Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא למדוד את הפעילות האנזימטית של חלבון קינאזות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום איתות הקינאז, כגון עד כמה פעיל מוטנט קינאז או קינאז, הספציפיות שלו והאם פעילותו רגישה לטיפולים שונים בתאים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא גם רב-תכליתית וגם כמותית.

מי שידגים את ההליך יהיה סטיב סטיפק, מדען מחקר במעבדת קוב שיש לו ניסיון רב בבדיקה זו. כדי להתחיל, הוסף שני מיקרוליטר של מיליגרם אחד לנוגדנים למיליליטר ל-200 מיקרוליטר של ליזטים של תאים ודגירה בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה תוך כדי נדנדה. שטפו את חרוזי החלבון A-Sepharose פעמיים עד שלוש על ידי הוספת מאגר ליזה ולאחר מכן געו בסיבוב בארבע מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד דקה ב-5000 פעמים גרם, ואז הסירו את הסופרנטנט בעזרת פיפט והשעו מחדש את החרוזים במאגר.

לאחר מכן, הוסף 30 מיקרוליטר של 50% slurry של חרוזי חלבון A-Sepharose ומאגר ליזה לליזטים. דגרו על הליזטים בארבע מעלות צלזיוס למשך שעה תוך כדי נדנדה. גע בסיבוב בארבע מעלות צלזיוס כדי לגלול את החרוזים ולהסיר את הסופרנטנט.

שטפו את החרוזים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של מאגר שטיפת חרוזים, ואחריו סיבוב מגע, ואז שטפו את החרוזים פעם אחת עם מאגר תגובת X קינאז אחד. לאחר סיבוב מגע, הסר כמה שיותר מאגר מבלי להסיר את החרוזים. כדי לאתחל את הבדיקה, הוסף את כל תערובת התגובה לדגימת הקינאז.

דגרו את התגובה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות עד שעה, תלוי בפעילות הקינאז הנבדקת. עצור את התגובה על ידי הנחתו על קרח והוספת 7.5 מיקרוליטר של חמישה מאגר דגימת X Laemmli, ואז חמם את התגובה ב-100 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות בגוש החום. לאחר סיבוב הדגימה במגע, טען 20 מיקרוליטר לבאר על ג'ל SDS-PAGE של 10 עד 15%.

הקפד לשמור על מנגנון הג'ל מוגן כדי להגביל את החשיפה לזרחן-32 מכיוון שהוא פולט בטא באנרגיה גבוהה. הפעל את הג'ל מספיק זמן כדי להפריד בין קינאז למצע. לאחר הריצה, הסר את הג'ל מלוחות זכוכית ואלומיניום, ולאחר מכן הניח את הג'ל ב-50 מיליליטר של כתם קומאסי למשך שעה על שייקר אורביטלי המוגדר ל-50 סל"ד.

לשלב זה, השתמש במיכל מעט גדול יותר מהג'ל עצמו. כדי להרתיע את הג'ל, העבירו אותו מהכתם לתמיסת הקיבוע. מניחים חתיכות קצף או מגבוני מעבדה מסוקסים במיכל עם הג'ל כדי לספוג את צבע הקומאסי.

נדנד את הג'ל ב-600 עד 700 מיליליטר של תמיסת קיבוע למשך הלילה על שייקר מסלולי ב-50 סל"ד. למחרת, הוציאו את הג'ל מתמיסת הקיבוע והשרו אותו ב -200 מיליליטר מתנול למשך דקה עד שתי דקות בתסיסה עדינה עד שהג'ל הופך לבן חלבי. זה יעזור למנוע סדקים בשלב הייבוש.

לאחר מכן, הרטיבו פיסת נייר סינון איכותי בגודל של כ-14 ס"מ על 14 ס"מ עם מתנול והניחו אותה על מייבש ואקום ג'ל לוחות. הנח את הג'ל על נייר הסינון, כשהצד הקדמי פונה כלפי מעלה. מכסים בזהירות את הג'ל בניילון, ואז מפעילים ומופעלים את המייבש ומורחים ואקום.

לאחר השגת הוואקום לאחר מספר שניות בלבד, גלגלו בועות אוויר בעזרת משטח גומי רך. המשך בריצה במשך 90 דקות. הסר את הג'ל המיובש והצמד טוש אוטוראד, כגון סרגל זרחני או נקודה לנייר הסינון בצד הג'ל והנח אותו בקסטה המכילה רשת העצמה.

השתמש במונה גייגר כדי לבדוק את עוצמת האות. עבור אותות חלשים יותר, חשיפה במינוס 70 מעלות צלזיוס עד מינוס 80 מעלות צלזיוס עם מסך מתעצם תגדיל את צפיפות רצועת הסרט. בחדר חושך, הניחו פיסת סרט על גבי הג'ל המיובש בתוך קלטת הסרט המכילה מסך מתעצם.

אם ספירת העלות לאלף הופעות היא 100 ומטה, נסה חשיפה לילית במינוס 70 עד 80 מעלות צלזיוס. לחלופין, אם הספירה קרובה יותר ל-10,000, התחל בחשיפה של שעה ובצע אופטימיזציה משם. בסיום החשיפה, הסר את הסרט לפני פיתוחו במעבד סרט רפואי או רנטגן.

סמן את הרצועות המתאימות לתקני החלבון על הסרט. כמו כן, סמן את תקני החלבון ואת נתיבי התגובה לעיון עתידי. הסר מהג'ל את הרצועות התואמות את הרצועות המעניינות בסרט.

מניחים את הרצועות בשבעה בקבוקוני נצנוץ של מיליליטר ומוסיפים ארבעה מיליליטר נוזל נצנוץ. ספרו את הרצועות בעזרת מונה נצנוץ נוזלי. ודא שהמונה מוגדר לנטר את חלון ספקטרום האנרגיה הנכון עבור זרחן-32.

המשך לנתח את התוצאות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. שברי ERK2 מטוהרים שימשו בבדיקת קינאז עם MBP בנוכחות או בהיעדר MEK1R4F, ממריץ פעיל מכונן של פעילות ERK2 קינאז. בניסוי דומה, נעשה שימוש בבדיקת MBP קינאז למדידת פעילות של מוטציות רקומביננטיות של ERK2 שטוהרו מתרביות חיידקים ביחס לחלבון מסוג בר.

למרות ש-ERK2 הצליח לזרחן MBP כאשר הוא מגורה על ידי MEK1R4F, פעילות ERK2 קינאז מתבטלת באופן דרמטי על ידי מוטציה של הליזין הקטליטי או תראונין פרוקסימלי לאתרים הקנוניים של זרחון כפול. ERK2 T188D ו-ERK2 T188E מציגים פעילות קינאז שולית כלפי פפטיד גמיש קטן. עם זאת, הם אינם מסוגלים לזרחן בצורה חזקה את מצעי ה-ERK2 הידועים, Nup153 ו-PDX1, כפי שניתן לראות ב-ERK2 מסוג פראי.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך יום עד יומיים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ב-ATP עם תווית רדיו כדי לבחון את הפעילות של חלבון קינאזות כדי להבין טוב יותר את רשתות האיתות שבהן הם שוכנים. בזמן הניסיון בהליך זה, חשוב לזכור למטב את פרוטוקול משקעי האמינו למשיכת קינאזות מעניינות כדי לקחת בחשבון כמויות חלבון שוות ולמדוד ריכוזים של חלבון רקומביננטי כדי להבטיח השוואות מדויקות של פעילות קינאז.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום איתות התאים לחקור מסלולי התמרה ספציפיים ואת תפקידיהם בוויסות הומאוסטטי וכן את תרומתם להתקדמות המחלה. אל תשכח שעבודה עם חומרים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.