שיטה צדדית של חלבוני דפוסי תאים
26 בפברואר 2017
דוח זה מתאר טכניקה פשוטה וקלה לביצוע, תוך שימוש בוואקום בלחץ נמוך, למילוי תעלות מיקרופלואידיות בתאים ומצעים למחקר ביולוגי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לעצב תאים או מצעים על ידי הפצתם למיקרו-ערוצים מורכבים, ארוכים וסגורים באמצעות כלים פשוטים הזמינים ברוב המעבדות הביולוגיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה בנוגע לאינטראקציות בין תא לתא ותא לחלבון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא קלה לביצוע והיא דורשת רק כלים הזמינים ברוב המעבדות הביולוגיות.
בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהיא דורשת אופטימיזציה של תנאי הדגירה עבור התאים והמצעים שנבחרו על ידי החוקר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן המיקום הנכון של חותמת ה-PDMS והתמיסה משפר משמעותית את יכולת השחזור של הניסוי. התחל בשרטוט הפריסה של המיקרו-ערוץ באמצעות כלי ציור CAD.
לאחר מכן, הדפס את הציור על נייר לבן. לאחר מכן, השתמש באיזופרופנול כדי לנקות מגלשת זכוכית גדולה מספיק כדי להכיל את העיצוב. ואז יבש את המגלשה בעזרת אקדח אוויר.
חבר סרט דבק למגלשת הזכוכית המנקה, הקפד לא ללכוד בועות אוויר. לאחר מכן, הדביקו את דפנות מגלשת הזכוכית על הנייר עם העיצוב, כך שצד הקלטת פונה כלפי מעלה. השתמש באזמל כדי לחתוך את הסרט על שקופית הזכוכית, תוך שימוש בעיצוב הנייר כהפניה.
לאחר החיתוך, קלף את הסרט מהאזורים הלא רצויים של מגלשת הזכוכית. לאחר מכן, שטפו את שקופית הזכוכית עם איזופרופנול כדי להסיר שאריות דבק. ואז השתמש באקדח אוויר כדי לייבש את המשטח.
לאחר התבנית והניקוי, אופים את שקופית הזכוכית בתנור בחום של 65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, גלגלו בעדינות את הסרט בעזרת גלגלת גומי, כדי להסיר בועות אוויר ולאפשר לשקופית להתקרר לטמפרטורת החדר בצלחת פטרי. התחל בערבוב 10 חלקים של אלסטומר PDMS עם חלק אחד מחומר הריפוי שלו וערבב את התערובת במרץ.
לאחר מכן, הכניסו את התערובת לתא ואקום כדי לנקות את התערובת עד שלא יישארו בועות אוויר. יוצקים שכבה בעובי 2 מ"מ מהתערובת על תבנית סרט ההדבקה, ומסירים את הגז מהתבנית עד שכל בועות האוויר נעלמות. לאחר הקירור, השתמש באזמל כדי לחתוך את שכבת ה-PDMS במרחק של לפחות 5 מ"מ מהתכונות.
ואז, מקלפים את ה-PDMS הנרפא מהתבנית בעזרת פינצטה. אגרוף חור כניסה יחיד עם אגרוף ביופסיה של 1 מ"מ, רצוי בקצה רשת של מיקרו-ערוצים. לאחר מכן, נקה את יציקת ה-PDMS עם סרט דבק, כדי להסיר חלקיקי אבק מהמכשיר.
עקר את מכשיר המיקרו-ערוץ PDMS על ידי שטיפתו בתמיסה של 70% אטנול, ולאחר מכן מים סטריליים נטולי יונים, וחשוף אותו לאור UV למשך 30 דקות. השתמש בפינצטה כדי להניח את יציקת ה-PDMS הסטרילית על משטח כיסוי זכוכית סטרילי, והפעל לחץ עדין באמצעות קצה הפינצטה. לאחר מכן, הנח טיפה של פולי d ליזין במאגר נתרן טטרבוראט על כניסת המיקרו-ערוצים.
מניחים את צלחת הפטרי תחת ואקום למשך 10 דקות. במהלך תקופה זו, צפו באוויר היוצא מהתעלה בצורה של בועות. שחרר את הוואקום והתבונן בתמיסת המצע הזורמת לתוך המיקרו-ערוץ דגרו את המנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
לאחר מכן, קלפו בזהירות את חותמת ה-PDMS בעזרת פינצטה סטרילית, ושטפו את התבנית שלוש פעמים במים נטולי יונים. הוסף תמיסת BSA של 1% לכיסוי הזכוכית, כדי להפחית הידבקות לא ספציפית, ודגירה על הדגימה למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. למחרת, שאפו את תמיסת ה-BSA.
כדי להתחיל את הדפוס העקיף של תאים, הכן תרחיף תאים במדיום תרבית חופשי בסרום כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הוסף את תרחיף התא לצלחת הפטרי המעוצבת, והטביע לחלוטין את האזור המעוצב בתרחיף התא. לאחר מכן, דגרו את צלחת הפטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור למשך 15 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד למצע המעוצב.
לאחר הדגירה, שאפו את תרחיף התאים העודפים מצלחת הפטרי ושטפו את התאים המעוצבים שלוש פעמים עם PBS, תוך ניעור עדין במשך עשר שניות כדי להסיר את התאים הלא מחוברים. לאחר מכן, הוסף את מדיום התרבית המתאים לתרביות התאים המעוצבות, ודגר את התאים המעוצבים ב-37 מעלות צלזיוס בחממה עם פחמן דו חמצני. לדפוס ישיר של תאים, ראשית, יש לעקר את המכשיר המיקרופלואידי על ידי שטיפתו בתמיסה של 70% אתנול ואחריה מים נטולי יונים.
לאחר מכן, יש להשרות את המכשיר למשך הלילה בתמיסה של 1% BSA כדי למנוע הידבקות תאים לא ספציפית ל-PDMS. יבש את המכשיר בטמפרטורת החדר ואז חבר אותו לתחתית צלחת הפטרי שטופלה בתרבית רקמות. הניחו 4 עד 8 מיקרוליטר של מתלה התאים, מספיק כדי למלא את המיקרו-תעלות, על הכניסה, ומכסים לחלוטין את החור.
לאחר מכן, הכניסו את צלחת הפטרי לתא ואקום למשך 10 דקות. שחרר את הוואקום והתבונן בתרחיף התאים הזורם לתוך המיקרו-ערוץ. דגרו את צלחת הפטרי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם פחמן דו חמצני, עד שעה.
לאחר מכן, הוציאו את המנה מהחממה והשתמשו בפינצטה כדי לקלף בזהירות את ה-PDMS מהמנה. שטפו את התבנית עם PBS, ולאחר מכן הוסיפו מצע תרבית תאים לצלחת הפטרי. בסיום, הכניסו את התאים בחזרה לאינקובטור.
מוצגים כאן נוירונים בקליפת המוח של חולדות עובריות המעוצבים על משטחי פולי d ליזין ולמינין. מיקום התאים מדגים היצמדות כללית לאזורים המעוצבים וצמיחה לאורך פסי ה-PDL והלמינין. מוצגים כאן, בהגדלה גבוהה יותר, מיובלסטים C2C12.
סוג תא זה נצמד גם לאזורים המעוצבים ומדגים היתוך לתוך צינורות שריר מרובי גרעינים. הטכניקה הזו הותאמה גם לדפוס תאים ישיר, שמוצג כאן עם פיברובלסטים. לשיטת דפוס תאים ישירה זו אין השפעה שלילית על הישרדות התאים.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מיקרוסקופיה פלואורסצנטית על מנת לענות על שאלות נוספות הכוללות לוקליזציה של חלבון או אינטראקציות תא-מצע. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שמיקום נכון של טיפת התאים או תמיסת המצע כדי לכסות את כל השיבוץ הוא קריטי להצלחה. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מדעי המוח לחקור הנחיית אקסון קולטני אור בביולוגיה של הרשתית.
לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעצב תאים ומצע עם התקנים מיקרופלואידיים PDMS חדירים לגז באמצעות לחץ שלילי. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסוי שלך.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
דו"ח זה מתאר טכניקה פשוטה וקלה לביצוע, המשתמשת בוואקום בלחץ נמוך, למילוי תעלות מיקרופלואידיות בתאים ובסובסטרטים למחקר ביולוגי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה בנוגע לאינטראקציות בין תא לתא ובין תא לחלבון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מחקר ביולוגי
- מיקרופלואידיקה
- אינטראקציות בין תאים
רקע
- הטכניקה משתמשת בוואקום בלחץ נמוך למילוי מיקרו-ערוצים.
- היא תוכננה לשימוש עם כלי מעבדה זמינים.
- אופטימיזציה של תנאי הדגירה נחוצה ליישום מוצלח.
- הדגמה חזותית משפרת את השחזוריות של השיטה.
מטרת המחקר
- ליצירת תבניות של תאים או תשתיות בערוצים מיקרוסקופיים.
- לסיוע במחקר על אינטראקציות בין תאים.
- לספק שיטה פשוטה וישירה עבור חוקרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בוואקום בלחץ נמוך למילוי תעלים מיקרופלואידיים.
- תכנון פריסות של מיקרו-תעלים באמצעות כלי CAD.
- מיקום חותמות PDMS לשיפור התוצאות.
- אופטימיזציה של תנאים עבור תאים ותשתיות ספציפיים.
תוצאות עיקריות
- מילוי מוצלח של מיקרו-ערוצים בתאים ובמצעים.
- שיפור השחזוריות באמצעות טכניקה נכונה.
- הוכחת יעילות בחקר אינטראקציות ביולוגיות.
- שיטה נגישה לחוקרים במעבדות ביולוגיות.
מסקנות
- הטכניקה קלה לביצוע ויעילה למחקר ביולוגי.
- היא מאפשרת יצירת דפוסים מורכבים של תאים ותשתיות.
- עזרים חזותיים הם קריטיים ליישום מוצלח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת בקרה מרחבית מדויקת של חלבונים ותאים בגיאומטריות מיקרופלואידיות מורכבות באמצעות כלים מעבדתיים נגישים, ובכך היא תומכת במחקרים מכניסטיים של אינטראקציות בין תא לתשתית ובין תא לתא. על ידי ביטול הצורך בציוד ייעודי או בחומרים נדירים, היא מפחיתה חסמים טכניים עבור תיקוף מטרות ופיתוח בדיקות בשלבי הגילוי המוקדמים. הגישה מגבירה את הביטחון החזוי בסריקה פנוטיפית על ידי יצירת מיקרו-סביבות הניתנות לשחזור ורלוונטיות למחלה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות הצגה מבוקרת של סובסטרטים כגון fibronectin, collagen ו-laminin להערכת היצמדות תאים ואיתות.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות תבנית של סוגי תאים מרובים, כולל שורות עצביות ופיברובלסטים, להערכת תגובות ספציפיות למסלול.
- ערך חיזוי: מקל על הפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מתן אפשרות להשוואה ישירה של התנהגות תאים על תבניות חלבון מוגדרות, ובכך משפר את רמת הביטחון במטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מצעים בעלי תבנית חלבונים סטנדרטית להערכה כמותית של השפעות תרכובות על היצמדות תאים, פריסתם או התמיינותם.
- ערך תפעולי: מאפשר הדירות של הבדיקה באמצעות מילוי מונע-ואקום של מיקרו-ערוצי PDMS ארוכים וסגורים, ובכך מפחית את השונות בציפוי המצע.
- יכולת הרחבה: תומך בשימוש חוזר בפלטפורמה עבור סוגי תאים ומצעים שונים במינימום התאמות של הציוד, דבר המשפר את המוכנות לסריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: תבנית של נוירונים ראשוניים ונוירונים המופקים מתאי גזע (למשל, תאי קליפה עובריים של חולדה, תאי רשתית של דו-מינאיים) לצורך מידול רשתות עצביות רלוונטיות למחלה לצורך הערכה פרה-קלינית של מטרות טיפוליות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מאפשרת מחקר של צמיחת נוריטים והכוונה אקסונית על למינין או PDL בתבנית, ובכך תומכת במידול חיזוי של יעילות נוירו-תרפויטית.
- קידום מותאם סיכונים: מאפשר התבנית עקיפה של סוגי תאים מגוונים באמצעות ציפוי מוקדם של התשתית, דבר המקל על עקביות בין-מודלית במחקרי מעורבות מטרה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזה של מטרה ועד לזיהוי מוביל (lead), ובכך היא מאפשרת בחינה מכניסטית לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים על ידי תבנית של סובסטרטים לבידוד סיגנלים המתווכים על ידי אינטגרין או רמזי הנחיה עצבית בסביבות מיקרו מבוקרות.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות בעלות רזולוציה מרחבית של אינטראקציות תא-סובסטרט בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, מה שמאפשר השוואה בין תנאים.
- אנליטיקה: יוצרת תבניות התואמות לדימיג'ינג התומכות בניתוח מורפומטרי של יישור תאים, היתוך (למשל, יצירת myotube), או אורך נוריטים כנקודות קצה פנוטיפיות.
- מחקר תרגומי: מתחבר לעבודה פרה-קלינית על ידי יצירת תבניות של נוירונים רלוונטיים למחלה כדי להעריך הישרדות או הבשלה תלויות-סובסטרט, רק כאשר הדבר נתמך במקור.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כמודול תבניות הניתן להתאמה עבור פרויקטים מרובים, ובכך מפחית את התלות במעבדות ליבה ייעודיות למיקרו-פבריקציה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באינטראקציות בין תאים לתשתיות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות מילוי בסיוע ואקום, מה שממזער את השונות התלויה במשתמש בהשקעת חלבונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי מתן אפשרות להערכה מוקדמת של השפעות תרכובות על היצמדות או מורפולוגיה בהקשרים רלוונטיים פיזיולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון באמצעות אספקת נתונים מכניסטיים על מעורבות המטרה לפני השקעה משמעותית באופטימיזציה של מובילים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון מיקרופלואידיקה, טיפול ב-PDMS וטכניקה סטרילית ליישומים של תרבית תאים.
- תלוי בגישה לתאי ואקום, כלי CAD ואינקובטורים סטנדרטיים לתרבית תאים לצורך אופטימיזציה וביצוע.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של זמני אינקובציה, משך הוואקום וריכוזי סובסטרט כדי להבטיח הדירות בין משתמשים שונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה לסוגי תאים חדשים או חלבוני מטריקס, כפי שצוין בצורך באופטימיזציה של התנאים.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הדרישה למיקום מדויק של טיפות כדי למלא באופן מלא רשתות של מיקרו-ערוצים, דבר המשפיע על שיעור ההצלחה.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Fabrication of Master Molds for Soft Lithography Using Adhesive Tape
2:32
Soft Lithography Fabrication of PDMS Devices
4:02
Substrate Patterning
5:22
Indirect Patterning of Cells
6:29
Direct Patterning of Cells
8:05
Results: Direct and Indirect Patterning of Cells
8:56
Conclusion
