Name: שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: למדו שיטה ליצירת דפוסי תאים במיקרו-ערוצים באמצעות ואקום בלחץ נמוך. טכניקה זו מאפשרת חקר אינטראקציות בין תאים וחלבונים במעבדות ביולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מימון למחקר זה סופק על ידי ועדת ניו ג&#39;רזי בחקר חוט השדרה (NJCSCR) (כדי FHK), להעניק CSCR14IRG005 (כדי BLF), NIH מענק R15NS087501 (כדי CHC), וקרן קירבי FM (כדי ETA).

הערה: אנא להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. חלק מהכימיקלים המשמשים פרוטוקול זה הוא רעיל ומסרטן. השתמש כל נוהלי הבטיחות המתאים (במנדף, שבתא הכפפות) וציוד מגן אישי (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלא, נעליים סגורות) בעת השימוש בחומרים רעילים או חומצה / בסיס. ייצור 1. של תבניות אב ליתוגרפיה באמצעות ליתוגרפיה Soft <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את הפריסה של microchannel באמצעות כלי ציור תכנון בעזרת מחשב (CAD). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפס את הפריסה על צלחת מסיכה אטומה באמצעות סופר מסכת ליזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פרוסות סיליקון 4 אינץ &#39;עם אצטון ואחריו isopropanol ויבש עם אקדח אוויר חנקן, כדי לוודא ששום ממס נותר על פרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבש את הפרוסות על ידי אפייה זה על צלחת חמה ב 200 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר photoresist שלילית המיועד לגובה הרצוי של microchannels. Fאו למשל, להשתמש photoresist השלילי SU-8 50 להשיג microchannels עם גובה של 50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר רקיק להתקרר לטמפרטורת החדר, ולאחר מכן ליישר את רקיק על צ&#39;אק של coater ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 4 מ&quot;ל (1 מ&quot;ל / אינץ בקוטר של פרוסות סיליקון) של photoresist שלילית על מרכז של פרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין המעיל רקיק עם הסחיטה שני שלבים באמצעות הצנטריפוגה. ראשית, להחיל מחזור התפשטות 500 סל&quot;ד עם תאוצה של 100 סל&quot;ד / s עבור 10 שניות. ואז להחיל מחזור סחיטה של 2,000 סל&quot;ד עם תאוצה של 300 סל&quot;ד / s 2 למשך 30 שניות כדי לקבל ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist על פרוסות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפות Soft רקיק בשני שלבים על פלטה חשמלית על פי הנחיות היצרן. לקבלת ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist, הראשון מראש לאפות את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות ולאחר מכן מיד תעלי את הטמפרטורה פלטה חשמלית כדי לפרסם לאפות את פרוסות סיליקון ב 95 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר רקיק להתקרר לטמפרטורת החדר ולאחר מכן לטעון אתוופל לבמה ליתוגרפיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את המסכה על פרוסות סיליקון באמצעות aligner מסכה ולחשוף את רקיק לאור UV (על פי הוראות היצרן) בעצימות של 1.5 mW / 2 ס&quot;מ על 146 s ליישם את המינון UV כולל של 220 mJ / 2 ס&quot;מ הנדרשים 50 מיקרומטר שכבת photoresist עבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לאפות חשיפה לפרסם רקיק בשני שלבים על פלטה חשמלית. לקבלת ציפוי 50 מיקרומטר של photoresist, ראשון מראש לאפות את הפרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ומייד תעלה את טמפרטורת הפלטה החשמלית כדי לפרסם לאפות אותו על 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את רקיק על ידי השריית רקיק מפתח SU-8 ורועדת בעדינות עד תכונות להתבהר על פרוסות סיליקון. פיתוח רקיק עבור ~ 6 דקות עבור photoresist עבה 50 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף מפתח עודף עם isopropanol ואתנול, ולאחר מכן לייבש את הפרוסות עם אקדח אוויר חנקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קשה לאפות את פרוסות סיליקון על פלטה חשמלית ב 150 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים אתרקיק ייבוש עם 25 μL של סוכן silanizing tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-trichlorosilane. הערה: סוכן silanizing הוא מאכל, ולכן יש להשתמש בתוך במנדף חומצה / בסיס, עם ציוד מגן אישי מתאים (משקפי מגן, כפפות, חלוק, מכנסיים באורך מלאים, סגורות נעליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל את ואקום במשך 5 דקות ולחשוף את רקיק האדים של silane במשך 30 דקות מבלי לשחרר את הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פרוסות לתוך צלחת כראוי בגודל פטרי. </li></ol> ייצור 2. מגיסטר תבניות ליתוגרפיה Soft באמצעות דבק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר את הפריסה של microchannel באמצעות כלי ציור CAD ולהדפיס את הציור על נייר לבן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה שקופיות זכוכית גדולות מספיק כדי להכיל את העיצוב עם isopropanol ולאחר מכן לייבש את השקופית עם רובה אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף דבק לשקופית זכוכית לנקות. היזהר שלא מלכודת כל בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת את הצדדים של GLAss להחליק על הנייר עם העיצוב, עם למעלה בצד הקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל לחתוך את הקלטת בשקופית הזכוכית באמצעות עיצוב נייר כהפניה ולאחר מכן לקלף קלטת מאזורים לא רצויים של שקופיות הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את השקופית זכוכית עם isopropanol ואז יבש עם רובה אוויר. אופה את שקופיות זכוכית בתנור על 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגלגל את הקלטת עם מכבש גומי כדי להסיר בועות אוויר ולאפשר את השקופית להתקרר לטמפרטורת החדר. </li></ol> 3. ייצור ליתוגרפיה Soft של מכשירי PDMS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבי PDMS אלסטומר סוכן הריפוי שלה ביחס של 10: 1 (w: w), מערבב את התערובת במרץ, ולאחר מכן דג את התערובת על ידי צבת אותו לתוך תא ואקום עד שאין בועות אוויר מופיעות התערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת על תבנית סיליקון silanized או עובש דבק בצלחת פטרי להשיג ~ 2 מ&quot;מ שכבה עבה של PDMS דגה עד שכל האוויר בועות להיעלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא את PDMS בתנורעל 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל לחתוך את שכבת PDMS במרחק של לפחות 5 מ&quot;מ מן התכונות ולאחר מכן לקלף את PDMS נרפא את התבנית באמצעות פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פאנץ חור כניסת יחיד עם ביופסיה 1 מ&quot;מ אגרוף בכל מקום על microchannel, רצוי בסוף רשת של microchannels כפי שניתן לראות באיור 2a ו -4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקו את PDMS יצוק עם סרט דביק על מנת להסיר חלקיקי אבק adsorbed על גבי המכשיר. לעקר את המכשיר microchannel PDMS (יצוק PDMS) על ידי שטיפה עם תמיסה של אתנול 70% ואחריו מים סטריליים deionized (DI), ולחשוף את UV למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המכשיר PDMS סטרילי בצלחת פטרי סטרילית עד השימוש. </li></ol> 4. תשתית דפוסים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את PDMS סטרילי יצוק באמצעות פינצטה על coverslip כוס סטרילית או בצלחת פטרי להפעיל לחץ עדין באמצעות קצה של פינצטה. הערה: צוות השחקנים PDMS עושה קונפורמי אבל חותם הפיך עם GLcoverslip התחת או בצלחת פטרי להרכיב microchannels ללא שימוש בכל דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח טיפה (20 - 40 μL) של פתרון המצע על הכניסה לגמרי מכסה את חור המפרצון. תבנית Poly-D- ליזין (PDL) על ידי הצבת אגל 20 μL של PDL חיץ נתרן tetraborate על מפרצון של microchannels. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת פטרי בחלל ריק של ~ 254 mmHgA (שווה ערך ל לשכן ואקום במעבדות ביולוגיות) במשך 10 דקות, ולבחון אוויר היוצא של הערוץ בצורת בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר את הוואקום ולבחון את פתרון המצע זורם לתוך microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחת על התנאים המתאימים דבקות מצע. ראה לוחות 1 ו -2 תנאי דגירה (אלה משתנות בהתאם למצע). לקבלת דפוסי PDL, דגירה של 1 ש &#39;על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לקלף את חותמת PDMS באמצעות פינצטה סטרילית לשטוף את התבנית על coverslip זכוכית שלוש פעמים עם מים די. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת אלבומין 1% שור פתרון (BSA) כדי בצלחת פטרי לכסות את התבשיל או coverslip הזכוכית דגירה לילה בשעה 37 ° C. הערה: זה יקטין דבקות שאינן ספציפיות באזורים ללא ציפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את פתרון 1% BSA, ואת המצע בדוגמת עכשיו הוא מוכן לשימוש. </li></ol> 5. דפוסים עקיפים של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההשעיה תא בינוני תרבות סרום ללא. סוג התא צפיפות התאים מפורטים בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את ההשעיה תא אל צלחת פטרי בדוגמת ובאופן מוחלט לצלול באזור בדוגמת ההשעיה הסלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחת פטרי על 37 מעלות צלזיוס באינקובטור במשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף מצע בדוגמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את השעית התא העודפת מצלחת פטרי לשטוף את התאים בדוגמת שלוש פעמים עם בופר פוספט (PBS) תוך רעד בעדינות במשך 10 שניות כדי להסיר תאים פנויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף אמדיום תרבות ppropriate אל בתרביות תאים בדוגמת דגירת התאים בדוגמת ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור. </li></ol> 6. דפוסים ישירים של תאים הערה: טכניקה זו היא חלופת דפוסי התא העקיף כמתוארים בשלב 5. עם זאת, שלא כמו בשלב 5, בטכניקה זו תאים הם בדוגמת על משטחים בתרבית רקמה עם או בלי ציפוי מצע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את המכשיר microfluidic על ידי שטיפה עם תמיסה של 70% אתנול ואחריו מים DI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את המכשיר לילה בתמיסה של BSA 1% כדי למנוע את הידבקות התא אל PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את המכשיר בטמפרטורת החדר וצרף אותו לחלק התחתון של צלחת פטרי שטופלו בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את השעית תא תקשורת ותרבות סרום ללא. סוג תא צפיפות תאים מפורטים בטבלה 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים טיפה (4 - 8 μL) של ההשעיה תא, מספיק כדי למלא אתmicrochannels, על הכניסה לגמרי מכסה את חור המפרצון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת פטרי בחלל ריק במשך 10 דקות ולבחון אוויר היוצא של הערוץ בצורת בועות. לשחרר את הוואקום ולבחון את ההשעיה תא לזרום לתוך microchannel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחת פטרי באינקובטור כדי לקדם את הידבקות תא בהתאם לתנאי הדגירה (תלוי בסוג של תא בדוגמת) ציין בטבלה 2. להוסיף PBS על צלחת פטרי השריית מכשיר PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקלפים את PDMS בזהירות מעל צלחת פטרי עם פינצטה לשטוף את התבנית עם PBS. הוסף מדיה תרבית תאים כדי בצלחת פטרי ומקום תרבית התאים בחממה. </li></ol>

<ol><li>Kane, R. S., Takayama, S., Ostuni, E., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+proteins+and+cells+using+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Patterning proteins and cells using soft lithography.</a> Biomaterials. 20 (23-24), 2363-2376 (1999).</li>
<li>Lin, R. Z., Ho, C. T., Liu, C. H., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis+based-cell+patterning+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis based-cell patterning for tissue engineering.</a> Biotechnol J. 1 (9), 949-957 (2006).</li>
<li>Veiseh, M., Zareie, M. H., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/la025529j">Highly Selective Protein Patterning on Gold-Silicon Substrates for Biosensor Applications.</a> Langmuir. 18 (17), 6671-6678 (2002).</li>
<li>Kung, F., Wang, J., Perez-Castillejos, R., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+along+the+nasal%2Ftemporal+plane+affects+synaptic+development+by+adult+photoreceptors%2C+revealed+by+micropatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol%22%5BJournal%5D)">Position along the nasal/temporal plane affects synaptic development by adult photoreceptors, revealed by micropatterning.</a> Integr Biol. 7 (3), 313-323 (2015).</li>
<li>Dickinson, L. E., Lutgebaucks, C., Lewis, D. M., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+microscale+extracellular+matrices+to+study+endothelial+and+cancer+cell+interactions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Patterning microscale extracellular matrices to study endothelial and cancer cell interactions in vitro.</a> Lab Chip. 12 (21), 4244-4248 (2012).</li>
<li>Khademhosseini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-culture+of+human+embryonic+stem+cells+with+murine+embryonic+fibroblasts+on+microwell-patterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates.</a> Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).</li>
<li>Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+cell-cell+communication+in+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Studying cell-cell communication in co-culture.</a> Biotechnol J. 8 (4), 395-396 (2013).</li>
<li>Choi, Y., Lee, S. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/BF02916509">Guided cell growth through surface treatments.</a> J of Mech Sci Technol. 19 (11), 2133-2137 (2005).</li>
<li>Hwang, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Immobilization+and+Patterning+of+Biomolecules+on+Poly%28ethylene+terephthalate%29+Films+Functionalized+by+Ion+Irradiation+for+Biosensor+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interf%22%5BJournal%5D)">Efficient Immobilization and Patterning of Biomolecules on Poly(ethylene terephthalate) Films Functionalized by Ion Irradiation for Biosensor Applications.</a> ACS Appl Mater Interf. 3 (7), 2235-2239 (2011).</li>
<li>Clark, P., Britland, S., Connolly, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+guidance+and+neuron+morphology+on+micropatterned+laminin+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Growth cone guidance and neuron morphology on micropatterned laminin surfaces.</a> J Cell Sci. 105 (1), 203-212 (1993).</li>
<li>Théry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterning+as+a+tool+to+decipher+cell+morphogenesis+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions.</a> J Cell Sci. 123 (24), 4201-4213 (2010).</li>
<li>Douvas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+photolithographic+process+for+the+patterning+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Biocompatible photolithographic process for the patterning of biomolecules.</a> Biosens Bioelectron. 17 (4), 269-278 (2002).</li>
<li>Alom, R. S., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2007/SM/B613349E">Microcontact printing: A tool to pattern.</a> Soft Matter. 3 (2), 168-177 (2007).</li>
<li>Essö, C. <a target="_blank" href="http://www.diva-portal.org/smash/get/diva2:121034/fulltext01">Modifying Polydimethylsiloxane (PDMS) surfaces.</a> Institutionen för biologi och kemiteknik. , (2007).</li>
<li>Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+PDMS+surface+modification+for+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices.</a> Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).</li>
<li>Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+elastomeric+stencils+for+micropatterning+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res%22%5BJournal%5D)">Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures.</a> J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).</li>
<li>Yeo, W. S., Yousaf, M. N., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+interfaces+between+cells+and+surfaces%3A+electroactive+substrates+that+sequentially+release+and+attach+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Dynamic interfaces between cells and surfaces: electroactive substrates that sequentially release and attach cells.</a> J Am Chem Soc. 125 (49), 14994-14995 (2003).</li>
<li>Bhatia, S. N., Toner, M., Tompkins, R. G., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+adhesion+of+hepatocytes+on+patterned+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Selective adhesion of hepatocytes on patterned surfaces.</a> Ann N Y Acad Sci. 745, 187-209 (1994).</li>
<li>Song, E., Kim, S. Y., Chun, T., Byun, H. -J., Lee, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+scaffolds+derived+from+a+marine+source+and+their+biocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Collagen scaffolds derived from a marine source and their biocompatibility.</a> Biomaterials. 27 (15), 2951-2961 (2006).</li>
<li>Yamato, M., Konno, C., Utsumi, M., Kikuchi, A., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermally+responsive+polymer-grafted+surfaces+facilitate+patterned+cell+seeding+and+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Thermally responsive polymer-grafted surfaces facilitate patterned cell seeding and co-culture.</a> Biomaterials. 23 (2), 561-567 (2002).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+cells+and+their+environments+using+multiple+laminar+fluid+flows+in+capillary+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (10), 5545-5548 (1999).</li>
<li>Kim, D. S., Lee, K. -C., Kwon, T. H., Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/12/3/307/meta">Micro-channel filling flow considering surface tension effect.</a> J of Micromech Microeng. 12 (3), 236(2002).</li>
<li>Kim, E., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja960151v">Micromolding in Capillaries: Applications in Materials Science.</a> J Am Chem Soc. 118 (24), 5722-5731 (1996).</li>
<li>Kim, E., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v376/n6541/abs/376581a0.html">Polymer Microstructures Formed by Molding in Capillaries.</a> Nature. 376 (6541), 581-584 (1995).</li>
<li>Jeon, N. L., Choi, I. S., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="https://gmwgroup.harvard.edu/pubs/pdf/665.pdf">Large-area patterning by vacuum-assisted micromolding.</a> Adv Mater. 11 (11), 946(1999).</li>
<li>Shrirao, A. B., et al. System and method for novel microfluidic device. US patent. , 61/414,237 (2010).</li>
<li>Merkel, T. C., Bondar, V. I., Nagai, K., Freeman, B. D., Pinnau, I. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/202178954_Gas_Sorption_Diffusion_and_Permeation_in_PolyDimethylsiloxane">Gas sorption, diffusion, and permeation in poly(dimethylsiloxane).</a> J Polym Sci Part B Polym Phys. 38 (3), 415-434 (2000).</li>
<li>Shrirao, A. B., Hussain, A., Cho, C. H., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive-tape+soft+lithography+for+patterning+mammalian+cells%3A+application+to+wound-healing+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Adhesive-tape soft lithography for patterning mammalian cells: application to wound-healing assays.</a> Biotechniques. 53 (5), 315-318 (2012).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://blogs.rsc.org/chipsandtips/2010/05/17/simple-fabrication-of-microfluidic-devices-by-replicating-scotch-tape-masters/">Chips & tips: simple fabrication of microfluidic devices by replicating scotch-tape masters.</a> Lab Chip. , (2010).</li>
<li>Anil, B. S., Frank, H. K., Derek, Y., Cheul, H. C., Ellen, T. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vacuum-assisted+fluid+flow+in+microchannels+to+pattern+substrates+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Vacuum-assisted fluid flow in microchannels to pattern substrates and cells.</a> Biofabrication. 6 (3), 035016(2014).</li>
<li>Yuen, P. K., Goral, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost+rapid+prototyping+of+flexible+microfluidic+devices+using+a+desktop+digital+craft+cutter%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Low-cost rapid prototyping of flexible microfluidic devices using a desktop digital craft cutter.</a> Lab on a Chip. 10 (3), 384-387 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-loading+and+cell+culture+in+one+layer+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Self-loading and cell culture in one layer microfluidic devices.</a> Biomed Microdevices. 11 (3), 679-684 (2009).</li>
<li>Feng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+mammalian+cells+under+high+vacuum+condition+for+ion+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Survival of mammalian cells under high vacuum condition for ion bombardment.</a> Cryobiology. 49 (3), 241-249 (2004).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1548-1549 (2006).</li>
<li>Fan, D. -H., Yuan, S. -W., Shen, Y. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+with+BSA+blocking+based+on+in+situ+synthesized+gold+nanoparticles+in+poly+%28dimethylsiloxane%29+microchip%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf%2C+B%22%5BJournal%5D)">Surface modification with BSA blocking based on in situ synthesized gold nanoparticles in poly (dimethylsiloxane) microchip.</a> Colloids Surf, B. 75 (2), 608-611 (2010).</li>
<li>Hideshima, S., Sato, R., Inoue, S., Kuroiwa, S., Osaka, T. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400511008902">Detection of tumor marker in blood serum using antibody-modified field effect transistor with optimized BSA blocking.</a> Sens Actuator B-Chem. 161 (1), 146-150 (2012).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+immunoassay+through+in-channel+microfluidic+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High-throughput immunoassay through in-channel microfluidic patterning.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2487-2490 (2012).</li>
<li>MacLeish, P., Barnstable, C., Townes-Anderson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+monoclonal+antibody+as+a+substrate+for+mature+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Procs+Nat+Acad+of+Sci%22%5BJournal%5D)">Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro.</a> Procs Nat Acad of Sci. 80 (22), 7014-7018 (1983).</li>
<li>Suchodolskis, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sia.3763/abstract">Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM.</a> Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

בעוד photolithography הקונבנציונלי היא טכניקה מבוססת היטב ליצירת תבניות עבור ליתוגרפיה רכה, הציוד, חומרים, ואת כישורים דרושים כדי להשתמש photolithography הקונבנציונלי אינם זמינים ברוב המעבדות. למעבדות ללא גישה למשאבים אלה, והצגנו ייצור סרט דביק כשיטה של ​​יצירת תבניות עם תכונות פשוטות יחסית למכשירי microfluidic. שיטה זו מאפשרת לכל מעבדה ליצור ולנצל מכשירי microfluidic למטרות מחקר עם כלים זמינים. השיטה הדבקה ניתן לשפר עם חותך ויניל שולחן העבודה בעלות נמוכה 31.</su...

בהנדסת רקמות biosensing, את היכולת לשלוט בארגון המרחבי של חלבונים בתאים בסולם מיקרומטר, הפך חשוב יותר ויותר במהלך ארבעת העשורים האחרונים 1, 2, 3. ארגון המרחבי מדויק של חלבונים בתאים אפשר לחוקרים לבחון את יחסי הגומלין בין תאי מצעים המכילים סוגים דומים או שונים של תאים, כדי להדריך את גדילת תאים, וכדי לשתק ביומולקולות עבור הייצור של חיישנים ביולוגיים 4, 5, 6, 7, 8, 9. השיטות הקיימות כיום של חלבונים דפוסים כוללים photopatterning והדפסה microcontact. Photopatterning מנצל חומר רגיש לאור אשר crosslinked בחשיפה ultrאור סגול (UV). אור UV מכוון photomask (מורכב האזורים שקופים עם אזורים כהים כדי למנוע העברת אור UV) גורם crosslinking באזורים ספציפיים אשר לאחר מכן ניתן להשתמש עבור ההתקשרות הבאה של חומרים ביולוגיים או תאים 10, 11. בעוד תכנית זו היא מאוד מדויקת ומאפשרת שליטה מדויקת של הטופוגרפיה של שטח התרבות, היא מוגבלת ביומולקולות UV הרגיש שניתן בדוגמת ידי קרינת UV 12. הדפסת Microcontact היא עוד שיטה פופולרית של דפוסי חלבונים ספציפיים 13, 14. בשיטה זו, siloxane פולי-דימתיל (PDMS) חותמת מטופל עם מגוון רחב של חומרים כימיים שינוי פני השטח בטרם ספוג בתמיסה של המצע וביומולקולרית הנבחר. הוא הקיש בעדינות על coverslip זכוכית או משטח אחר כך &quot;הטבעה&quot; את biomolecule על גבי משטח תרבות. הוwever, ביול מוגבל לסוג החומר שניתן להעביר כמו גם יכולת רטיבות של ביומולקולות אל פני השטח של PDMS להחתים 15. דפוסים ישירים של תאים יכולים להיות יותר קשים ומסתמכים על שיטות מורכבות כגון מצעים להחלפה, שיטות המבוסס סטנסיל, או דפוסים עם מולקולות הדבקת תא ספציפיות 16, 17. שיטות אלו מוגבלים ביכולתם תאי דפוס בשל חוסר מצעי הידבקות תא תואמים, אי התאמה של התהליך לעבוד עם תאים ואילוצים ביולוגיים רגישים, חוסר עקביות לשחזר את הדפוסים, ומורכבות ההליך. לדוגמא, עם מצעים להחלפה, מצעים מותאמים אישית צריכים להיות מתוכננים עבור כל סוג תא, לעבור דבקותם סוגי תאים מסוימים ללא שפלה בחשיפה לאור UV והחום המשמש בתהליך 17, &lt;<html> sup class = &quot;Xref&quot;&gt; 18, 19, 20. שיטות דפוסים סטנסיל מבוססות הם צדדים ביכולתם תאי דפוס; עם זאת, קשה לייצר שבלונות PDMS על עוביים המתאים לשימוש 16, 21. הזרקה ישירה של תאים לתוך ערוצי microfluidic PDMS יש כמה יתרונות כגון: 1) להקל על ייצור של ערוצי microfluidic ו -2) והתאמתו תאי מצעים שונים. עם זאת, הנושא הרווחת ללכוד בועות אוויר במהלך תהליך ההזרקה בשל הידרופוביות של PDMS ללא שימוש ניקוי פלזמה, או בשיטות אחרות כדי להקטין בועות אוויר, מקשה ליצור תאים בדוגמת בעקביות על משטחי זכוכית או פלסטיק 21. עבודה זו מרחיבה נימי micromolding 22, 23,= ילדה &quot;Xref&quot;&gt; 24, 25, 26 ו מדווח שיטה להזריק השעיות חלבון התא לתוך microchannels. השיטה כאן מדגימה את הדפוסים של מצעים ושניהם דפוסים ישירים ועקיפים של סוגי תאים מסוימים. טכניקה זו מתגברת על הידרופוביות הגבוהה של PDMS ומונעת את הנוכחות של בועות במהלך ההזרקה של או מצעים או תאים על ידי ניצול של חדירות הגז של 27 PDMS. מסמך זה מדגים את השימוש בטכניקה עם כמה מצעים שונים סוגי תאים. המאמר מדגיש גם הייצור של תבניות עבור ליתוגרפיה רכה באמצעות photolithography קונבנציונלי וכן פשוטה ושיטת דבק בעלות הנמוכה שימושית משאבי הגדרות מוגבלות 28, 29.

<table><tbody><tr><td>כלי ציור CorelDRAW X4 CAD Corel</td><td>Corporation, Canada</td><td>X4 גרסה 14.0.0.701</td><td>כלי CAD המשמש לציור הפריסה של המכשיר המיקרופלואידי,</td></tr><tr><td>מדפסת לייזר HP</td><td>Hewlett Packard, CA</td><td>1739629</td><td>משמש להדפסת הפריסה של מכשיר מיקרופלואידיק, לטכניקת סרט דבק</td></tr><tr><td>Bel-Art Dessicator</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>משמש להסרת הגז מתערובת</td></tr> <tr><td>ה-PDMSסקוטש דבק</td><td>3M מוצר, MN</td><td>Tape 600</td><td>משמש לייצור סרט דבק Master</td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning, MI</td><td>1064291</td><td>יציקת פולימר</td></tr><tr><td>פטרי צלחת</td><td>פישר סיינטיפיק, MA</td><td>08-772-23</td><td>משמש לשמירה על התבנית ליציקה עם PDMS</td></tr><tr><td>אזמל נירוסטה (# 3) עם להב (# 11)</td> <td>Feather Safety Razor Co. Ltd. יפן</td><td>2976 # 11</td><td>משמש לחיתוך ה- PDMS</td></tr><tr><td>פינצטה</td><td>טד פלה, קליפורניה</td><td>5627-07</td><td>משמש לטיפול ביציקת ה-PDMS במהלך קילוף</td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק, MA</td><td>12-546-2</td><td>משמש כמשטח לדפוס</td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית</td> המצע <td>פישר סיינטיפיק, MA</td><td>12-544-4</td><td>משמש כמשטח לדפוס המצע</td></tr><tr><td>רולר גומי</td><td>דיק בליק חומרי אמנות, IL</td><td>40104-1004</td><td>משמש להצמדת סרט דבק על זכוכית מבלי ללכוד בועות אוויר</td></tr><tr><td>כותב מסכות לייזר</td><td>היידלברג מכשירים, גרמניה</td><td>DWL66fs</td><td>משמש לייצור מסכת קוורץ המשמשת בתהליך ייצור פוטוליתוגרפיה</td></tr><tr><td>EVG Mask Aligner (כלי חשיפה לפוטוליתוגרפיה UV)</td> <td>EV Group, גרמניה</td><td>EVG 620T(B)</td> <td>משמש לחשיפת הפוטו-התנגדות לאור UV</td></tr><tr><td>Spin Coater Headway</td><td>Headway Research Inc, TX</td><td>PWM32-PS-CB15PL</td><td>משמש לסובב ציפוי הפוטו-רזיסט על פרוסת סיליקון</td></tr><tr><td>Photoresists SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>פוטו-רזיסט שלילי המשמש לייצור תבניות</td></tr><tr><td>SU-8 Devloper</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>מפתח Photoresist</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane</td><td>UCT Specialties, PA</td><td>T2492-KG</td><td>תבנית מעיל למניעת הידבקות PDMS</td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>סיגמא-אולדריץ', MO</td><td>190764</td><td>ממס ניקוי</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ', MO</td><td>24102</td><td>ממס עיקור</td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין הידרוברומיד (PDL)</td> <td>סיגמא-אולדריץ', MO</td><td>P0899-10MG</td><td>תמיסת PDL מיוצרת ב-0.1 מ"ג/מ"ל במאגר נתרן טטרבוראט</td></tr><tr><td>למינין</td><td>סיגמא-אולדריץ', MO</td><td>L2020</td><td>למינין נקוב ל-10 ומיקרו; L aliquots ומדולל ל-20 ומיקרו; g/&micro; L ב-PBS לפני השימוש</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>BP1605100</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>C2C12 Myoblast cell</td><td>lline ATCC, VA</td><td>CRL-1722</td><td>משמש להדגמת דפוס C2C12</td></tr><tr><td>PC12 Cell</td><td>Line ATCC, VA</td><td>CRL-1721</td><td>משמש להדגמת דפוס PC12</td></tr><tr><td>קולגן מסוג 1, זנב עכברוש</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>סרום תרבית תאים לסוס, מומת בחום</td><td>פישר סיינטיפיק, MA</td><td>26050-070</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>פלואידין-טטרמתילרודמין B איזותיוציאנט (TRITC)</td> <td>סיגמא-אולדריץ', MO</td><td>P1951</td><td>לתיוג תאים</td></tr><tr><td>Calcein-AM ערכת בדיקת תאים מתים</td><td>חיים Invitrogen, MA</td><td>L-3224</td><td>בדיקת כדאיות תאים</td></tr><tr><td>ביופסיה חור אגרוף</td><td>טד פלה, CA</td><td>15110-10</td><td>חור מנוקב ב-PDMS</td></tr></tbody></table>

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

טכניקות דפוס מצע ותאים נמצאות בשימוש נרחב בביולוגיה של התא כדי לחקור אינטראקציות בין תא לתא ותא למצע. טכניקות דפוס קונבנציונליות עובדות היטב רק עם צורות פשוטות, אזורים קטנים וחומרים ביולוגיים נבחרים. מאמר זה מתאר שיטה להפצת תרחיפי תאים כמו גם תמיסות מצע למיקרו-ערוצים מורכבים, ארוכים, סגורים (ללא מוצא) של פולידימתילסילוקסן (PDMS) תוך שימוש בלחץ שלילי. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לעצב סובסטרטים מרובים כולל פיברונקטין, קולגן, נוגדנים (Sal-1), פולי-D-ליזין (PDL) ולמינין. דפוס של מצעים מאפשר לעצב בעקיפין מגוון תאים. בדקנו מיובלסטים C2C12, קו תאי העצב PC12, נוירונים בקליפת המוח של חולדות עובריות ונוירונים ברשתית של דו-חיים. בנוסף, אנו מדגימים כי טכניקה זו יכולה לעצב ישירות פיברובלסטים בתעלות מיקרופלואידיות באמצעות יישום קצר של ואקום נמוך על מתלי תאים. הוואקום הנמוך אינו מפחית משמעותית את כדאיות התאים כפי שמוצג על ידי מבחני כדאיות התא. נדונים שינויים ליישום השיטה על סוגי תאים ומצעים שונים. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לעצב תאים וחלבונים בתבניות ספציפיות ללא צורך בחומרים או ציוד אקזוטיים וניתן לבצע אותה בכל מעבדה עם ואקום.

שיטה זו מאפשרת יצירת הדפוסים של חלבוני דפוסים עקיפים של תאים באמצעות ערוצי microfluidic למבוי סתומים עם ממדים קטנים כמו 10 מיקרומטר וציוד זמין כמעט בכל מעבדות ביולוגיות פעם עובש האמן הוא עשה. טכניקה זו יכולה להיות מנוצלת עם ערוצי microfluidic PDMS נוצרו באמצעות photolithography הרך מסורתי, או עם ערוצי microfluidic PDMS שנוצרו עם ייצור סרט דביק (איור 1) 28, 29. אנחנו הוכחנו ...

דוח זה מתאר טכניקה פשוטה וקלה לביצוע, תוך שימוש בוואקום בלחץ נמוך, למילוי תעלות מיקרופלואידיות בתאים ומצעים למחקר ביולוגי.

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

המטרה הכללית של הליך זה היא ליצור תבניות של תאים או סובסטראטים על ידי חלוקתם למיקרו-ערוצים סגורים וארוכים ומורכבים, תוך שימוש בכלי מעבדה פשוטים הזמינים ברוב המעבדות הביולוגיות. שיטה זו יכולה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה בנוגע לאינטראקציות בין תא לתא ובין תא לחלבון. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא קלה לביצוע ודורשת כלים הזמינים בקלות ברוב המעבדות הביולוגיות.באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, שכן היא דורשת אופטימיזציה של תנאי האינקובציה עבור התאים והמצעים שנבחרו על ידי החוקר. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן מיקום נכון של חותמת ה-PDMS והתמיסה משפר באופן משמעותי את השחזוריות של הניסוי. התחילו בשרטוט של תכנית הערוץ המיקרופלואידי באמצעות כלי שרטוט CAD.לאחר מכן, הדפיסו את השרטוט על נייר לבן. כעת, השתמשו באיזופרופנול כדי לנקות שלגייה מזכוכית הגדולה מספיק כדי להכיל את התכנון. ואז ייבשו את השלגייה באמצעות נשיפה של אוויר.הדביקו סרט דביק לעשקית הזכוכית הנקייה, תוך הקפדה לא לכלוא בועות אוויר. לאחר מכן, הדביקו את דפנות עשקית הזכוכית אל הנייר עם התכנון, כך שצדו הדביק של הסרט פונה כלפי מעלה. השתמשו בסקלפל כדי לחתוך את הסרט שעל עשקית הזכוכית, תוך שימוש בתכנון שעל הנייר כנקודת ייחוס.לאחר החיתוך, קלפו את הסרט מהאזורים הבלתי רצויים של השקופית. לאחר מכן, שטפו את השקופית באיזופרופנול כדי להסיר שאריות דבק. לאחר מכן, השתמשו במייבש אוויר כדי לייבש את השטח.לאחר הדפסת התבנית והניקוי, יש לאפות את השקופית במנורת חימום או בתנור בטמפרטורה של 65 °C למשך 30 דקות. לאחר מכן, גלגלו בעדינות גלגל גומי מעל הסרט כדי להוציא בועות אוויר, והניחו לשקופית להתקרר לטמפרטורת החדר בתוך צלח פטרי. התחילו מערבב 10 חלקים של אלסטומר PDMS עם חלק אחד של חומר המקשה, וערבבו את התערובת בעוצמה.לאחר מכן, העבירו את התערובת לתא ואקום כדי לשאוב את הגזים מהתערובת עד שלא יישארו בועות אוויר. שפכו שכבה בעובי 2mm של התערובת על תבנית סרט הדבק, ושאו את הגזים מהתבנית עד להיעלמות כל בועות האוויר. לאחר הקירור, השתמשו בסקאלפל כדי לחתוך את שכבת ה-PDMS במרחק של לפחות 5mm מהאלמנטים.לאחר מכן, קלפו את ה-PDMS המאושר מהתבנית באמצעות פינצטה. קדחו חור כניסה יחיד בעזרת מחורר ביופסיה של 1mm, רצוי בקצה של רשת מיקרו-ערוצים. לאחר מכן, נקו את יציקת ה-PDMS בעזרת סרט דביק, כדי להסיר חלקיקי אבק מההתקן.יש לעקר את התקן מיקרו-ערוצי ה-PDMS על ידי שטיפה בתמיסת אתנול 70%, ולאחר מכן במים דה-יוניים סטריליים, ולאחר מכן לחשוף אותו לאור UV למשך 30 דקות. השתמשו בפינצטה כדי להניח את יציקת ה-PDMS הסטרילית על כיסוי זכוכית סטרילי, והפעילו לחץ קל באמצעות קצה הפינצטה. לאחר מכן, הניחו טיפה של poly-D-lysine בבופר sodium tetraborate על הכניסה של המיקרו-ערוצים.מקמו את פטרית הפטרי תחת ואקום למשך 10 דקות. במהלך זמן זה, שימו לב לאוויר היוצא מהתעלה בצורה של בועות. שחררו את הוואקום ועקבו אחר זרימת תמיסת הסובסטרט אל תוך המיקרו-תעלה. דגרו את הפטריה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת.לאחר מכן, קלפו בזהירות את חותמת ה-PDMS באמצעות פינצטה סטרילית, ושטפו את התבנית שלוש פעמים במים דה-יוניים. הוסיפו תמיסת 1% BSA לכיסוי הזכוכית, כדי להפחית היצמדות לא ספציפית, והדגירו את הדגימה למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C. למחרת, שאבו את תמיסת ה-BSA.כדי להתחיל את הדפוס העקיף של התאים, הכין תרחיף תאים במצע גידול ללא סרום כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. הוסף את תרחיף התאים לצחנית הפטרי עם הדפוס, כך שכל האזור המודפס יהיה טבול בתרחיף התאים. לאחר מכן, דגור את צחנית הפטרי בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור למשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים להיקשר למצע המודפס.לאחר הדגירה, שאבו את שארית תרחיף התאים מתוך פטרית הפטרי ושטפו את התאים בעלי הדגם שלוש פעמים עם PBS, תוך כדי ניעור עדין במשך עשר שניות להסרת התאים שאינם רשומים. לאחר מכן, הוסיפו את מדיום התרבית המתאים לתרביות התאים בעלות הדגם, והדגרו את התאים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור עם באפר פחמן דו-חמצני. לצורך דגמיות ישירה של תאים, ראשית, סטריליזו את המכשיר המיקרופלואידי על ידי שטיפתו בתמיסה של 70% ethanol ולאחריה במים דאיוניים.לאחר מכן, השרו את המכשיר למשך לילה בתמיסה של 1% BSA כדי למנוע היצמדות לא ספציפית של תאים ל-PDMS. ייבשו את המכשיר בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הצמידו אותו לתחתית של צלחת פטרי שעברה טיפול לתרבית רקמות. הניחו 4 עד 8 µL של תמיסות התאים, כמות המספיקה למילוי המיקרו-תעלות, על פתח הכניסה, תוך כיסוי מלא של החור.לאחר מכן, הכניסו את צלחת הפטרי לתא ואקום למשך 10 דקות. שחררו את הוואקום וצפו בזרימה של תרחיף התאים אל תוך המיקרו-ערוץ. דגרו את צלחת הפטרי בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור עם בופר של פחמן דו-חמצני, למשך עד שעה אחת.לאחר מכן, הוציאו את הצלחת מהאינקובטור והשתמשו בפינצטה כדי לקלף בזהירות את ה-PDMS מהצלחת. שטפו את התבנית ב-PBS, ולאחר מכן הוסיפו מצע גידול תאים לצלוחית הפטרי. עם הסיום, החזירו את התאים לאינקובטור.המוצגים כאן הם נוירונים קורטיקליים של עוברי חולדה המודפסים על פני שטח של poly d lysine ולמינין. מיקום התאים מעיד על היצמדות כללית לאזורים המודפסים וצמיחה לאורך פסי ה-PDL והלמינין. מוצגים כאן, בהגדלה גבוהה יותר, מיובלסטים מסוג C2C12.סוג תאים זה נצמד גם הוא לאזורים המודפסים ומדגים היתוך לשרירים רב-גרעיניים (myotubes). טכניקה זו הותאמה גם לדפוס תאים ישיר, המוצג כאן עם פיברובלסטים. לשיטה זו של דפוס תאים ישיר אין השפעה שלילית על הישרדות התאים.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לענות על שאלות נוספות הנוגעות למיקום חלבונים או לאינטראקציות בין תאים לתשתית. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי מיקום נכון של טיפת התאים או של תמיסת התשתית כך שיכסו את כל ההשכבה (inlay) הוא קריטי להצלחה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי המוח לחקור את הנחיית האקסונים של הפוטורצפטורים בביולוגיה של הרשתית.לאחר צפייה בסרטון זה, אמור להיות לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לתבנית תאים ותשתיות באמצעות התקני מיקרופלואידקה מ-PDMS חדירים לגז, תוך שימוש בלחץ שלילי. תודה לצפייה ובהצלחה בניסוי שלכם.

a-versatile-method-of-patterning-proteins-and-cells

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו להדגים שיטה פשוטה עבור הצבת תאים במקומות הרצויים על המצע. שיטה זו דפוסי תאים על ידי הטלת שבב סיליקון שמכיל microwells מלא תאים על גבי המצע. שיטה זו מספקת דרך חדשה כדי לווסת איתות diffusible ו juxtacrine בין תאים.

דפוסים של תאים עובריים באמצעות שבב להעיף ביו

הדפסה Microcontact נעשה שימוש נרחב על חלבונים ומולקולות אחרות דפוס על משטחי חומר. אנו מדגימים את השלבים הבסיסיים של תהליך זה, ביול דפוסים של פיברונקטין על זכוכית.

Microcontact הדפסה של חלבונים עבור ביולוגיה של התא

מערכות מימיות שני שלבים שמשו בו זמנית לאוכלוסיות רבות הדפוס של תאים. השיטה מהירה וקלה זה עבור דפוסי תא מנצלת את הפרדת פאזות של תמיסות מימיות של גליקול dextran ופוליאתילן ומתח interfacial שקיים בין שני פתרוני הפולימרים.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

פרוטוקול זה מתאר שיטת microfabrication התואם לדפוסי תא על SiO 2. עיצוב parylene-C מוגדר מראש מודפס photolithographically על SiO 2 הוופלים. תאים לאחר דגירה עם סרום (או פתרון הפעלה אחר) לדבוק במיוחד ל( ולגדול בהתאם להתאמה של) parylene-C שבבסיס, בעוד שנהדף על ידי SiO 2 אזורים.

תא דפוסים על photolithographically מוגדר Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; מצעים

בשיטה זו, אנו משתמשים photopolymerization, לחץ על כימיה טכניקות ליצירת דפוסים חלבון או פפטיד על פני השטח של hydrogels פוליאתילן גליקול (PEG), מתן מתאושש אותות ביו לצורך המחקר של תגובות הסלולר במבחנה .

תכנים חלבונים ביו או פפטידים על הידרוג באמצעות פוטוכימיה עבור יישומים ביולוגיים

השיטה המוצגת כאן משתמשת במיקרוגרף יחד עם הדמיה כמותית לחשיפת הארגון המרחבי בתוך תרבויות היונקים. הטכניקה היא קלה להקים מעבדה סטנדרטית בביולוגיה התא והוא מציע מערכת צייתן לחקור מבחנה בפריפרייה.

מיפוי הארגון המרחבי של תאי היונקים באמצעות מיקרודפוסים והדמיה כמותית

המטרה הכללית שלנו היא להבין כיצד תאים התחושה מסחטות רמזים כי להוביל צמיחה סיבי מכוון. כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה של adsorption מולקולרית המושרה אור של חלבונים, משמש כדי לייצר מיקרו דפוסים מוגדרים של מטריקס רכיבים מטריצות על מנת ללמוד אירועים ספציפיים השולטים אקסון הצמיחה ואת מציאת.

המושרה באור Adsorption מולקולרית של חלבונים באמצעות מערכת פרימו עבור מיקרו הפנינג כדי ללמוד התגובות לתא מטריצות חלבונים מטריקס

כאן אנו מציגים פרוטוקול לתאים זעירים ברזולוציה של תא בודד באמצעות הידבקות מתוכנתת DNA. פרוטוקול זה משתמש בפלטפורמת פוטוליטוגרפיה על הספסל כדי ליצור דפוסים של אוליגונוקלאוטידים DNA על שקופית זכוכית ולאחר מכן תוויות קרום התא עם אוליגונוקלאוטידים משלימים זמינים מסחרית. הכלאה של אוליגוס גורמת הידבקות תאים מתוכנתים.

דפוס פשוט, זול ומודולרי של תאים המשתמשים ב- DNA

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר ייצור אוטומטי של מיקרופטרנים המתקננים את צורת התא כדי לחקור מבנים ציטוסקלטליים בתוך תאי יונקים. טכניקה ידידותית למשתמש זו ניתנת להגדרה עם מערכות הדמיה זמינות מסחרית ואינה דורשת ציוד מיוחד שאינו נגיש למעבדות סטנדרטיות לביולוגיה של התא.

שליטה בגיאומטריית התא באמצעות מיקרופטרנינג בסיוע לייזר אינפרא אדום

אנו מתארים שיפורים בשיטה סטנדרטית למדידת כוחות המתיחה התאית, המבוססת על הדפסה מיקרו-קונטרקטית עם שלב דפוס תת-קרקעי יחיד של מערכי נקודות של חלבוני מטריצה חוץ-תאית על הידרוג'לים רכים. שיטה זו מאפשרת ייצור פשוט ועקבי יותר של דפוסי איים, החיוניים לשליטה בצורת צביר התאים.

יצירת תבניות למיקרוסקופיית מתיחה מיקרופטרן

באופן מסורתי, תרבית תאים מבוצעת על מצעים מישוריים המחקים בצורה גרועה את הסביבה הטבעית של תאים in vivo. כאן אנו מתארים שיטה לייצור מצעי תרביות תאים עם גיאומטריות מעוגלות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית וחלבונים חוץ-תאיים מיקרו-פטרייתיים, המאפשרת חקירה שיטתית של חישה תאית של רמזים חוץ-תאיים אלה.

יצירת מיקרו-סביבה תאית רב-תכליתית על-ידי UV-Photopatterning של מצעי תרביות תאים תלת-ממדיים

למדו שיטה ליצירת דפוסי תאים במיקרו-ערוצים באמצעות ואקום בלחץ נמוך. טכניקה זו מאפשרת חקר אינטראקציות בין תאים וחלבונים במעבדות ביולוגיות.

שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים

גלה סרטונים נוספים