במבחנה In Vivo למזהמים סביבתיים T, B והתאים מיאלואידית פעילות מדכא ומענים ההורמונאלית מן המקבלים
12 באוגוסט 2017
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לגרום סובלנות ב השתלת ולאחר להעריך חוץ גופית בתוך ויוו הקיבולת המדכא של תאים נפרדים קבוצות משנה של המטופל, את מצב המערכת החיסונית של המטופל כלפי התורם או אנטיגנים אקסוגני.
אינדוקציה של סובלנות בהשתלה קשורה לעתים קרובות להופעת אוכלוסיית תאים רגולטורית. היעדר תגובה חיסונית לתורם, אך חסינות נשמרת כנגד אנטיגן אקסוגני. יש לנו פרוטוקול שונה להעריך במבחנה וב-vivo, את יכולת הדיכוי של כל תת-קבוצה של תאים רגולטוריים ואת מצב התגובות ההומורליות מהמארח.
להרדים חולדה לואיס 1W תורמת באמצעות שאיפת איזופלורן O2 בתוספת N20 1% לאחר חמש דקות. הניחו את החיה בדקוביטוס הגבי וחטאו את הבטן עם בטדין כדי לבצע כריתת בית החזה. מהדקים את הווריד הנבוב התחתון והעליון, הקשרים ואז חותכים אותם.
לאחר מכן חתכו את עורק הריאה ואת אבי העורקים ושמרו את השתל בקור NaCl 0.9% הרדמה 150 גרם חולדה מושתלת לואיס 1A במשך שמונה עד 12 שבועות באמצעות שאיפת איזופלורן O2 בתוספת N2O 1% הנח את החיה בדלקת גב וחטא את הבטן עם בטדין לביצוע לפרוטומיה צפלו-ערווה. להחצין את המעיים, להדק את כלי הדם בבטן. בצע אנסטומוזה רוחבית סופית בין אבי העורקים הגרף לאבי העורקים הבטני.
ובין עורק הריאה לווריד הנבוב בבטן ולהסיר מלחציים. לתפור את מישור השרירים והעור ולחטא עם בטאדין. יש להזריק ומלוקסיקם תת עורי וטרמיצין ובופרנורפין תוך שרירי ולהניח את החיה מתחת למנורת חום עד להתעוררות החיה.
כדי להקל על דחיית האלוגרף, המשך עם התרופה שנבחרה. קצרו את הטחול מחולדת לואיס 1W נאיבית, ושמרו אותו ב-PBS 1x קר. מעבירים את הטחול בצלחת, מסירים PBS ומחליפים חמישה מ"ל קולגנאז D.To לשפר את פעולת האנזים, חותכים את הטחול לחתיכות קטנות ודוגרים 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
הוסף 500 מיקרוליטר EDTA 0.1 טוחנת. העבירו את חתיכות הטחול למסננת ומועכים את הטחול בעזרת עלי סטרילי כדי לנתק את התאים. מעבירים לצינור ושוטפים את התאים עם 50 מיליליטר PBS.
צנטריפוגה 10 דקות ב -430 G. השליכו את הסופרנטנט. הסר כדוריות דם אדומות וטסיות דם. השעו מחדש את כדורי הטחול ב -10 מ"ל של תמיסה היפוטונית, ודגרו חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן לשטוף ב- PBS ובצנטריפוגה 10 דקות ב -190 גרם. הסירו את סיבי הקולגן על ידי סינון במסנן רקמות של 100 מיקרומטר. ספור את התאים כדי להתאים את ריכוז התאים בחמש פעמים 10 כוח שבעה תאים למ"ל ב- PBS ב- CS 2% EDTA 0.5 מילימולר.
דגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם אנטי-TCR אלפא/בטא ואנטי-TCR גמא/דלתא כדי לתייג תאי T, אנטי-CD45RA כדי לתייג תאי B ואנטי-CD161 כדי לסמן תאי NK. שטפו עם PBS-FCS-EDTA וצנטריפוגה 10 דקות ב-430 G.שטפו דינביירים מגנטיים. השתמש ב-35 מיקרוליטר dynabeads לכל 10 הספק שישה טחולים עם 30 מ"ל PBS-FCS-EDTA.
הניחו דקה אחת על המגנטי והשליכו את הסופרנטנט. חזור על הפעולה שלוש פעמים. השעיה מחדש של dynabeads ב-10 כרכים של PBS-FCS-EDTA.
השליכו את הסופרנטנט של תאים צנטריפוגים. הסר תאים לא רצויים על ידי ערבוב טחול עם דינבחרוזים למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס ובזמן תסיסה. לאחר מכן הניחו את הצינור על המגנט דקה אחת והעבירו את הסופרנטנט בשפופרת חדשה.
חזור על הפעולה פעמיים. ספור את התאים והתאם את ריכוז התאים בחמש פעמים 10 בכוח שבעה תאים למ"ל ב-PBS-FCS-EDTA. מיין pDCs באמצעות נוגדנים מסומנים.
הוסף נוגדן נגד CD45RA לתיוג תאי B, אנטי TCR אלפא/בטא לתיוג תאי T, אנטי CD4 ואנטי CD45R לתיוג pDCs. מיין תאים חיוביים ל-CD4, חיוביים ל-CD45R, שליליים ל-CD45RA, תאים שליליים ל-TCR. סמן חרוזים עם כל נוגדן כדי ליצור מטריצת פיצוי.
דגרו 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ושטפו את התאים עם PBS-FCS-EDTA. השעו מחדש את התאים בריכוז של חמש פעמים 10 כוח שבעה תאים למ"ל. סנן על מסנן רקמות של 60 מיקרומטר וסמן תאים מתים על ידי הוספת DAPI בריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם למ"ל.
מיין תאים עם זרבובית של 70 מיקרומטר ב-FACS Aria על ידי שער על DAPI-TCR שלילי, CD45RA שלילי, CD4 חיובי, CD45R חיובי. קצרו את הטחול של חולדת לואיס 1A נאיבית ושמרו אותה ב-PBS קר. מעבירים את הטחול במסננת המונחת לכלי ומוסיפים 10 מ"ל PBS.
מרסקים את הטחול בעזרת בוכנת מזרק כדי להפריד את התאים. העבירו את התאים לצינור והשלימו ל -50 מ"ל עם PBS ושטפו אותם עם 10 דקות צנטריפוגה של 430 גרם. זה גורם לסופרנטנט.
כדי לחסל כדוריות דם אדומות וטסיות דם, יש להשעות מחדש את כדורי הטחול בתמיסה היפוטונית, 10 מ"ל חמש דקות בטמפרטורת החדר, ואז לשטוף עם PBS עם 10 דקות, צנטריפוגה של 190 גרם. השליכו סופרנטנט. הסר סיבי קולגן על ידי סינון במסנן רקמות של 100 מיקרומטר.
ספור את התאים כדי להתאים את ריכוז התאים בחמש כפול עשרה לשבעת התאים למ"ל ב-PBS ב-CSEDT8. יש להעשיר תאים מעניינים לפני המיון. דגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס ב-NTCD8 אלפא כדי לתייג תאי CD8 ו-TCD45R8 כדי לתייג תאי B ו-TCD161 כדי לתייג תאי NK ו-TCD11B/C כדי לתייג תאים מיאלואידים ו-TT0 גמא דלתא דלתא T ואז לשטוף עם PBS-FCS-EDTA עם 10 דקות צנטריפוגה של 430 G, להשליך סופרנטנט.
שטפו דינו-חרוזים מגנטיים, השתמשו ב-35 מיקרוליטר דינו-חרוזים עבור 10 עוצמה של שישה טחולים. עם 30 מ"ל PBS PBS-FCS-EDTA, הניחו דקה אחת על המגנט והשליכו סופרנטנט. חזור על שלושה סוגים.
השעיית דינו-חרוזים ב-10 כרכים של PBS FCSEDT8. הסר תאים לא רצויים על ידי ערבוב טחול עם דינובחרוזים למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס תחת תסיסה. לאחר מכן הנח את הצינור על המגנט דקה אחת.
מעבירים את הסופרנטנט בשפופרת חדשה, חוזרים על הפעולה פעמיים. ספור את התאים והתאם את ריכוזי התאים לחמש פעמים 10 בעוצמה של שבעה תאים למ"ל ב-PBS PBS-FCS-EDTA. הוסיפו נוגדנים מסומנים כדי למיין תאי T חיוביים ל-CD4 חיוביים ל-CD25, ו-TTCR אלפא בטא, ו-TCD4 ו-TCD25, ודגרו 50 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
כדי למיין בו זמנית CD8 חיובי CD45RClow Tregs, הוסף נוגדן NTCD45RC. חרוזים, חרוזי com, צריכים להיות מסומנים עם כל נוגדן כדי להגדיר מדדי פיצוי להמשך עיבוד ציטומטריית הזרימה. שטפו את התאים עם PBS SCSDT8 והשליכו את הסופרנטנט.
השעו תאים בחמש פעמים 10 כוח שבעה תאים למ"ל. סנן ברקמה של 60 מיקרומטר, ותייג את התאים על ידי הוספת DAPI כדי למצוא את הריכוז של 0.1 מיקרוגרם למ"ל. מיין תאים עם אזור עובדות זרבובית של 70 מיקרומטר על ידי שער על תאים שליליים חיוביים CD4 חיוביים של DAPI TCR כתאי מגיבים.
כך ש-PTCR חיובי CD4 חיובי CD45RClow CD4 חיובי Tregs ו-DAPI TCR חיובי CD4 שלילי CD45RClow CD8 Tregs. לאחר תגובה למיון תאים, שטפו פעמיים את התאים עם PBS. השעו מחדש את התאים בריכוז של 10 בעוצמה של שבעה תאים למ"ל ב-PBS ודגרו עם 0.5 מיקרומולר של CSFE למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
עצור את התגובה על ידי הוספת נפח של 1.5 FCS וצנטריפוגה 10 דקות ב-430 G בארבע מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט. שוטפים פעמיים את התאים עם תאים בינוניים ונגדיים שלמים.
הכן מדיום תרבית עם מדיום RPMI 1640 בתוספת בטא-מרקפטואתנול, חמש פעמים 10 כוח פחות חמש טוחנות. פניצילין, 100 יחידה למ"ל. סטרפטומיצין, 0.1 מיליגרם למ"ל.
נתרן פירובט, מילימול אחד. גלוטמין, שני מילימולר. מאגר Hepes, מילימולר אחד.
חומצות אמינו לא חיוניות, X.FCS אחד, 10% תאי תרבית בצלחות תחתונות של 96 באר U. הוסף תאים בסדר הבא. תאים מדכאים, תאים מגיבים ותאים אלוגניים.
שמור על פרופורציות של חמש כפול 10 כוח שבעה תאי מגיב עבור 200 מיקרו אור עד בינוני לבאר. העבירו את התאים מלוחות תחתונים של 96 U לצלחות תחתונות של 96 וולט. וצנטריפוגה דקה אחת ב 1200 גרם בארבע מעלות צלזיוס.
שומרים את הסופרנטנט בצלחת נפרדת ומקפיאים במינוס 20 מעלות צלזיוס למינון ציטוקינים במידת הצורך. שטפו את התאים עם 200 מיקרוליטר PBS-FCS-EDTA לבאר וצנטריפוגה ב-1200 גרם דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס. הוסף נוגדנים על התאים כדי להגביר את השער על תאי ה-T המגיבים, NTCTR ו-NTCD4.
דגרו 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ושטפו פעמיים עם 200 מיקרוליטר של PBS-FCS-EDTA היטב. הוסף 100 מיקרוליטר של DAPI מדולל ב-0.1 מיקרוגרם למ"ל ב-PBS, וקרא את הצלחת על מתאר FACS או כל שווה ערך. נתח את פרופיל ה-CSFE על ידי שער ב-DAPI שלילי, והשארת תאים שליליים CPD, Tregs שאינם חיוביים ל-CD4, TCR חיובי, תאים חיוביים ל-CD4.
תאי תגובה לא מגורים צריכים להיות בעלי בהירות CSFE מקסימלית. יום לפני ההשתלה יש להרדים את החולדות בהזרקה תוך שרירית של רמפון, שמונה מיליגרם לקילוגרם, קטמין, 80 מיליגרם לקילוגרם, ולהקרין אותן במינון של 4.5 גרם קרניים בצילומי רנטגן. 12 שעות לאחר ההקרנה, יש להרדים חולדות על ידי שאיפת איזופלורן 024 אחוז.
להחדיר את התאים, תאי T או תאי B או תאים מיאלואידים או טחול כבקרה חיובית על העברה אדפטיבית של סובלנות, תוך ורידי בווריד הפין. למחרת, בצע את הליך האלוגרפט ועקוב אחר התפתחות השתל על ידי מישוש דרך הבטן. אסוף דם בצינור על ידי דימום רטרו-אורביטלי וצנטריפוגה ב-1200 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שמור את הסרום, ניתן לאחסן את הסרום בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס, או להשתמש בו מיד. קצרו את הטחול מחולדת לואיס IW תורמת, ושמרו אותו ב-PBS קר. חלץ את התאים כפי שתואר קודם לכן.
יש לדלל את הסרום באופן סדרתי ממנה אחת לאחת לכל 270 ב-PBS, ארבעה דילולים לדגימה. השבת את המשלים על ידי דגירה של הצלחת עם הסרום למשך 30 דקות ב-56 מעלות צלזיוס. פעמיים 10.5 טחול לבאר בצלחת תחתונה של 96 באר V.
דגרו על התאים למשך שעה בארבע מעלות צלזיוס עם 25 מיקרוליטר של סרום מדולל לבאר. שטפו את התאים עם PBS-FCS-EDTA והשליכו את הסופרנטנט. דגרו את התאים עם כל עכבר נגד חולדות IjJ subype ABS, המסומן באורוכרומים חופשיים, למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
שטפו את התאים עם PBS-FCS-EDTA פעמיים והשליכו את הסופרנטנט. הוסף 100 מיקרוליטר של DAPI, מדולל ב-0.1 מיקרוגרם למ"ל, ו-PBS, וקרא את הלוחות על קווי המתאר של FACS או כל שווה ערך. בדוק את התמונה שאני מקבל, עם הנמוך ביותר W סרום מה-NFI שהתקבל עבור כל קליטה של הדילול המתאים.
במודל אלוגרפט לב זה בחולדות, דחיות חריפות מתרחשות במהירות, תוך כשבעה ימים. ומודלים אלה, סובלנות יכולה להיגרם על ידי חסימה של אינטראקציות ליגנד CD40, CD40 עם תוספת של קידוד CD40 EG. ניתן להשוות תאים מחולדות שטופלו ישירות לתאים מחולדות נאיביות, וחולדות מושתלות שלא טופלו לפעילות מדכאת או לכל חדירת תאים רגולטורית אחרת. בטווח יחסי אפקטור מדכא.
in vivo, בעוד שתאי B, תאים מיאלואידים או תאי T מחולדות לא טריטואידיות אינם מסוגלים לשום דחייה חריפה והישרדות ממושכת של השתל בהעברה אדפטיבית, תאים מגיבים לפעילות דיכוי פטפט מסריקת דחייה מטופלת. ניתן לאפיין סובלנות בהיעדר תגובות הומורליות לתורם שלה. שימור הקאפה CT לקבלות לתגובות ההומורליות לאנטיגנים חדשים ושימור תגובות זיכרון.
שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בסיבובים, בהשתלה, לפני התרגום לאדם. עבור גברים בכל הגילאים, הפרוטוקול שתיארנו כאן הוא שניתן להשתמש בהם כדי להעריך עם קיבולת סופר ספציפית של כל תת-קבוצה של תאים, לזהות סמן ביולוגי חדש או מולקולות מווסתות חיסוניות, והם ניתנים להתאמה לכל סביבה, כגון מחלות אוטואימוניות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול להשראת סבילות בהשתלה, תוך התמקדות בהערכת היכולת המדכאת של תתי-אוכלוסיות שונות של תאים רגולטוריים. הוא מדגיש את החשיבות של שמירה על החסינות נגד אנטיגנים חיצוניים תוך מניעת תגובות חיסוניות לתורם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה של השתלה
- אוכלוסיות תאים רגולטוריות
- הערכה In Vitro ו-In Vivo
רקע
- השראה של סבילות (Tolerance induction) היא קריטית להצלחת השתלה.
- אוכלוסיות של תאים רגולטוריים ממלאות תפקיד מרכזי בוויסות תגובות חיסוניות.
- הבנת המצב החיסוני של המקבל חיונית לשיפור תוצאות ההשתלה.
- פרוטוקולים להערכת תגובות חיסוניות יכולים להנחות אסטרטגיות טיפוליות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול מהימן להשראת סבילות בהשתלה.
- הערכת יכולת הדיכוי של תתי-אוכלוסיות שונות של תאים רגולטוריים.
- בחינת המצב החיסוני של הרסיפי כלפי אנטיגנים של התורם ואנטיגנים חיצוניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הרדמה של חולדות תורמקניות באמצעות isoflurane ו-N2O.
- ביצוע תורקוטומיה (פתיחת בית החזה) בחולדות תורמקניות לצורך השתלה.
- בדיקות in vitro להערכת תפקוד תאים רגולטוריים.
- הערכות in vivo של תגובות חיסוניות לאחר השתלה.
תוצאות עיקריות
- נצפתה השראה מוצלחת של סבילות במודל הש transplantation.
- תתי-אוכלוסיות נבדלות של תאים רגולטוריים הפגינו יכולות דיכוי משתנות.
- המקבל שמר על חסינות נגד אנטיגנים חיצוניים בעודו סובלני לתורם.
- שיטות in vitro ו-in vivo סיפקו תובנות משלימות לגבי ויסות חיסוני.
מסקנות
- הפרוטוקול שפותח יעיל לחקר סבילות בהשתלה.
- תתי-אוכלוסיות של תאים רגולטוריים הן קריטיות לוויסות תגובות חיסוניות.
- נדרש מחקר נוסף כדי למטב אסטרטגיות להשראת סבילות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך המנהלים
הבנת המנגנונים התאיים הרגולטוריים היא קריטית לפיתוח טיפולים המשרים סבילות בהשתלה, ובכך להפחתת התלות בדיכוי חיסוני כרוני. מודלים אמינים in vitro ו-in vivo מאפשרים הפחתת סיכונים מנגנונית של מועמדים לאימונומודולציה על ידי תיקוף התפקוד המדכא והוויסות של התגובה ההומורלית. גישות אלו תומכות בתיקוף יעדים ובביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים, על ידי קישור הפעילות התאית לתוצאות של הישרדות הש transplanted graft.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי הערכת קיבולת הדיכוי של תתי-אוכלוסיות של תאי T, B ותאי מיאלואיד באופן תלוי מינון.
- ערך תפעולי: תומך בזיהוי מהיר של פעילות תאים רגולטוריים לצורך תיקוף פונקציונלי ללא הסתמכות על סממנים פנוטיפיים שהוגדרו מראש.
- ערך מדעי: מסייע בהערכה של דיכוי אלוגנוי ספציפי לתורם באמצעות תאים או השתמרות מצד שלישי, כדי לאשר מנגנוני סבילות ספציפיים לאנטיגן.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק בדיקות דיכוי in vitro סטנדרטיות התואמות למדידת ציטוקינים, ניתוח ציטוטוקסיות ומעקב אחר פרוליפרציה מבוסס CFSE.
- ערך תפעולי: מאפשר כימות הדיר שחזר של דיכוי חיסוני על פני סוגי תאים ותנאים שונים לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך מדעי: תומך בהערכה של תגובות נוגדנים הומורליים נגד תורם כדי להעריך פוטנציאל טולרוגני ושימור זיכרון חיסוני.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מודלים של העברה אדופטיבית (Adoptive transfer) מדגימים תכונות טולרוגניות in vivo וסבילות זיהומית על ידי המרת התגובות החיסוניות של המקבל.
- ערך תפעולי: מאפשר השוואה של תפקודי תאים רגולטוריים בין בעלי חיים מושתלים שעברו טיפול, בעלי חיים נאיביים ובעלי חיים שלא טופלו, לצורך עקביות בין מודלים.
- ערך מדעי: מקשר בין פעילות תאים רגולטוריים לבין הישרדות השתלה והיעדר תגובות הומורליות ספציפיות לתורם, ובכך תומך ברציפות הפרה-קלינית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בביולוגיה של הגילוי על ידי תיקוף השערות מכניסטיות של סבילות חיסונית, תומכת במוכנות לסריקה באמצעות בדיקות דיכוי ובדיקות הומורליות סטנדרטיות, ומספקת מידע לקבלת החלטות תרגומיות על ידי קישור פנוטיפים תאיים לתוצאות פונקציונליות בקבלה של הש Transplant.
- ביולוגיה של גילוי (Discovery Biology): בוחן השערות מכניסטיות של סבילות על ידי מדידת דיכוי של תגובות אפקטוריות ופרופילי ציטוקינים במערכות של תרבית משותפת (co-culture).
- סריקה (Screening): מספק תוצאות כמותיות וניתנות לשחזור של פעילות דיכוי וחסינות המתווכת נוגדנים לצורך תיקוף הבדיקה ואישור ממצאים (hit confirmation).
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח מבוסס ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) של דילול CFSE, חיוניות DAPI ומיון תתי-אוכלוסיות של תאים לצורך כימות של מודולציה חיסונית.
- מחקר תרגומי: מקשר בין יכולת דיכוי in vitro לבין הגנה על הש transplanted graft in vivo וויסות של היווצרות נוגדנים נגד התורם.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה תואמת פלטפורמה הניתנת להתאמה למודלים אחרים של השתלה או מחלות אוטואימוניות במערכות של מכרסמים ובני אדם.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה באמצעות הערכה תפקודית של מנגנוני בקרה מעבר לאפיון פנוטיפי.
- ערך תפעולי: פרוטוקולים סטנדרטיים לבידוד תאים, בדיקות דיכוי ומדידת תגובה הומורלית מבטיחים שחזוריות בין אתרים שונים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) על ידי הפחתת סיכונים של מועמדים למודולציה אימונולוגית, בהתבסס על השראת סבילות ודיכוי ספציפי לאנטיגן.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של תרופות ביולוגיות או תרפיה תאית המפגינות קבלה עמידה של הש移植 (graft) ושמירה על חסינות נגד פתוגנים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוחים במכרסמים, במודלים של השתלה מסוג ischemia-reperfusion ובציטומטריית זרימה רב-צבעונית למיון תתי-אוכלוסיות של תאים.
- תלוי בציוד הכולל מכשירי FACS sorters, צנטריפוגות וקוראי לוחות פלואורסצנטיים לזיהוי CFSE ו-DAPI.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת תאים הכוללים עיכול באמצעות קולגנאז, דילול באמצעות חרוזי מגנט וליזיס היפוטוני להשגת תתי-ניושים (splenocytes) עקביים.
- נדרשת התאמה של פאנלים של נוגדנים ואסטרטגיות gating בעת מעבר בין מינים או מודלים של מחלות.
- מגבלות מעשיות כוללות לוחות זמנים להישרדות השתלה התלויים במודל והצורך במקלטים מקרינים בבדיקות העברה אדופטיבית.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Title
0:37
LEW.1W to LEW.1A Allograft Procedure
2:18
Isolation of Allograft APCs (pDCs)
6:12
Isolation of Responder Effector T Cells and Regulatory T Cells (CD4+ and CD8+CD45RClow)
10:30
CFSE Labeling of Responder Cells to Measure their Proliferation
12:09
FACS Staining and Analysis After 6 Days of Coculture
13:49
In Vivo Assessment of the Cells Supressive Activity by Adoptive Cell Transfer in a Heart Grafted Recipient
16:33
Representative Results
18:03
Conclusion
