Name: זברה באתרו הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: למד הכנת בחוט השדרה בזברה דניו רריו לרישום אלקטרופיזיולוגי של נוירונים ספינליים בשלבי עובר ופגה. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד נוירונים בתוך הרקמה החיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של NIH (F32 NS059120 כדי RLM ו- R01NS25217 ו P30NS048154 כדי ABR).

החוקרים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטות שתוארו כאן לאפשר אפיון חשמל מורפולוגי של נוירונים החושי והמוטורי של עוברי דג הזברה לאחר דיסקציה מינימלי של חוט השדרה. נוירונים להישאר בריאים במשך לפחות 1 h, מגבלת הזמן שהוטלה על ההקלטות הללו. נוירונים תועדו באמצעות התצורה כל התא הסטנדרטי, כמו גם מן הטלאים גרעיניים; השיטה השנייה ממזערת בעיות בחלל מהדק שיכול למנוע מחקר ביופיסיקליים מפורט של זרמי יון 9. אתגר חשוב הוא להשיג את הקובץ מצו...

<html> ג&#39;ורג Streisinger חלוץ בשימוש Danio rerio, הידוע בכינויו דג הזברה, כמערכת מודל לניתוח גנטי של התפתחות החולייתנים 10. המודל מציע מספר יתרונות ובהם: (1) יחסית גידול בעלי חיים פשוט וזול; (2) הפריה חוץ, המאפשר גישה קלה עוברים מן שלבי ההתפתחות המוקדמים; ו (3) העובר שקוף, המאפשר תצפיות ישירות חוזרות ונשנות של תאים, רקמות, ואיברים כפי שהם יוצרים. במשך העשורים שלאחר מכן, מספר התקדמויות נוספות הגדילו את כוחו של המודל דג הזברה. בפרט, מסכי גנטי קדימה מאמצים רצף שלם-בגנום מילאו תפקידי מפתח לזיהוי מוטציות בגנים קריטי לתהליכים התפתחותיים רבים 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, 16. שיטות שיבוט Gateway אפשרו היישום השיגרתי של מהונדס מתקרב 17, 18. התקדמות העריכה בגנום, שהודגמה על ידי מפעיל דמוי שעתוק (TALENs) ומתקבצות בקביעות interspaced חזרות palindromic קצרות (קריספר) -Cas9 nucleases, לאפשר את כניסתה של מוטציות הממוקדות, וכן נוק-אאוט ולהפיל-בגישות 19, 20, 21, 22. משולבים, שיטות אלה להפוך דג זברה כמודל עצמה לחקר המנגנונים הגנטיים הבסיסיים התנהגויות מסוימות ומחלות אנושיות מספר 23, 24, 25, 26, 27. עבודה זו מתמקדת בפיתוחתקנה נפשית ואת התפקיד של פעילות חשמלית התפתחות עצבית. הדגש הוא על חוט השדרה, עבורו מודל דג הזברה מספק מספר יתרונות. ראשית, קל יחסית לגשת דג זברה בשלבים עובריים זחל; לפיכך, אפשר ללמוד לתפקד חוט שדרה במהלך שלבי התפתחות שיש פחות תאי עצב ומעגלים פשוטים 28, 29. יתר על כן, בחוט שדרת דג הזברה יש קבוצה מגוונת של נוירונים, בדומה חוליות אחרות, כפי שהוכח על ידי תבניות אופייניות ו היכר של שעתוק גורמי 30, 31, 32, 33, 34, 35. רוב המחקרים דג הזברה שמטרתם לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס פונקציה של מעגלים בחוט השדרה, במיוחדאלה שתומכים תנועה, ממוקדים באופן מובן על שלבי הזחל 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. עם זאת, רבים של נוירונים היוצרים את רשתות קטר השדרה ליזום בידול שלהם בשלבים עובריים מוקדמים, ~ 9-10 שעות לאחר ההפריה (hpf) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. לאור זאת, ההבנה כיצד המאפיינים המורפולוגיים וחשמליים של נוירונים שדרה להתעורר ולהשתנות בין השלבים העובריים זחל חשוב עבור overaהבנת ll של היווצרות מעגל תנועה ותפקוד. שיטות לנתיחה המתוארת כאן לאפשר הצמד תיקון הקלטות מתא עצב השדרה יושמו בהצלחה בשלבים עובריים (~ 17-48 hpf) ואת שלבי הזחל (~ הפריה 3-7 ימים שלאחר [DPF]). גישה זו מגבילה את כמות דיסקציה נדרש לספק גישה נוירונים של עניין. הפרוטוקול שונה ממרבית השיטות שפורסמו אחרים להקלטה מתא עצב שדרת דג זברה כי דבק תפר הווטרינר משמש, ולא סיכת טונגסטן בסדר, לצרף את העובר או זחל לתא ההקלטה. הזמינות של שתי גישות שונות (כלומר, דבק תפר מול סיכת טונגסטן) להרכבת עוברי דג הזברה או זחלים לניתוח אלקטרו מספקת לחוקרים עם אפשרויות חלופיות כדי להשיג מטרות הניסוי הספציפיות שלהם. ראשית, נהלים לגישה והקלטה של ​​פופ<html> ulation של עצב סנסורי עיקרי, תאי Rohon-בירד, מתוארים. גופי התא של הנוירונים האלה נמצאים בתוך חוט השדרה הגבי. תאי Rohon-בירד קיימים מינים בעלי חוליות רבים, להבדיל מוקדם בהתפתחות, והם עומדים ביסוד בתגובה למגע העוברי 6, 44, 47, 48. שנית, נהלים לגישה והקלטה מן הנוירונים המוטוריים השדרה מפורטים. הנוירונים מוטורי שדרת זברה להתעורר במהלך שני גלים של נוירוגנסיס. הנוירונים המוטוריים העיקריים מוקדם היליד להתעורר בסוף gastrulation (~ 9-16 hpf), עם רק 3-4 הנוירונים מוטוריים העיקרי כיום לכל hemisegment 45, 46, 49. לעומת זאת, האוכלוסייה מאוחר היליד של הנוירונים מוטוריים משניים היא יותר רבה מתעוררת במהלך תקופה ממושכת, החל מהשעה ~ 14 hpfEF &quot;&gt; 45, 50. בראשית משניים הנוירון המוטורי בפלחי-הגזע באמצע תושלם ברובה על ידי 51 hpf 50. הנוירונים המוטוריים משניים נחשבים המקבילה של הנוירונים המוטוריים ב אמניוטים 46. מעניין, נוירונים supraspinal, באמצעות דופמין, לווסת תנועה הזחל וג&#39;נסיס הנוירון המוטורי משנית בעובר ו זחל צעיר 50, 51. הנוירונים המוטוריים יסודי ותיכון אחד המרכיבים תת שונים. כל הפרויקטים תת הנוירון המוטורי העיקרי האקסון היקפי כי innervates קבוצת שרירים אופיינית, וכתוצאה מכך סטריאוטיפי, זיהוי מסלול אקסונלית. באופן כללי, הנוירונים מוטוריים משני לעקוב אחר מסלולי אקסונלית הוקמו בעבר על ידי נוירונים מנוע עיקריים. לפיכך, בהתייחס מסלולי אקסונלית, הנוירונים מוטוריים יסודיים ותיכון דומים, למעט כי עובי אקסונים ו somata בגודלמחדש יותר עבור הנוירונים מוטוריים עיקריים 45. שלישית, שיטות הקלטה מכמה סוגים של interneurons נדונות. עם זאת, במקרים אלה, כמות מוגבלת של הסרת תאים בחוט השדרה אחרים נדרשת, ובכך חוט השדרה הוא פחות שלם יותר להקלטות מתאי Rohon-בירד או הנוירונים המוטוריים.

<table><tbody><tr><td>מסנן ואקום/בקבוק אחסון, 0.22 מ"מ נקבוביות</td> מסנן מזרק <td>431096</td><td></td><td>קורנינג</td></tr><tr><td>0.2 מ"מ</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאנסולפונאט&nbsp;</td></tr><tr><td>&alpha;-bugarotoxin</td><td>Tocris</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>טטרודוטוקסין</td><td>Tocris</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-549 מלח הידרזין</td><td>בדיקות מולקולריות</td><td>A-10438</td><td>צבע פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>מסנן צינור צנטריפוגה Spin-X</td><td>קורנינג</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ זכוכית</td><td>פישר</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>סיליקון סילגארד ערכת אלסטומר</td><td>דאו קורנינג</td><td>184</td><td>סיליקון אלסטומר</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>פלקון</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט נימי זכוכית</td><td>הרווארד מנגנון הרווארד</td><td>30-0038</td><td>קוטר פנימי וחיצוני של 0.78 ו -1.0 מ"מ (נימי זכוכית דקים)</td></tr> <tr><td>נימי זכוכית בורוסיליקט</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>קוטר פנימי וחיצוני של 1.13 ו-1.55 מ"מ (נימי זכוכית עבים)</td></tr><tr><td>אביזר פוליפרופילן דוקרני מיניאטורי&nbsp;</td><td>קול-פאלמר</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>דבק רקמות Vetbond&nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>חולץ מיקרואלקטרודות</td><td>Sutter Instruments</td><td>&nbsp; דגם P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מגבר</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>שלב ראש</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>מיקרומניפולטור ממונע&nbsp; &nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Tygon צינורות</td><td>פישר</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 אינץ', OD 1/8 אינץ' וקיר 1/32 IN (צינורות מעבדה גמישים)</td></tr><tr><td>מחזיק אלקטרודה</td><td>התקנים מולקולריים</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal תלת כיווני פקקים&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0.80W Achroplan המטרה</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לאיסוף וניתוח נתונים&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex ו- Clampfit&nbsp;</td></tr><tr><td>מושך מיקרופיפטה</td><td>Sutter Instruments</td><td>דגם P-97</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">פתרונות ניתוח והקלטה (במ"מ)</חזק></td></tr><tr><td>כל התמיסות, למעט התוך-תאי, יציבות למשך ~2-3 חודשים כאשר הן מסוננות (כוסות סינון 0.22 מ"מ) ומאוחסנות בטמפרטורת החדר (RT).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>התמיסה התוך-תאית מסוננת (מסנני מזרק 0.2 מ"מ) ומאוחסנת קפואה (-20 ו-deg; ג) בכמויות קטנות המופשרות בנפרד ביום השימוש.&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דיסקציה/צלצול תמיסת</td><td></td><td></td> s <td>145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (עם NaOH)</td></tr><tr><td>תמיסת</td><td></td><td></td> הקלטה פיפטה (תוך-תאית) <td>135 KCl, 10 חומצת EGTA, 10 HEPES; pH 7.4 (עם KOH).</td></tr><tr><td>תמיסת הקלטה/מתח ומהדק זרם לאמבטיה (חוץ-תאית) 125</td><td></td><td></td><td>NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (עם NaOH).</td></tr><tr><td>Alexa-594 תמיסת מלאי מלח הידרזין.&nbsp;</td><td></td><td></td><td>הכן מלאי של 13.2 מ"מ ב-ddH2O, aliquot (~100 &micro; l) ולאחסן ב-20 מעלות צלזיוס. לשימוש, יש לדלל את הציר שנמסר פי 132 עם תמיסת פיפטה לריכוז סופי של 100 מ"מ. לאחר הדילול, סנן את תמיסת הפיפטה המכילה Alexa-594 &nbsp; עם פילטר צינור צנטריפוגה.</td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>חומרים משתקעים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4% אתיל 3-אמינובנזואט מלח מתאן סולפונאט (טריקאין)</td><td></td><td></td><td>הכינו תמיסת מלאי של 0.4% ב-0.2 מ' טריס, pH 9 (0.4 גרם טריקאין/100 מ"ל 0.2 מ' טריס</td></tr><tr><td colspan="4">התאם את ה-pH ל-7 עם NaOH ואחסן ב-20 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td colspan="4">לשימוש, יש לדלל את תמיסת המלאי ~ 25 פעמים במדיה עוברית</td></tr><tr><td>250 מ"מ &alpha;-bungarotoxin</td><td></td><td></td><td>הכן מלאי של 250 מ"מ ב-ddH2O (1 מ"ג/500 מ"ל), הכן 100 ומיקרו; L aliquots, ו-sotre ב-20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">לשימוש יש לדלל פי 2,500 בתמיסה חוץ-תאית לריכוז סופי של 100 ננומטר.</td></tr><tr><td>1 מ"מ טטרודוטוקסין</td><td></td><td></td><td>מכינים מלאי של 1 מ"מ ב-ddH2O (1 מ"ג/3 מ"ל), מכינים 100 ומיקרו; L aliquots, ו-sotre ב-20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">לשימוש יש לדלל פי 2,000 בתמיסה חוץ-תאית לריכוז סופי של 500 ננומטר.</td></tr></tbody></table>

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

הזברה, הוצג לראשונה כדגם התפתחותית, זכו לפופולריות בתחומים רבים אחרים. ההקלות של גידול במספר גדול של אורגניזמים המתפתח במהירות, בשילוב עם הבהירות האופטית העוברית, שמשו תכונות משכנעות ראשוניות של הדגם הזה. במהלך שני העשורים האחרונים, את ההצלחה של המודל הזה כבר מונע יותר על ידי המוכנות שלה למסכי mutagenesis בקנה מידה גדולה ועל ידי הקלות של transgenesis. לאחרונה, גישות לעריכת הגן הרחיבו את כוחו של המודל. עבור מחקרים נוירו-התפתחותיות, עובר זחל דג הזברה לספק מודל שאליו מספר שיטות ניתן ליישם. כאן, אנו מתמקדים שיטות המאפשרות חקר נכס מהותי של נוירונים, רגישות חשמלית. ההכנה שלנו לחקר אלקטרו של נוירונים שדרת דג זברה כרוכה בשימוש דבק תפר וטרינר כדי לאבטח את ההכנה כדי בתא הקלטה. שיטות חלופיות עבור הקלטהמעובר ואת זחלי דג זברה לערב את הקובץ המצורף של ההכנה לתא באמצעות סיכת טונגסטן בסדר 1, 2, 3, 4, 5. סיכת טונגסטן משמשת לרוב כדי להרכיב את ההכנה בכיוון לרוחב, אם כי זה כבר נעשה שימוש כדי לעלות בצד הגבי זחלים עד 4. דבק התפר שמש הר עובר וזחלי הנטיות הן. באמצעות דבק, לנתיחה מינימלי יכול להתבצע, מה שמאפשר גישה הנוירונים השדרה ללא שימוש טיפול אנזימטי, ובכך למנוע כל נזק כתוצאה. עם זאת, עבור הזחלים, יש צורך להחיל טיפול אנזים קצר כדי להסיר את רקמת השריר המקיף את חוט השדרה. השיטות שתוארו כאן שימשו ללמוד את התכונות החשמליות הפנימי של הנוירונים המוטוריים, interneurons, ואת עצב סנסורי בכמה developmentÃl טיולי 6, 7, 8, 9.

הקלטנו בהצלחה מתא עצב Rohon-בירד ב 17 hpf עובר דרך 7 DPF זחלים (איור 5 א ו 5 ב). כאשר תאי Rohon-בירד נרשמו, ההכנה הייתה רכובה עד הגבה-לוואי. הרכבה כזו מאפשרת זיהוי חד משמעי של תאים Rohon-בירד מבוסס על עמדות הגב שטחית שלהם וגדלים סומה גדול. זיהוי הוא אשר גם על ידי פוטנציאל הממברנה מנוחה הסטריאוטיפי hyperpolarized של נוירונים אלה (איור 5, שולחן שיבוץ) 6, <s...

כתב יד זה מתאר שיטות הקלטות אלקטרו מן הנוירונים השדרה של עוברי דג הזברה הזחלים. הכנת שומרת נוירונים באתרו ולעיתים קרובות כרוך דיסקציה מינימום. שיטות אלה מאפשרות לחקר אלקטרו מגוון של נוירונים שדרה, מרכישת רגישויות חשמל הראשונית דרך שלבי זחל מוקדם.

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

המטרה הכללית של הכנה זו היא לאפשר מחקר אלקטרופיזיולוגי של נוירוני ไขสันหลัง (spinal neurons) של זב חברה (zebrafish) in situ בשלבי העובר והזחלים. האנליזות האלקטרופיזיולוגיות משלימות את הגישות הגנטיות ושיטות הדימיון העוצמתיות שניתן ליישם גם במודל של זב החברה. בעוד שהשיטה פותחה במקור למחקר של נוירוני rohon, התאמנו את הגישה בקלות עם הזמן וכעת אנו יכולים לחקור סוגים שונים של נוירוני ไขสันหลัง.את הפרוצדורה תדגים ד"ר Rosa Moreno, עמיתה למחקר, איתה הייתה לי הזכות לשתף פעולה במשך שנים רבות. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, הסיר את הנורה השחורה מחור זכוכית אחד, והחלף אותה במתאם גומי לבן מחור זכוכית אחר. לאחר מכן, חתוך חתיכה של צינור גמיש לאורך של כ-38 סנטימטרים.לאחר מכן, חברו את הצינור הגמיש באמצעות מחבר פוליפרופילן קטן וישר. כדי להכין את האלסטומר הסיליקוני, הוסיפו את הבסיס ואת חומר ההקשיה לשפופרת קונית מפלסטיק ביחס של ארבעה לאחד. לאחר מכן, ערבבו היטב את בסיס האלסטומר ואת חומר ההקשיה.שפכו את התערובת לשתי צלחוני פטרי בקוטר 100 millimeter, עד לעומק של כ-1 millimeter בצלחון אחד וכ-2.5 millimeter בצלחון השני. השאירו את האלסטומר הסיליקוני להת굳ד בחשיפה לאוויר במשך ארבעה עד חמישה ימים. אם נדרש אלסטומר מוקשח בזמן קצר יותר, דגרו אותו בטמפרטורה של 60 degrees Celsius.לאחר מכן, גזרו מלבן בגודל 3.8 סנטימטר על 6.3 סנטימטר מהאלסטומר המעובד בעובי של מילימטר אחד, שישמש כבסיס של התא. מהסיליקון המעובד בעובי 2.5 מילימטר גזרו מלבן של 3.8 סנטימטר על 6.3 סנטימטר. לאחר מכן, גזרו מתוכו מלבן פנימי של 2.5 סנטימטר על חמישה סנטימטר כדי ליצור מסגרת עבור החלק העליון של התא.כדי להכין את תא הקלטת הנתיחה, הניחו את מלבן הסיליקון הדק ישירות על גבי הפס גלס, תוך הקפדה על הסרת בועות אוויר בין הסיליקון לזכוכית. לאחר מכן, הניחו את מסגרת מלבן הסיליקון על גבי שכבת הסיליקון התחתונה והדקה. בהליך זה, הניחו עובר בתא נתיחה המכיל שני עד שלושה מיליליטרים של תמיסת ringer.קבעו את העובר על ידי הוספת 100 µL של תמיסת tricaine בריכוז 0.4% לתא. לאחר מכן, משכו מספר מיקרו-פיפטות להזרקה בעלות קצוות דקים וארוכים מזכוכית בעלת דפנות דקות באמצעות שחק מיקרו-פיפטות. הצמידו מיקרו-פיפטת זכוכית שנמשכה לרצפת הזכוכית של מתקן הדבק.תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting microscope), השתמשו בפינצטה כדי לשבור את קצה מיקרו-פיפטת הזכוכית, כך שיתקבל קצה בקוטר של כ-75 micrometers. כעת, טענו את מיקרו-פיפטת הזכוכית עם שלושה עד חמישה microliters של דבק על ידי יצירת ואקום באמצעות פיית הפה. הביאו את הקצה המלא בדבק אל תא הניתוח.לאחר מכן, קרב את קצה המיקרופיפט הטעון בדבק אל ראשו של העובר, תוך שמירה על לחץ חיובי קל במיקרופיפט באמצעות צינור הפה. ברגע שהקצה קרוב לראשו של העובר, הפעל לחץ חיובי מספיק כדי להוציא טיפה קטנה של דבק אל קרקעית התא. השתמש בסיכת ניתוח כדי להזיז את העובר לעבר טיפת הדבק, כך שהראש יבוא במגע עם הדבק.כוון את העובר כך שהצד הגבי (dorsal) פונה כלפי מעלה, ולחץ על הראש כדי להבטיח מגע טוב עם הדבק. ככל שהדבק מתקשה לאט, השתמש בסיכת דיססקציה כדי למקם מחדש את העובר כך שהצד הבטני (ventral) פונה כלפי מטה והצד הגבי פונה כלפי מעלה. טבול את סיכת הדיססקציה בטיפת הדבק וגרור מספר פטילי דבק מעל לראש העובר ובחציו כדי להבטיח עוד יותר את מיקומו.לאחר שהראש מחובר בבטחה לסיליקון והדבק התגבש, יש להקריב את העובר על ידי חיתוך רוחבי בגובה המוח האחורי באמצעות מיקרו-פיפטה מזכוכית נוספת. השתמש במיקרו-פיפטה מזכוכית חדשה כדי לחתוך באופן שטחי את העור מספר פעמים במיקום זנבי (caudal) למוח האחורי. נקב את העור באופן שטחי על ידי הזזת הפיפטה בניצב לציר הרוסטרו-קודאלי (rostro caudal) בכל צד של הגו הגוף עבור דגימות המורכבות באופן גבי, או בצד החשוף של הגו הגוף עבור דגימות המורכבות באופן צדי.כדי ליצור לשונית עור שהפינצטה תוכל לתפוס, גרדו את העור מספר פעמים באמצעות המיקרו-פיפט, בגובה החתך הראשוני ובאופן ניצב לו. בעזרת פינצטה, הרימו בהדרגה את לשונית העור ומשכו את העור לכיוון הזנב (caudally). לאחר מכן, טפטפו טיפה קטנה של דבק סמוך לזנב של העובר.השתמשו בדבק זה כדי להצמיד את הזנב לתחתית תא הנתיחה. ככל שהדבק מתקשה, התאימו את מיקום הגו באמצעות סיכת נתיחה כדי להבטיח שהגוף יישאר מופנה לגב (dorsally oriented) ושהוא מחובר בחוזקה לתא. לאחר נתיחה ראשונית זו, שטפו את הדגם היטב בתמיסת Ringer כדי להסיר את ה-tricaine ושאריות, והניחו לדגם לנוח במשך חמש דקות.בשלב הבא, החליפו את תמיסת הנתיחה בתמיסה להקלטה חוץ-תאית. במידת הצורך, הוסיפו למערך חומר המקבע. לאחר מכן, העבירו את תא הנתיחה עם העובר המותקן אל הבמה של מיקרוסקופ אור קומפלקס זקוף, המצויד בעדשה אובייקטיבית של 40X בטבילת מים עם מרחק עבודה ארוך.לאחר מכן, רכבו מיקרו-פיפט עם דופן עבה מזכוכית סיליקט בעלת חור ריק על תומך האלקטרודה של שלב הראש. חברו את הצינורית בקצה אחד ליציאת האוויר של תומך האלקטרודה ובקצה השני לברז תלת-דרכי. לאחר מכן, מקמו פיה בקצה אחד של קטע צינורית נוסף, וחברו אותו לקצה השני של הברז התלת-דרכי.לאחר מכן, הביאו את קצה המיקרו-פיפט לחלק הדורסלי ביותר של חוט השדרה, ונקבו בעדינות את הקרומים (meninges). המשיכו בתנועות צדדיות קצרות ומהירות כדי לשחרר את הקרומים. לאחר שקצה המיקרו-פיפט חדר דרך הקרומים, הניעו והרימו את המיקרו-פיפט כדי להרחיק את הקרומים מחוט השדרה.לאחר מכן, העבירו את המיקרו-פיפטה לכיוון רוסטראלי (קדמי), תוך התקדמות על פני סגמנט חצי (hemi segment) אחד או שניים, כדי לחשוף את תאי שער רוחון (rohon beard cells). מניסיוננו, נוירוני שער רוחון שבירים יותר מנוירונים ספיינליים אחרים. כדי לשמור על בריאותם, אנו חושפים פעם אחת או פעמיים שער רוחון בכל פעם.הקלטות Voltage clamp של זרמים יוצאים ונכנסים התקבלו מנוירוני rohon beard בעוברים וזחלים יום, יומיים ושבעה ימים לאחר ההפריה. פוטנציאל ההחזקה היה 80 millivolts, והזרמים עוררו על ידי שלב דפולריזציה ל-20 millivolts חיוביים. במצב current clamp, הזרקת זרם של 0.35 nano amp למשך millisecond אחד מעוררת פוטנציאל פעולה בודד מנוירוני rohon beard הן בעוברים והן בזחלים.בהיעדר גירוי חשמלי, נוירוני rohon beard אינם מראים פריקה עצבית (spiking) ספונטנית. פוטנציאל המנוחה של נוירוני rohon beard הופך לשלילי יותר ככל שההתפתחות מתקדמת. ברגע ששיטה זו נשלטת, ניתן להרכיב ולבצע דיסקציה לעוברים כדי לחשוף את ה-rohon beards בתוך 10 דקות.כפי שצוין בפרוטוקול, חשוב להבין את הגורמים הקובעים את מהירות התקשות הדבק. סרטון זה מדגיש את השלבים הקריטיים להקלטה מנוירונים של חוט השדרה בדגי zebrafish.

zebrafish-situ-spinal-cord-preparation-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

הזחל דג הזברה לייצג את חוליות first מודל המערכת כדי לאפשר הקלטה סימולטני מהדק תיקון של שריר מוטורי עצבי היעד השדרה השלד. וידאו זה מדגים את שיטות מיקרוסקופיות משמש לזיהוי שווי סגמנטלי מוטורי עצבי שרירים תאים היעד, כמו גם מתודולוגיות עבור הקלטה של ​​כל סוג תא.

מותאמים הצמד תיקון הקלטות מ-מוטור נוירון שרירים יעד השלד דג הזברה

סרטון זה מדגים בדיקה לא פולשנית לחקר אלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה. עם מדידת סליל הזנב בעוברים כתוצאה מדפולריזציה ספונטנית של הנוירונים המוטוריים של חוט השדרה, מוחל חוסם תעלות נתרן כדי להפחית את תדירות הסליל. לאחר מכן, העוברים משותקים באגרוז ומונחים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הנוירונים המוטוריים המהונדסים גנטית מבטאים ביו-חיישן חישת מתח עם תורם ופלואורופור מקבל. ירידה בפליטה פלואורופורית מקבלת מצביעה על ירידה בדפולריזציה הספונטנית של נוירונים מוטוריים עקב חוסם תעלות...

גישה לא פולשנית לחקר האלקטרופיזיולוגיה של נוירונים מוטוריים בעוברים של דגי זברה

סרטון זה מדגים רישום של אותות חשמליים מתאי עצב afferent בזחל זברה משותק על ידי מיקום מיקרופיפטה ליד גנגליון הקו הצידי ויצירת חותם רופף ללכידת אותות. התמיסה החוץ תאית שומרת על הכדאיות העצבית בתהליך זה.

ניטור אותות חשמליים מתאי עצב Afferent בזחל של דג זברה משותק

שיטה פשוטה להקליט פוטנציאלי שדה תאיים במוח הקדמי דג זברת הזחל מתוארת. השיטה מספקת...

הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

פיתחנו הכנת מוח השדרה שלמה כבל כדי להקליט ולעקוב אחר פעילות חשמלית באמצעות הקלטת מהדק תיקון מתאי העצב ותאי מאוטנר reticulospinal אחרים בעוברי דג הזברה. לפיכך, אנו מסוגלים להקליט זרמים מעוררים ומעכבים הסינפטי, פעילות ערוץ מתח מגודרת ופוטנציאל פעולה מתא העצב מרכזי בעובר מתפתחת.

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

תהליכים התפתחותיים כגון התפשטות, דפוסים, בידול, והדרכה האקסון יכולים להיות מודל בקלות בחוט השדרה דג הזברה. במאמר זה, אנו מתארים הליך הרכבה לעוברי דג הזברה, אשר מייעל את ההדמיה של אירועים אלה.

נתיחה והרכבה לרוחב של עוברי דג הזברה: ניתוח התפתחות חוט השדרה

מאמר זה מתאר כיצד יכול להיות משותק דג הזברה מבוגר, מחוברת לצינורות, ומשמש לניסויי in vivo אלקטרו לאפשר הקלטות ומניפולציה של פעילות עצבית בבעלי חיים בשלמותה.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

לאחר חיתוך רוחב השדרה, יש דג הזברה מבוגר התאוששות תפקודית על ידי שישה שבועות לאחר פציעה. כדי לנצל את שקיפות זחל והתאוששות מהירה יותר, אנו מציגים שיטה לtransecting חוט השדרה הזחל. לאחר חיתוך רוחב, אנו צופים התאוששות חושית מתחילים ב 2 ימים שלאחר פציעה, ותנועת C-עיקול על ידי 3 ימים לאחר פציעה.

חיתוך רוחב חוט השדרה בדג הזברה הזחל

הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים לחקור את התכונות החשמליות של תאים מעוררים בתנאים הפיזיולוגיים הלא פולשניים ביותר על ידי שימוש בעוברי דג הזברה במערכת in vivo יחד עם מחוון מתח מקודד גנטית (GEVI) מבוסס העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית (FRET) המתבטא באופן סלקטיבי בסוג התא המעניין.

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

אנו מתארים פרוטוקול לניטור שינויים בפעילות הנוירונים האדיבים במהלך פקודות מוטוריות במערכת תאי שיער של בעלי חוליות מודל.

פעילות של נוירונים אפרנט קו לרוחב אחורי במהלך שחייה בזברהפיש

הצומת העצבי-שרירי של זחל דג הזברה הוא מודל אטרקטיבי לחקר הפיזיולוגיה הסינפטית. הוא מתאים לטכניקות ניסיוניות רבות, כולל אלקטרופיזיולוגיה והדמיה אופטית. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להדמיית שידור סינפטי באמצעות בדיקה מבוססת pHluorin תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי זקוף.

הדמיה חיה של מיחזור שלפוחית סינפטית בצומת העצבי-שרירי של דג זברה זחל מנותח

למד הכנת בחוט השדרה בזברה דניו רריו לרישום אלקטרופיזיולוגי של נוירונים ספינליים בשלבי עובר ופגה. שיטה זו מאפשרת חקר תפקוד נוירונים בתוך הרקמה החיה.

זברה

גלה סרטונים נוספים