10 לתאים האחרים, ולאחר מכן הוסף כמות שווה של רכב מדולל במדיום לפקדי התאים הריקים.

לאחר הדגירה של התאים למשך אפס עד חמש דקות לנקודת הזמן הראשונה, אפס בקרת רקע, אספו את המדיום בצינורות מסומנים נפרדים והקפיאו את המדיום לעיבוד עתידי. לאחר מכן דגרו על נקודת הזמן שני תאים למשך 16 שעות בחממת התאים. בתום תקופת הדגירה, אסוף את המדיום באותה שיטה לכימות המוצר המטבולי.

העבירו 250 מיקרוליטר של מדיום דגירה למיקרו-צינור של 1.5 מיליליטר, והוסיפו תמיסת מלאי סטנדרטית פנימית של 4-methylumbelliferone כדי להגיע לריכוז סופי של 100 ננו-מולר. התאם את ה-pH של המדיום בין 4.5 ל-5.0 על ידי הוספת HCl טוחנת אחת, מיקרוליטר אחד בכל פעם. אמת את ה-pH על ידי פיפטינג של שניים עד 10 מיקרוליטר של מדיום על רצועת pH, ולאחר מכן הוסף 150 יחידות של בטגלוקורונידאז ארילסולפטאז מ-Helix pamatia.

לאחר דגירה של שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, עצרו את התגובה על ידי הוספת 250 מיקרוליטר מתנול קר. אידוי הממס באמצעות צנטריפוגת ואקום בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס. הרכיבו מחדש את הדגימות עם 500 מיקרוליטר של תמיסת אצטוניטריל למים של 30%.

כדי לבצע כימות מבוסס ספקטרומטריית מסה, הוסף 250 מיקרוליטר מכל תקן דילול סדרתי לבקבוקון זכוכית כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים ענבר להזרקה בדגימה האוטומטית UPLC-MS. הוסף גם את דגימות הבדיקה לבקבוקוני UPLC ענבר והנח אותן בדגימה האוטומטית של UPLC. לאחר חלוקה אקראית של כל הבקבוקונים, הפעל את ה-UPLC-MS באמצעות ההגדרות המפורטות בפרוטוקול הטקסט בהתאם לבדיקה הספציפית שיש לכמת.

השתמש בכלי Quantitate, Build Quantitation Method בכלי הכימות של ספקטרומטר המסה כדי ליצור את עקומת הכיול מהתקן הסינתטי הנרכש והתקן הפנימי, ולאחר מכן השתמש באשף הכימות כדי לבחור את אצווה הדגימה והדגימות כדי לכמת ולבצע את שיטת הכמות. כדי לגרום ל-CYP1A1, CYP1B1, השתמש בפריסת הלוח שנמצאת בפרוטוקול הטקסט. לדגור את התאים המיועדים לאינדוקציה בריכוז סופי של 10 ננו-מולרי TCDD במדיום למשך 72 שעות.

לאחר תקופה זו, הסר את המדיום, שטוף את הבארות עם PBS שלוש פעמים והוסף מעט מדיום טרי. לפני הדגירה של התאים עם בדיקת המדווח הלומינוגנית, דגירה מוקדמת של תת-הקבוצה המיועדת של תאים מושרים למשך 30 דקות עם מעכב CYP1A1, CYP1B1 במדיום. הוסף את הפרופב הלומינוגני, אתר לוציפרין 6'כלורואתיל בריכוז סופי של 50 מיקרומולר לתאים מעכבי פלוס שאינם מושרים, מושרים ומושרים פלוס.

דגירה למשך ארבע שעות ולאחר מכן העבירו 25 מיקרוליטר של מדיום תרבית לצלחת לבנה ואטומה של 96 בארות והוסיפו 25 מיקרוליטר של ריאגנט לזיהוי לוציפרין המסופק על ידי היצרן. לאחר הדגירה של 20 דקות בטמפרטורת החדר, קרא את הצלחת מיד באמצעות לומינומטר. הזוהר היחסי שנוצר על ידי העסקה של אתר לוציפרין 6'כלורואתיל, אשר מזורז על ידי CYP1A1, CYP1B1, מוצג כאן.

הדוגמה לא מראה פעילות אנזימים בהיעדר אינדוקציה של TCDD. לאחר השראת TCDD, נצפית פעילות CYP1A1, CYP1B1 הן בסוגי תאי הכבד והן בסוגי תאי הנשימה. לבסוף, תוספת של מעכב CYP1A1, מעכב CYP1B1 אלפא-נפטופלבון מפחיתה או מבטלת את פעילות ה-CYP.

כדי להעריך את פעילות CYP2A6, 2A13 בסוגי תאי הכבד ודרכי הנשימה, נמדדה כמות ה-7-הידרוקסיקומרין המיוצרת באמצעות הידרוקסילציה של קומרין על ידי האנזים באמצעות UPLC LC-MS. לאחר דגירה של אפס דקות עם קומרין, מזוהה רק רקע. לאחר 16 שעות נצפית הידרוקסילציה של קומרין עם היווצרות 7-הידרוקסיקומרין בשני סוגי התאים.

לבסוף, תוספת של מעכב CYP2A, 2A13 מונעת היווצרות של 7-הידרוקסיקומרין. לאחר השליטה, ניתן לבצע את חלקי הדגירה והכימות של טכניקה זו תוך מספר שעות עד יום ברוב המקרים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע בדיקות מטבוליזם שונות של שלב ראשון באמצעות סוגי תאים שונים, המאשרים את הספציפיות של האנזים באמצעות עיכוב ו/או אינדוקציה כנדרש.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שסוגי תאים שונים עשויים לדרוש זמני דגירה ארוכים יותר, וחיוני לכלול סוג תא שיכול לשמש כבקרה חיובית. אל תשכח שעבודה עם TCDD עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון ציוד מגן אישי מלא בעת ביצוע הליך זה. ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על שימוש במודלים מתאימים במבחנה להערכה פרה-קלינית של תרופות חדשות והערכות סיכון של כימיקלים ומרכיבים המשמשים במוצרי צריכה.