Name: Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: למדו לבצע מדידה כמותית של פעילות קינאזות חלבון באמצעות ATP מסומן ברדיואקטיביות. פרוטוקול זה מאפשר הערכת ספציפיות קינאזות והשפעת טיפולים תאיים על פעילותן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לכל החברים הנוכחיים והעברתיים של מעבדת קוב עבור עבודה ודיונים יקרי ערך, ו Dionne Ware עבור סיוע מנהלי. מחקרים אלה נתמכו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט R37 DK34128 ו Welch קרן גרנט I1243 ל MHC

1. קינאז טיהור משאבים כללי Immunoprecipitation צינור הערה: קינאזות לשימוש עם assay זה עשוי להיות שמקורו immunoprecipitates של תאים בתרבית או על ידי אמצעים רקומביננטי כגון זיקה מתוייגים טיהור 6 . להלן פרוטוקול כללי דגל תיוג immunoprecipitation כי ייתכן שיהיה שונה בהתאם kinase של עניין. הכל צריך להישמר על הקרח במידת האפשר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של נוגדן 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ל 200 μL של lysates התא (בדרך כלל ~ 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ריכוז החלבון הכולל) ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה בעת נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלבון חרוזי sepharose 2-3 פעמים עם חיץ תמוגה (ראה להלן) על ידי ספינינג בקצרה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד 1 x ב 5000 xg (&quot;מגע ספין&quot;), הסרת supernatant עם פיפטה, חרוזים resuspending במאגר . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ תמוגה: 50 מ&quot;מ HEPES pH 7.7, 150 מ&quot;מ NaCl, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ EGTA, 10% גליצרול, 0.2 mM נתרן orthovanadate, 100 מ&quot;מ נתרן פלואוריד, 50 מ&quot;מ β-glycerophosphate, 0.1% Triton X 100 או 0.1% NP-40. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μL של 50% slurry של חלבון חרוזי sepharose במאגר תמוגה כדי lysates; דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 בזמן נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגע ספין ב 4 ° C כדי גלולה חרוזים ולהסיר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3 פעמים עם 1 מ&quot;ל של חיץ לשטוף חרוז (1 M NaCl, 20 מ&quot;מ טריס pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעם עם 1x kinase התגובה חיץ (10 מ&quot;מ HEPES pH 8.0, 10 מ&quot;מ MgCl 2 ). הסר חיץ ככל האפשר מבלי להסיר חרוזים. </li></ol> 2. אתחול תגובות קינאז הערה: עבור מבחני קינאז IP, ~ 15 μL של חרוזים מושעה הוא מדגם מתחיל טיפוסי. עבור מבחני קינאז חלבון רקומביננטי, כמויות החל טיפוסי החל מ 0.1-1.0 מיקרוגרם ב 1-10 עבור 25-50 μL נפח התגובה הסופית. התאם את הכרכים של מדגם חלבון רקומביננטיS להיות שווה עם המאגר הם מאוחסנים לפני אתחול assay. בעת שימוש בכמויות גבוהות של קינאז, לכלול חלבון המוביל כגון BSA כדי לסייע בשמירה על יציבות החלבון למשך assay. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חיץ התגובה 5x kinase להלן: 50 מ&quot;מ HEPES pH 8.0 50 מ&quot;מ MgCl 2 50 מ&quot;מ Benzamidine (מעכב פרוטאז) 50 מ&quot;מ DTT (סוכן הפחתת) 250 מיקרומטר ATP (ללא תווית, או &quot;קר&quot;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור דגימות קינאז על הקרח צינורות 1.5 מ&quot;ל. הכינו את תערובת התגובה הבאה, צינורות צוננים 1.5 מ&quot;ל נפרד: 21 μL H 2 O 6 μL 5x חיץ התגובה kinase 1 μolabel μL (&quot;חם&quot;) ATP 2 מצע μL (~ 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הערה: עבור מבחני קינאז רקומביננטי, נפח עשוי להיות מותאם כדי להתאים חלבונים מטוהרים. חישוב כזה נפח התגובה הסופית היא 30 μL. השתמש מתכון זה להכין הוריםלְעַרְבֵּב. עם קבלת ATP שכותרתו, לדלל מלאי H 2 O לפעילות ספציפית של 0.01 mCi / μL לפני הוספת תערובת התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאתחל את assay, להוסיף תערובת התגובה כולה מדגם kinase ו דגירה תגובה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות עד 1 שעות בהתאם לפעילות של kinase להיות assayed. הערה: כאשר אתה עובד עם קינאז שפעילותו לא נבדקה בעבר, בצע את מהלך הזמן של פעילות קינאז עם מרווחי 5 דקות בין נקודות זמן. </li></ol> 3. סיומת תגובה SDS-PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפסיק את התגובה על ידי לשים על קרח הוספת 7.5 μL 5x Laemmli חיץ מדגם 6 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים ב 100 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות עד 2 דקות בבלוק חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגע ספין לטעון 20 μL לכל טוב על 10-15% SDS-PAGE ג&#39;ל. הפעל ג&#39;ל מספיק זמן כדי להפריד בין קינאז המצע (בדרך כלל 1 שעות על כוח קבוע של 5 W) הקפד לשמור על מנגנון ג &#39;ל מוגן להגביל את החשיפה 32 </suP&gt; P. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, להשתמש במכשירים ג&#39;ל תוצרת בית, אבל סטנדרטי מינימלי זמין מסחרית ג&#39;ל מתאימים לחלוטין. השתמש בממדים באופן הבא: ג&#39;לים: רוחב 8 ס&quot;מ, אורך 5.5 ס&quot;מ (פתרון), עובי 1.5 מ&quot;מ. מסרקים: 15 בארות, עובי 1.5 מ&quot;מ, רוחב 2.9 מ&quot;מ, עומק 16 מ&quot;מ </li></ol></li></ol> 4. מכתים ג&#39;ל וייבוש זהירות: עבור כל השלבים הקפד להפחית את החשיפה האישית ל -32 P באמצעות שימוש במיגון רדיואקטיבי ובביגוד בציוד מגן אישי. לקבלת מידע נוסף על שלבים ספציפיים, כלול הפניות מועילות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הג&#39;ל מזכוכית / צלחות אלומינה מקום ב 50 מ&quot;ל כתם קומסי (10% חומצה אצטית קרח, 50% מתנול, 0.25% R-250 צבע) במשך שעה 1 על שייקר מסלולית להגדיר 50 סל&quot;ד. עבור שלב זה להשתמש במיכל כי הוא מעט גדול יותר מאשר ג &#39;ל עצמו. 8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזיז את הג&#39;ל מ כתם לפתרון פתרון (10% aci aci קרחוניד, 20% מתנול) כדי דה-כתם. סלע את הג&#39;ל ב 600-700 מ&quot;ל של פתרון תיקון לילה על שייקר מסלולית ב 50 סל&quot;ד. מקום חתיכות של קצף או מגבונים מעבדה מרוכזת במיכל עם ג&#39;ל לספוג את צבע קומסי 8 , 9 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ג&#39;ל מ תיקון פתרון ולספוג 200 methanol מ&quot;ל עבור 1-2 דקות עם תסיסה עדינה עד ג &#39;ל הופך לבן חלבי. זה יסייע למנוע פיצוח במהלך שלב ייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רטוב 14 ס&quot;מ x 14 חתיכת ס&quot;מ של נייר סינון איכותי עם מתנול ומקום על משטח ואקום מייבש ואקום. הנח את הג&#39;ל על הצד הקדמי של נייר המסנן ופנה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הג&#39;ל בעטיפת פלסטיק בזהירות, כדי למנוע קמטים בועות אוויר. הפעל את המייבש עבור 1.5 שעות ב 80 ° C. לאחר הוואקום הושג לפתוח את המכסה לגלגל את כל בועות אוויר במידת הצורך עם ברכה גומי רך. </li></ol> 5. אוטורדיוגרמה וספירת סינטילציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגשםג&#39;ל אד ולצרף סמן autorad, סרגר זרחני או נקודות על נייר הסינון בצד של הג&#39;ל. אם באמצעות נקודות לוודא שהם נמצאים דפוס אסימטרי. זה יהיה ליישר את הג&#39;ל עם הסרט לאחר החשיפה והפיתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מונה גייגר לבדוק את עוצמת האות. עבור חלשות אותות חלש ב -70 מעלות צלזיוס ל -80 מעלות צלזיוס עם מסך הגברת תגדיל את צפיפות הלהקה הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר חשוך לשים ג&#39;ל יבש בתוך קלטת הסרט עם הסרט ואת המסך הגובר בסדר הבא מלמעלה למטה: ג&#39;ל, הסרט, מסך מגביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את המסך הגובר למכסה של הקלטת ואת הקלטת ג&#39;ל במקום לעשות צעד זה יותר קל. המסך החזק פולט אור כאשר מוקרן על ידי חלקיקי בטא מ 32 P. אלה פליטות האור לחדור את הסרט בצורה יעילה יותר מאשר חלקיקי בטא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את אורך הגל הנפלט corres המסך הגוברתבריכות לאורך גל הסרט הכי רגיש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מונה גייגר כדי לקבוע כמה זמן לעזוב את החשיפה עבור: אם ספירת cpm הוא ~ 100 או למטה, לנסות לילה ב -70 ° C. אם הספירה היא ~ 10,000, להתחיל עם חשיפה 1 שעות ו לייעל משם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיום החשיפה להסיר את הסרט ולפתח במעבד הסרט הרפואי / רנטגן. אם החשיפה בוצעה ב -70 ל -80 מעלות צלזיוס, או לאפשר את הקלטת לחמם לטמפרטורת החדר כדי למזער עיבוי על הסרט או להסיר את הסרט מיד לפני צורות עיבוי 10 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הסרט על נייר ג&#39;ל יבש / מסנן וליישר את התמונה של הסמן / נקודות עם סמנים / נקודות על ג&#39;ל יבש. סמן על הסרט להקות המתאימות לסטנדרטים של חלבון. תווית את הסטנדרטים חלבון אשר נתיבים התגובות הן לעיון בעתיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלו את להקות מן הג&#39;ל התואמות להקות של עניין על הסרט ומניחים אותםב 7 מ&quot;ל בקבוקונים scintillation. הוסף 4 מ&quot;ל של נוזל נצנוץ לספור עם נוזל נצנץ נוזל. אישור הדלפק מוגדר לפקח על חלון ספקטרום האנרגיה הנכון עבור 32 P. הערה: הקפד גם לבלו את הלהקה התואמת את המצע משלב הבקרה no-kinase. זה ישמש לחישוב קרינת הרקע כי יהיה מנוכה מכל ספירת scintillation. </li></ol> 6. ניתוח התוצאות הערה: autoradiogram מספק הדמיה איכותית של התוצאות. עבור quantitation מדויק, 32 P שילוב ניתן למדוד עם הדלפק נצנץ. הנתונים מתבטאים בדרך כלל במונחים של פעילות יחסית, כפי שמוצג באיור 1 ב . כל עוד נשמרים תנאים אחידים לכל הדגימות, מדידות יחסית של פעילות ספציפית מספקות כדי להשוות בין טיפולים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת חישוב ערכי פעילות ספציפיים מוחלטים, בצע קריטריוןOus אופטימיזציה של כל תנאי התגובה, כולל קינאז, המצע, ריכוזי ה- ATP קר, על מנת להבטיח טווח ליניארי של פעילות על פני זמן הקורס ( למשל 2 x [קינאז] = 2 x פעילות ספציפית). עבור קינאזות עם פעילות ספציפית גבוהה, לבצע מבחני עם ריכוז המצע מוגברת במקרה פעילות קינאז מוגבל על ידי כמות המצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הפעילות הספציפית של kinase עניין ביחידות של פוספט ננומלס מועבר לכל min לכל קינאז מ&quot;ג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החסר החסר מן הדקה ב להקות ספור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את ריקבון ה- ATP החם: [1/2) ^ (t / t 1/2 )] x 0.95 כאשר t הוא מספר הימים מאז תאריך ההתייחסות (אמור להינתן על ידי הספק), t 1/2 הוא מחצית חיים של 32 P, שהוא 14.3 ימים, ו 0.95 משקף את היעילות של הדלפק נצנץ. דוגמה: אם אתה משתמש ATP חם כי הוא בן 28 ימים, הערך ריקבון צריך להיות 0.245. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Calc(Polololes (pmol) של ATP הכולל assay (בדרך כלל זה שווה את כמות ATP קר התגובה): נפח assay (μL) x [קר ATP] (מיקרומטר) = סך ATP (pmols). דוגמה: 30 μL x 50 מיקרומטר = 1500 pmol </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב CPM / pmol ATP: [μL של ATP חם x (2.2 x 10 7 ) x גורם דעיכה] / pmol של ATP קר. הערה: הערך של 2.2 x 10 7 ממיר 0.01 mCi / μL של ATP ל- cpm. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב כמות של קינאז ב assay ב מ&quot;ג. עבור קינאז רקומביננטי ו קינאזות immunoprecipitated, שיטות סטנדרטיות כגון מבחני BCA מתאימים כדי לקבוע ריכוז מתחיל. דוגמה: wtERK2 0.0002 מיקרוגרם / μL בתגובת 50 kinase μL הוא 0.01 מיקרוגרם, או 1 x 10 -5 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב סך מחיר לאלף הופעות ב- assay. להרכיב 30 תגובות μL ולהפעיל 20 μL מכל תגובה על ג&#39;ל. הכפל את cpm נספר (לאחר חיסור ריק) על ידי גורם של נפח assay הכולל / נפח טעון. המשך האמור לעיללדוגמה, להכפיל את כל הספירות על ידי 1.5, או 30/20. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב הפעילות הספציפית של קינאז assayed: סה&quot;כ CPM ב assay) / (cpm / pmol ATP) / (זמן assay בדקות) / (כמות של kinase ב מ&quot;ג) הערה: חלוקת הערך הנ&quot;ל ב -1,000 תשואות הפעילות הספציפית בננו-מולים / דקה / מ&quot;ג </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב כמה מולס של פוספט משולבים לתוך המצע (כל עוד המשקל המולקולרי שלה ידוע). זה משמש כדי לקבוע את מספר phosphosites על חלבון מסוים לאחר התגובה יש הלך להשלמה. סך כל cpm assay) / (cpm / pmol ATP)] / (כמות של המצע ב pmols) </li></ol>

<ol><li>Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+and+properties+of+MAPKs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Differential regulation and properties of MAPKs.</a> Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).</li>
<li>Wellbrock, C., Arozarena, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Complexity+of+the+ERK%2FMAP-Kinase+Pathway+and+the+Treatment+of+Melanoma+Skin+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 33(2016).</li>
<li>Yang, T., Terman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+PKA-Mediated+Phosphorylation+of+Plexin+Using+Purified+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins.</a> Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).</li>
<li>Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-radioactive+method+for+the+assay+of+many+serine%2Fthreonine-specific+protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases.</a> Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).</li>
<li>Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array-based+fluorescence+assay+for+serine%2Fthreonine+kinases+using+specific+chemical+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction.</a> Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harbor Protocols. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/">http://cshprotocols.cshlp.org/</a> (2016).</li>
<li>Dalby, K. N. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja9856856">Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology.</a> J Am Chem Soc. 121 (51), 12215(1999).</li>
<li>Roland, J. Coomassie Staining and Destaining. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html">http://www.cytographica.com/lab/protocols/gel_destain.html</a> (2007).</li>
<li>Autoradiography. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography">https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography</a> (2011).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22">The Protein Protocols Handbook</a>. , 3 edn, Humana Press. (2009).</li>
<li>Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WNK1%2C+a+novel+mammalian+serine%2Fthreonine+protein+kinase+lacking+the+catalytic+lysine+in+subdomain+II%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II.</a> J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).</li>
<li>McReynolds, A. C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.biochem.6b00096">Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding.</a> Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).</li>
<li>Carlson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+discovery+of+ERK2+substrates+identifies+ERK-mediated+transcriptional+regulation+by+ETV3%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3.</a> Sci Signal. 4 (196), rs11(2011).</li>
<li>Courcelles, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoproteome+dynamics+reveal+novel+ERK1%2F2+MAP+kinase+substrates+with+broad+spectrum+of+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions.</a> Mol Syst Biol. 9, 669(2013).</li>
<li>Myers, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Screening+and+Hit+Validation+of+Extracellular-Related+Kinase+5+%28ERK5%29+Inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors.</a> ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

קינאזות הם משפחה מגוונת של חלבונים אשר התפתחו פונקציונליות נרחבת בהקשרים רבים, מבחני קינאז כבר שימושי מאוד בחקר חלבונים איתות כמה תרמו רבות להבנתנו הנוכחית של התקשורת הסלולרית. יש לציין, אותו assay הבסיסי שימש אפיון שני קינאזות שונות למרות הבדלים גדולים במבנה ופעילות. קינאז WNK1 מכיל כיס קטליטי לא טיפוסי שבו ליזין קריטי עברה לתפקיד ייחודי ידוע לשחק תפקידים של cotransporters קטיון כלוריד דרך שתי פונקציות kinase ו פיגומים. פעילות הקינאז של WNK1 ידועה כמספר מחזור נמוך, אפילו על המצעי...

קינאזות חלבון הן אנזימים מתוחכמים קריטיים להעברת אותות סלולריים לתגובות הולמות 1 . בהתחשב בתפקידים שלהם בשמירה על הומאוסטזיס ומניעה או קידום של מצבי מחלה 2 , שיטות ביוכימיות להערכת פעילות קינאז ממשיכות להיות כלים רבי עוצמה לתיאור הפרטים של איתות אוקריוטי 3 . למרות אסטרטגיות ניצול נוגדנים ספציפיים phospho כבר אינפורמטיבי מאוד במונחים של מדידת ההשפעות של תנאי טיפול שונים על מצב איתות תא 4 , assay קינאז מאפשר למדוד את ההשפעות של תנאי טיפול שונים ישירות במונחים של פעילות אנזימטית של קינאז של ריבית. אמנם יש מספר אפשרויות עבור מבחני דומים שאינם משתמשים בחומרים רדיואקטיביים 5 , אנו ממשיכים להסתמך על שיטה זו quantitation חזק של תוצאות. שםהם שני יישומים טיפוסיים של assay זה, שניהם בעלי ערך מסיבות שונות: assay immunoprecipitated (IP) קינאז ( איור 1 ) ואת assay חלבון רקומביננטי קינאז ( איור 2 ). Assay IP Kinase הוא שימושי מאוד עבור זיהוי גורמים המסוגלים להפעיל קינאזות חלבון ספציפיים, כמו גם לאמוד תנאי טיפול מעכב. בקצרה, קינאז אפיטופ מתויג של עניין הוא transfected לתאי eukaryotic תרבותי, נתון למגוון של טיפולים, immunoprecipitated, assayed על היכולת לשלב פוספט radiolabeled לתוך מצע מודל ( למשל myelin בסיסי חלבון (MBP)). Assay IP kinase יכול להתבצע גם מבלי להזדקק overexpression, או על ידי immunoprecipitation של חלבון אנדוגני או כל מספר של טכניקות עריכת הגנום. בגלל טיפולים מנוהלים בתרבות, שיטה זו יכולה לזהות גירויים המועברים באמצעות גורמים במעלה מרוביםאו מסלולים מקבילים על ידי readout במבחנה . אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו היא כי היא אינה דורשת ידע מוקדם של גורמים במעלה או במורד הזרם ישיר או אתרי זרחן בו. יתר על כן, לאחר מצעים ספציפיים עבור קינאז של עניין זוהו, אותו פרוטוקול assay קינאז ניתן להשתמש עם רכיבים רקומביננטי למדוד פעילות ספציפית כלפי מצעים טבעיים לזהות אתרי זרחן ספציפיים בשילוב עם ניתוח ספקטרומטריית מסה. אתרים המזוהים בצורה זו ניתן לאמת עוד עם מבחני קינאז ניצול מוטציות המצע. לבסוף, שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לזהות ולמדוד autophosphorylation. פרוטוקול בתנאי כאן מניח או מטוהרים חלבון אופטימיזציה או שיטת transfection להביע קינאז מתויג זיקה של עניין בתרבית תאים. לקבלת תערוכות מפורטות יותר של transfection, תמוגה, immunoprecipitation, ואת חלבון טיהור מגןOcols, אנו מציעים להתייחס פרוטוקול הקרה האביב הארבור 6 . לקבלת מידע נוסף לגבי פיתוח assay ושינוי, עיין פרוטאין זרחון: שיטות נבחרות אנזימולוגיה 7 .

<table><tbody><tr><td>חלבון A Sepharose CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radiolabeled [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Radioactive Shielding</td><td>Research Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 color (Coomassie)</td><td>תרמו פישר</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 3 נייר סינון איכותי</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>מייבש ואקום ג'ל לוח</td><td>Bio-Rad</td><td>דגם 583 מייבש ג'ל #1651745&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סמן Autorad</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>סרגל זרחני</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>נקודות זרחניות</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>מונה גייגר</td><td>Ludlum</td><td>דגם 3 עם גלאי</td><td></td>44-9</tr><tr><td>קלטת BioMax 8 x 10 אינץ'</td> <td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Film 8 אינץ' x 10 אינץ'</td> <td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Intensifying Screen 8 אינץ' x 10 אינץ'</td> <td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>מעבד סרטים רפואי/רנטגן</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>נוזל נצנוץ</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>בקמן LS 6500 מונה נצנוץ</td><td>בקמן</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

assaying חלבון פעילות עם kinase radiolabeled

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

קינאזות חלבונים מסוגלים לשלוט בשינויים תאיים בקנה מידה גדול בתגובה למערכים מורכבים של גירויים, ומאמץ רב הופנה לחשוף פרטים אלסטריים של הרגולציה שלהם. קינאזות הן רשתות איתות אשר פגמים הם לעתים קרובות סימני ההיכר של צורות רבות של סרטן ומחלות נלוות, מה שהופך פלטפורמת assay מקובל מניפולציה של גורמים רגולטוריים במעלה הזרם ואת האימות של דרישות התגובה קריטי בחיפוש אחר טיפול משופר. כאן, אנו מתארים assay קינאז בסיסי שניתן להתאים בקלות כדי להתאים שאלות ניסיוניות ספציפיות, כולל אך לא מוגבל לבדיקת ההשפעות של סוכני ביוכימי ופרמקולוגי, מניפולציות גנטיות כגון מוטציה ומחיקה, כמו גם התנאים תרבות התא וטיפולים בדיקה מנגנוני איתות תא. Assay זה מנצל radiolabeled [γ- 32 P] ATP, המאפשר השוואות כמותיות הדמיה ברורה של התוצאות, והוא יכול להיות modאם נעשה שימוש עם קינאז immunoprecipitated או רקומביננטי, מצעים ספציפיים או מאופיינים, בכל רחבי מגוון רחב של תנאי תגובה.

WNK1 IP מבחני kinase Myc- מתויג WNK1 היה transfected לתוך תאים HEK293 ו immunoprecipitated עם נוגדן אנטי Myc 11 . פעילות immunoprecipitate immunoprecipitate כלפי המודל המצע MBP כמו גם כלפי עצמו ( איור 1 א ). מוטציות WNK1 נבדקו אז עבור פעילות kinase לכיוון MBP באותה שיטה, הפעם העסקת GST-tagged בונה ( איו...

קינאזות חלבון מתפתחות מאוד אנזימים איתות פיגומים קריטיים עבור התמרה אות בין תאיים בין תאיים. אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות קינאז באמצעות שימוש ב- triposphate אדנוזין רדיולאבל ([γ- 32 P] ATP), שיטה אמינה לסיוע בהבהרת רגולציה של אותות סלולריים.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

המטרה הכוללת של בדיקה זו היא למדוד את הפעילות האנזימטית של פרוטאין קינאזים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום השילוח של קינאזים, כגון מידת הפעילות של קינאז או מוטציה של קינאז, הספציפיות שלו, והאם פעילותו רגישה לטיפולים תאיים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא רב-גונית וכמותית כאחד.את הפרוצדורה ידגים סטיב סטיפק (Steve Stippec), מדען מחקר במעבדת Cobb בעל ניסיון רב במסה זו. להתחלה, הוסיפו 2 µL של נוגדן בריכוז 1 mg/mL ל-200 µL של ליזאט תאים והדגירו בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת תוך כדי נדנוד. שטפו חרוזי Protein A-Sepharose פעמיים עד שלוש פעמים על ידי הוספת בופר ליזיס, ולאחר מכן ביצעו ספינטדאון בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 שניות עד דקה ב-5000 ×g, הסירו את העלייה באמצעות פיפטה והשביו את החרוזים לסuspended בבופר.בשלב הבא, הוסיפו לליזאטים 30 µL של תערובת (slurry) בריכוז 50% של חרוזי Protein A-Sepharose ובאפר ליזיס. הדגירו את הליזאטים בטמפרטורה של 4 °C למשך שעה אחת תוך כדי נדנוד. בצעו ספין קצר (Touch spin) בטמפרטורה של 4 °C כדי לשקיע את החרוזיים והסירו את הנוזל העליון (supernatant).שטפו את החרוצים שלוש פעמים עם 1 mL של תמיפת שטיפת חרוצים (bead wash buffer), ולאחר מכן בצעו סבוב קצר (touch spin), ואז שטפו את החרוצים פעם אחת עם תמיפת ריאקציה של kinase בריכוז 1X. לאחר סבוב קצר, הסירו כמה שיותר מהתמיפר מבלי להסיר את החרוצים. כדי להתחיל את הבדיקה, הוסיפו את כל תערובת התגובה לדגימת ה-kinase.דגרו את התגובה בטמפרטורה של 30 °C למשך חמש דקות עד שעה, בהתאם לפעילות הקינאז הנבדק. הפסיקו את התגובה על ידי הנחתה על קרח והוספת 7.5 µL של בופר דגימה Laemmli בריכוז five X, ולאחר מכן חממו את התגובה בטמפרטורה של 100 °C למשך שלוש עד חמש דקות בבלוק חימום. לאחר ספינור קצר (touch spin) של הדגימה, טענו 20 µL לכל באר לג'ל SDS-PAGE בריכוז 10% עד 15%.יש לוודא שמכשיר הג'ל ממוגן כדי להגביל את החשיפה ל-phosphorus-32, כיוון שמדובר בפולט בטא בעל אנרגיה גבוהה. הרצו את הג'ל למשך זמן מספיק כדי להפריד בין הקינאז למצע. לאחר ההרצה, הוציאו את הג'ל מלוחות הזכוכית והאלומיניום, ולאחר מכן הניחו את הג'ל ב-50 milliliters של צבע Coomassie למשך שעה אחת על מנער אורביטלי המכוון ל-50 RPM.עבור שלב זה, השתמשו במכל הגדול מעט מהג'ל עצמו. כדי לבצע הסרת צבע מהג'ל, העבירו אותו מהצבע לתמיסת הקיבוע. הניחו חתיכות ספוג או מגבוטי מעבדה קשורים במכל יחד עם הג'ל כדי לספוג את צבע ה-Coomassie.יש לנדנד את הג'ל ב-600 עד 700 milliliters של תמיסת קיבוע למשך הלילה במנער אורביטלי במהירות של 50 RPM. למחרת, יש להוציא את הג'ל מתמיסת הקיבוע ולהשרייתו ב-200 milliliters של methanol למשך דקה עד שתי דקות תוך כדי ערבוב עדין, עד שהג'ל הופך ללבן חלבי. פעולה זו תסייע במניעת סדקים במהלך שלב הייבוש.בשלב הבא, הרטיבו פיסת נייר סינון איכותי בגודל של כ-14 סנטימטר על 14 סנטימטר במתנול והניחו אותה על מכשיר לייבוש ג'לים בוואקום (slab gel vacuum dryer). הניחו את הג'ל על נייר הסינון, כאשר הצד הקדמי פונה כלפי מעלה. כסו בזהירות את הג'ל בניילון נצמד, לאחר מכן הפעילו את המייבש ושאיבת הוואקום.ברגע שהתקבל ואקום, לאחר שניות ספורות בלבד, גלגלו בועות אוויר החוצה באמצעות רולר גומי רך (brayer). המשיכו בהרצה למשך 90 דקות. הוציאו את הג'ל המיובש והצמידו סמן אוטורדיוגרפיה, כגון סרגל פוספורסצנטי או נקודה, לנייר המסנן בצד הג'ל, והניחו אותו בקסטה המכילה מסך הגברה.השתמשו במונה גייגר כדי לבדוק את עוצמת האות. עבור אותות חלשים יותר, חשיפה בטמפרטורה של minus 70 degrees Celsius עד minus 80 degrees Celsius עם מסך הגברה תגדיל את צפיפות פס הסרט. בחדר חשוך, הניחו פיסת סרט על הג'ל היבש בתוך קסטת הסרט המכילה מסך הגברה.אם ספירת ה-CPM היא 100 או פחות, נסו חשיפה למשך לילה בטמפרטורה של 70- עד 80- מעלות צלזיוס. לחלופין, אם הספירה קרובה יותר ל-10,000, התחילו בחשיפה של שעה אחת ובצעו אופטימיזציה משם. עם סיום החשיפה, הוציאו את הסרט לפני פיתוחו במעבד סרטי רנטגן או מעבד סרטים רפואי.סמנו על הסרט את הפסים המתאימים לסטנדרטי הפרוטאין. כמו כן, סמנו את סטנדרטי הפרוטאין ואת נתיבי התגובה לצורך התייחסות עתידית. גזרו מהג'ל את הפסים המתאימים לפסי העניין המופיעים על הסרט.העבירו את הפסים לבקבוקוני נצנוץ של 7 mL והוסיפו 4 mL של נוזל נצנוץ. מדדו את הפסים באמצעות מונה נצנוץ נוזלי. ודאו כי המונה מוגדר לניטור חלון ספקטרום האנרגיה הנכון עבור phosphorus-32.יש להמשיך בניתוח התוצאות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. פרקציונים מטוהרים של ERK2 שימשו בבדיקת קינאז עם MBP בנוכחות או בהיעדר MEK1R4F, מעורר פעיל קונסטיטוטיבית של פעילות קינאז של ERK2. בניסוי דומה, בדיקת קינאז MBP שימשה למדידת פעילות של מוטנטים רקומביננטיים של ERK2 שטוהרו מתרביות חיידקים ביחס לחלבון מסוג בר. למרות ש-ERK2 היה מסוגל לבצע פוספורילציה של MBP כאשר עורר על ידי MEK1R4F, פעילות הקינאז של ERK2 נמחקת באופן דרמטי על ידי מוטציה בליזין הקטליטי או בתראונין הסמוך לאתרים הקנוניים של פוספורילציה כפולה. ERK2 T188D ו-ERK2 T188E מראים פעילות קינאז שולית כלפי פפטיד גמיש קטן. עם זאת, הם אינם מסוגלים לבצע פוספורילציה חזקה של סובסטרטים ידועים של ERK2, Nup153 ו-PDX1, כפי שנראה עם ERK2 מסוג בר (wild type).ברגע שתשלטו בטכניקה זו, ניתן יהיה לבצעה ביום אחד עד יומיים אם היא תבוצע כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של אופן השימוש ב-ATP מסומן רדיואקטיבית כדי לבחון את הפעילות של פרוטאין קינאזות, במטרה להבין טוב יותר את רשתות השליחויות שבהן הן פועלות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע אופטימיזציה לפרוטוקול שיקוע החומצות האמינויות עבור השקיעה (pull down) של הקינאזות הרלוונטיות, כדי להבטיח כמויות חלבון שוות, ולמדוד את ריכוזי החלבון הרקומביננטי כדי להבטיח השוואות מדויקות של פעילות הקינאזות.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום העברת אותות בתאים לחקור מסלולי התמרה ספציפיים ואת תפקידם בבקרת ההומאוסטזיס, כמו גם את תרומתם להתקדמות מחלה. זכרו כי עבודה עם חומרים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מגן אישי, בעת ביצוע הליך זה.

assaying-protein-kinase-activity-with-radiolabeled-atp

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

קינאז leucine חזור ריץ' 2 הוא קינאז multidomain גדול, מוטציות שהן הגורם הגנטי השכיח ביותר של מחלת פרקינסון. ניתוח של פעילות קינאז של החלבון הזה הוכיחה להיות כלי חיוני בהבנת הביולוגיה תפקוד של חלבון זה. במאמר...

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

את ההשפעות של הפעלה של קינאז isozymes חלבון C (PKC) על תפקוד המיטוכונדריה קשורים בנשימה וזרחון חמצונים ועל כדאיויות תא מתוארות. הגישה מסתגלת טכניקת adenoviral סלקטיבי overexpress isozymes PKC בתרבית תאים ראשוניים ומגוון של מבחנים כדי לקבוע פונקציות המיטוכונדריה ומצב אנרגיה של התא.

הערכה של פונקציות מיטוכונדריאלי וכדאיויות תא בתאי כלית overexpressing חלבון קינאז C Isozymes

סרטון זה מדגים בדיקת אנזים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה כדי לקבוע את פעילות פירופוספוקינאז באמצעות נוקלאוטידים בעלי תווית רדיו. השיטה מספקת תובנות לגבי סינתזת נוקלאוטידים ותגובות פוספוטרנספורט.

בדיקת פעילות אנזימים מבוססת כרומטוגרפיה בשכבה דקה: טכניקה לקביעת פעילות פירופוספוקינאז במבחנה באמצעות כרומטוגרפיה של שכבה דקה

קינאזות אוצין העשיר החוזרת 1 ו -2 (LRRK1 וLRRK2) הם חלבוני multidomain אשר לקודד שני GTPase ותחומים קינאז ואשר פוספורילציה בתאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתייג LRRK1 וLRRK2 בתאים עם 32 orthophosphate P, ובכך לספק אמצעים כדי למדוד את רמות phophorylation הסלולרי הכוללות שלהם.

מטבולית תיוג של אוצין עשיר חזור קינאזות 1 ו -2 עם רדיואקטיבי פוספט

כאן אנו מתארים מבחנים ביוכימיים שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין אנזימים לעיצוב מחדש של כרומטין תלויי ATP על יכולותיהם 1) לזרז החלקה של נוקלאוזום תלוי ATP, 2) לעסוק במצעי נוקלאוזום, ו-3) הידרוליזה של ATP באופן תלוי נוקלאוזום או DNA.

מבחני ביוכימיים לניתוח פעילויות של ATP תלוי הכרומטין שיפוץ אנזימים

אנו מתארים פרוטוקול בסיסי לכימות פעילות ATPase במבחנה. ניתן לבצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה על סמך רמת הפעילות והדרישות עבור ATPase מטוהר נתון.

מדידה<em&gt; במבחנה</em&gt; פעילות ATPase עבור אנזימתי אפיון

אנו מדווחים ומדגימים בדיקת קשירת ניטרוצלולוז אופטימלית שניתן להשתמש בה כדי לכמת זרחון עצמי של היסטידין קינאזות חיידקיות מטוהרות. לשיטה שלנו מספר יתרונות על פני טכניקות מסורתיות מבוססות SDS-PAGE, המספקות אלטרנטיבה חשובה לאפיון חלבונים חשובים אלה.

כימות של חיידקי היסטידין קינאז autophosphorylation באמצעות Assay כריכה Nitrocellulose

מבחני תחרות פפטיד נמצאים בשימוש נרחב במגוון של ניסויים מולקולריים וחיסונית. מאמר זה מתאר שיטה מפורטת עבור המבחנה oligopeptide- מתחרה assay קינאז ואת הליכי אימות הקשורים, אשר עשוי להיות שימושי כדי למצוא אתרי זרחן ספציפיים.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

אנו מאופיינים חלבון קינאז חדש באמצעות גישות ביוכימיים חזקים: ניתוח כתמי אבן מערבית עם נוגדן ספציפי ייעודי על קווי תאים שונים ורקמות, אינטראקציות על ידי ניסויים coimmunoprecipitation, הפעילות של קינאז שזוהו על ידי המערב כתם באמצעות נוגדן ספציפי פוספהו ועל ידי γ [32P] ATP תיוג.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

פרוטוקול זה מתאר תסה לא רדיואקטיבית כדי למדוד פעילות קינאז של קינאז פולינוקלאוטיד (PNKs) על מצעי DNA ו RNA קטנים.

תרגום לא רדיואקטיבי למדוד פוספורילציה פולינוקלאוטיד של מצעי נוקלאוטיד קטנים

למדו לבצע מדידה כמותית של פעילות קינאזות חלבון באמצעות ATP מסומן ברדיואקטיביות. פרוטוקול זה מאפשר הערכת ספציפיות קינאזות והשפעת טיפולים תאיים על פעילותן.

Assaying חלבון פעילות עם Kinase Radiolabeled

גלה סרטונים נוספים