Name: שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: למד שיטת סינון לזיהוי מעכבי קינאזות המווסתות פלוריפוטנטיות של תאי גזע עובריים בעכברים. הפרוטוקול משתמש בציוד סטנדרטי ומספק תוצאות תוך 72 שעות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CACW נתמך על ידי דוקטורט המועצה למחקר רפואי PhD. GMF נתמך בחלקו על ידי מחקר רפואי המועצה פרס חדש החוקר (MR / N000609 / 1) ומענק מחקר Tenovus סקוטלנד.

1. איסוף של קטן מולקולה Kinase מעכבי ספריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף ספריות מעכבות מאוספי מעכבי קינאז נגישים לציבור, כגון ספריית הרשתות המשולבות מבוססות רשת (LINCS) מבית הספר לרפואה של הרווארד, אוסף ממוקד של 228 מעכבי קינאז רבי עוצמה וסלקטיביים (http://lincs.hms.harvard.edu) , ואת Proinin Kinase inhibitor Set (PKIS), אוסף 376 המתחם התאספו על ידי חוקרים תעשייתיים (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . לחלופין, להרכיב אוסף מעכב קינאז מעכב מתוך תרכובות זמין מסחרית. הערה: במעבדה שלנו, יש לנו התאספו אוסף של 72 מעכבי קינאז כלי חזק סלקטיבי המכסים 51 קינאזות היעד העיקרי, כל אלה זמינים ממקורות מסחריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מעכבי קינאז לתוך צלחות 96-היטב עבור עיבוד תפוקה גבוהה אופטימלית בריכוזים מרובים (השתמש 1, 0.1 aNd 0.01 מ&quot;מ). כלול בכל בארות בקרת צלחת המכילה DMSO בלבד מעכבי בקרה התייחסות PD173074 (FGFRi) ו Ruxolitinib (JAKi), אשר ידועים לקדם מדינות pluripotent נאיבי מתוחכם בהתאמה. הוסף הערות בגיליון אלקטרוני או בתוכנה דומה. </li></ol> 2. mESC תנאי התרבות והנהלים להכנת מסך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.1% ג &#39;לטין מצופה 10 ס&quot;מ מנות על ידי הוספת 5 מ&quot;ל של 0.1% (w / V) ג&#39; לטין עד 10 צלחות ס&quot;מ ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לשאוב ג&#39;לטין ולתת צלחת יבש במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות כל קו mESC רגיל ב 37 ° C 5% CO 2 על 0.1% ג &#39;לטין מצופה 10 ס&quot;מ מנות בתקשורת mESC סטנדרטי (ראה טבלה חומרים) המכיל 100 ng / mL GST-LIF, 10% עגל סרום סרום 5% סרום נוקאוט תַחֲלִיף. החלף מדי יום את התקשורת ואת mESCs המעבר סביב confluency 80% בכל יום שני בדילול של 1: 5-1: 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעבור mESCs, לשאוב התקשורת לשטוף עם 5 מ&quot;ל oF פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) לכל צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל טריפסין-EDTA (0.05% טריפסין, 0.02% EDTA) לכל צלחת של mESCs ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים trypsinized ב 4 מ&quot;ל של התקשורת mESC ו צנטריפוגה בסל&quot;ד 1,200 במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביסודיות resuspend תא גלולה ב 5 מ&quot;ל של התקשורת mESC, pipetting למעלה ולמטה כדי ליצור השעיה תא בודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים על ידי שילוב של השעיה 10 תא μL ו 10 μL של Trypan כחול (0.4%). מקום לתא ספירה תא או להשתמש hemocytometer ומיקרוסקופ אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 3 x 10 3 mESCs לתוך 0.1% ג&#39;לטין מצופה 96 צלחות היטב, נפח סופי 100 μL של התקשורת, באמצעות פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מעכבי קינאז ב דילול 1: 100 (מעכב 1 μL הוסיף 100 Media μL) באמצעות פיפטה רב ערוצי. בעדינות פיפטה התקשורת לערבב מעכב ההשעיה תא, ולאחר מכן לאפשר תאים להתיישב ברדס תרבות רקמה עבור 1 שעות כדי להבטיח את הפצה שווה אקרוSs משטח ציפוי. תרבות תאים במשך 48 שעות מבלי לשנות את התקשורת. הערה: לוחות מלאי של 0.1 / 0.1 / 0.01 מ&quot;מ ייתן ריכוז מעכב סופי של 10/1 / 0.1 מיקרומטר בהתאמה. אנו ממליצים להתחיל את המסך בריכוז סופי של 1 מיקרומטר כדי להבטיח עיכוב יעיל של קינאזים היעד העיקרי תוך מזעור מחוץ לכוון השפעות. </li></ol> 3. קינאז מעכבים ניתוח הקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 96 צלחות mESC גם 200 μL PBS באמצעות אספירטור רב ערוצי ו pipettes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את תמציות התא μL 150 של חיץ תמוגה (20 מ&quot;מ טריס pH 7.4, 150 מ&quot;מ NaCl, 1 מ&quot;מ EDTA, 1% NP-40 (v / v), 0.5% נתרן deoxycholate (w / v), 10 מ&quot;מ β-glycerophosphate , 10 מ&quot;ל pyrophosphate נתרן, 1 NaF mM, 2 mM Na 3 VO 4 , Protease מעכב שלם קוקטייל טבליות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבהיר תמציות על ידי צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 30 דקות V- התחתונה 96 צלחות היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Immobilize 100 μL של supernatants על nitrocel<html> קרום lulose באמצעות 96-גם ואקום נקודה כתם סעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את הממברנה, ואת הכתם עם 40 מ&quot;ל של Ponceau S כדי להבטיח העברה עקבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום עם TBST ולחסום ב TBST / 3% (w / V) חלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בננוג ו Dnmt3b נוגדנים בדילול של 1: 1000 (v / v) ב TBST / 3% (w / v) אבקת חלב לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנות ב 3 x 10 דקות ב TBST ו דגירה ב 30 מ&quot;ל של נוגדנים משניים בדילול של 1: 10,000 (v / v) ב TBST / 3% (w / V) חלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח באמצעות מערכת דיגיטלית immunoblotting הדמיה. הערה: אם אפשר, להשתמש immunoblotting פלואורסצנטי כמותי כדי לזהות Nanog ו Dnmt3b. עם זאת, האות הרקע של Dnmt3b על ידי immunoblotting פלואורסצנטי גבוה מדי. לכן, 800 ננומטר פלואורסצנטי נגד ארנבת (ננוג) ו anti-mouse-HRP (Dnmt3b) נוגדנים משניים משמשים. </li></ol> 4. ניתוח של נתוני המסך ו אימות של מעכבים כמו רגולטוריים plaipipotency בתום לב &gt; הערה: זהו צעד קריטי כדי להבטיח כי רק מאפננים ploreipotency בתום לב מזוהים. זה חיוני מעכבי triage מבוסס על שניהם Nanog: יחס Dnmt3b ואת האות הכולל, כדי להבטיח כי מעכבי קינאז אשר משפיעים לרעה הישרדות mESC לא נבחרו לניתוח נוסף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת ננוג האות Dnmt3b באמצעות תוכנת ניתוח immunoblotting, ואת ערכי ייבוא ​​לתוך גיליון אלקטרוני או תוכנה דומה. חישוב ננוג: יחס Dnmt3b עבור כל דגימות לעומת שליטה DMSO. כמו כן, לקבוע את סך Nanog ו Dnmt3b האות כדי להבטיח כי מעכבי kinase לא משפיעים על Nanog: Dnmt3b יחס ידי שינוי mESC הכדאיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש דירוג ננוג: יחסי Dnmt3b לזהות מעכבים אשר לקדם את pluripotency נאיבי (Nanog: Dnmt3b יחס גבוה יותר מאשר שליטה) ו ploripotency מתוחכם (Nanog: Dnmt3b יחס נמוך יותר מאשר שליטה). הגדר לחתוך סטייה 2x מערכי הבקרה, לסנן מעכבי kinase אשר מייצרים סך Nanog + Dnmt3b האות פחות מזה50% מערך הבקרה DMSO כדי ליצור רשימת אמון גבוהה של מעכבי קינאז אשר מייצב נאיבי (גבוה Nanog: Dnmt3b יחס) ו מתוחכם (נמוך Nanog: Dnmt3b יחס) pluripotent מדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אימות מעכבי קינאז ידי זריעת mESCs ב 2 x 10 5 תאים לכל 6 היטב התקשורת 2 מ&quot;ל, ולהוסיף מעכבי קינאז ב 1 מיקרומטר במשך 48 שעות, ללא שינוי התקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyse mESCs במאגר תמוגה ולנתח ביטוי Nanog ו Dnmt3b ידי immunoblotting SDS-PAGE קונבנציונאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוד לאמת את הלהיטים על ידי SDS-PAGE immunoblotting עבור סמנים pluripotency נאיבי Klf2 ו Klf4, ו Oct4 כדי להבטיח כי pluripotency נשמר לאחר טיפול 48 שעות מעכב. </li></ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li>
<li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li>
<li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li>
<li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li>
<li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li>
<li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li>
<li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+domains+of+Sos1%2FGrb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li>
<li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li>
<li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li>
</ol>

המחברים אינם מכריזים על ניגודי אינטרסים הנובעים ממחקר זה.

כאן אנו מדגימים מתודולוגיה נגישה נרחב כדי לחקור את התפקיד של נתיבי איתות kinase ב ויסות המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם. זה מתייחס לשאלת מפתח בתחום ESC. למרות גישות גבוהות גנומיקה ו transcriptomics משמשים באופן שגרתי כדי לזהות הרגולטורים תמלול מפתח של מדינות pluripotent תמים ו מתוחכם, רשתות איתות איתות pluripotency הוכיחה להיות מאתגר. כעת אנו מספקים אסטרטגיה גמישה המעסיקים מעכבים כימיים כדי לזהות קינאזות השולטות המעבר pluripotent נאיבי תחולתי ב mESCs. זה מסתמך על ציוד פשוט, ריאגנטים וחומרים הזמינים ברוב המעבדות כי המחקר תא איתות ESC ביולוגיה. קריטי להצלחת פלטפורמה זו הוא הפיתוח שלנו assay חסון לכמת את המעבר בין מדינות pluripotent נאיבי מתוחכם. הקמת assay זה נדרש שינויים משמעותיים iterative כדי plat התאצפיפות ing, זמן הדגירה inhibitor ו immunoblotting תנאים. גישות מולקולות קטנות צוברים מתיחה לשימוש רציונלי ביישומים ESC טיפוליים 15 , 16 . כוח גדול של מולקולה קטנה ההקרנה היא כי תרכובות כלי מתוכננים ו / או שונה עבור ספיגת יעיל הסלולר. יעילות Transfection אינו מגביל, ושימוש במערכות מסירה מסוכנים כגון lentivirus אינו הכרחי. יתר על כן, מעכבים לעיתים קרובות לעכב מספר isoforms בתוך משפחה kinase ( למשל Fgfr1-4, Jak1-3), אשר מתגבר יתירות תפקודית כי מעכב גנטי / גנומי טכניקות הפרעה כגון RNAi ו CRISPR / Cas9. כמו תרכובות כלי חזק יותר סלקטיבי להיות זמין הן אקדמיות והן תרופות גילוי תרופות, מובחנים ולא מבינים קינאזות יהיה דחף לחזית המחקר ESC. לכן אנו מציעים כי זה גבוהגישת הקרנת הגלם תפתח אפיקים חדשים של מחקר לתוך רשתות הליבה ESC הליבה. מגבלה אחת קטנה של טכנולוגיה זו היא שאפילו המעכבים המולקולים הקטנים והסלקטיביים ביותר מעכבים ומעכבים קינאזות רבות שאינן קשורות ל- vivo . עם זאת, נתונים מקיפים יותר ויותר קינאז מעכב פרופיל מאפשר מטרות פונקציונליות של מעכבי קינאז להיות מזוהה בקלות (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase מעכבים). לבסוף, באופן עקרוני הפלטפורמה שלנו ניתן להחיל לחקור כל אוסף מולקולה קטנה ו / או assay הסלולר אשר באיכות גבוהה immunoblotting נוגדנים זמינים. זה יאפשר לימוד של מספר מערכות רגולטוריות ב ויסות pluripotency ולאפשר זיהוי של מעכבי מולקולה קטנה אשר לשנות תהליכים תאיים מגוונים. באופן ספציפי, אנו רואים כי יישום של אוספי מולקולה קטנה המתעוררים כגון האפיגאןבדיקות טיק המפותחות על ידי קונסורציום גנומי מבנית (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) יש פוטנציאל לחשוף רגולטורים רומן נוסף של מעברים pluripotent.

תאי גזע עובריים (ESC) יש את היכולת עצמית לחדש או להבדיל לתוך כל סוג התא בגוף המבוגר, תופעה הידועה בשם pluripotency 1 . עדויות אחרונות מצביעות על כך שקיימות מצבים מובהקים מבחינה התפתחותית, הנקראים &quot;יכולת נאיבית&quot; ו&quot;מתוחכמת &quot;. ESCs נאיבי מייצגים מצב של התפתחות דומה לזו שנמצאה בעובר preimplantation 3 . לעומת זאת, ESCs pledipotent מתוחכם עומדים לצאת pluripotency ולהבדיל לשושלות עובריים מיוחדים 4 , 5 . מדינות נאיביות ופלומות מסומנות מסומנות על ידי רשתות רגולטוריות שונות. פלוריפוטיות נאיבית מאופיינת על ידי ביטוי של גורמי תעתיק גורמי מפתח כגון ננוג, גורמי תעתיק כמו Krueppel (Klfs), Rex1 2 ו Esrrb <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. ב ESCs העכבר (mESCs), pluripotency מתוחכם מאופיין בביטוי מופחת של סמנים נאיבי ביטוי ביטוי גנטי ספציפי הכולל את דה novo DNA methyltransferase Dnmt3b 7 . ב vivo , מתוחכם pluripotent שלאחר השתלת epiblast בתאי גזע (EpiSCs) 4 , 5 בנוסף לבטא את הסמן Epiglast Fgf5 ו סמנים של תחול השושלת כגון Brachyury 8 . MESCs לספק מודל tractable כדי לחקור מנגנונים השולטים נאיבי- primed מעברים pluripotent במבחנה . כאשר מתורבת גורם בלוקמיה מעכב (LIF) וסרום שור העובר (FBS), mESCs עוברים המעבר הדינמי בין מדינות pluripotent נאיבי ו מתוחכם 9 , 10 . LIF-Jak-Stat3 פונקציות איתות כדי לקדם את רשת נאיבית רגולטורית רשת 11 </Sup&gt;, בעוד איתות אוטוקריני באמצעות גורם הצמיחה fibroblast 4 (Fgf4) Erk1 / 2 נתיבים המעבר למצב תחולתי 12 . עם זאת, זה נשאר אתגר כדי להעריך באופן שיטתי את התפקיד של קינאזות חלבון בקביעת מדינות pluripotent מובהק. כאן, אנו מתארים פלטפורמה כמותית ומדרגית שבאמצעותה ניתן לבצע מסכי מולקולה קטנים הממוקדים עבור הרגולטורים של קינאז של המעבר pluripotent נאיבי תחולתי. אנו משתמשים בתנאים פשוטים תרבות mESC ו ריאגנטים סטנדרטיים, חומרים וציוד לחשוף ולאמת מעכבי קינאז עם יכולת unrecreciated עד כה לייצב pluripotency נאיבי. יתר על כן, אנו דנים יישומים מורחבת פוטנציאליים עבור טכנולוגיה זו, כולל עבור הקרנה של אוספים מולקולה קטנה אחרים כגון ספריות מעכבי המתעוררים המכוונים הרגולטורים epigenetic.

<table><tbody><tr><td>mESC media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESCs</td><td>ATCC ATCC</td><td>&nbsp; SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>גיבקו</td><td>25030081</td><td>גמר: 2 מ"מ</td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ג'יבקו</td><td>15140122</td><td>גמר: 50 יח'/מ"ל</td></tr><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>סיגמא</td><td>M6250</td><td>סופי: 0.1 מ"מ</td></tr><tr><td>גורם מעכב לוקמיה (היתוך GST)</td><td>ריאגנטים ושירותים</td><td></td> MRC-PPU <td>סופי: 100 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>גורם מעכב לוקמיה</td><td>תרמו</td><td>PMC9484</td><td>סופי: 100 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>גמר: 0.1 מ"מ</td></tr><tr><td>נתרן פירובט</td><td>ג'יבקו</td><td>11360070</td><td>גמר: 1 מ"מ</td></tr><tr><td>החלפת סרום נוקאאוט</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>גמר: 5%</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מוגדר</td><td></td><td>פישר 10703464</td><td>סופי: 10%</td></tr><tr><td>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>TC materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), פנול</td><td>אדום Thermo</td><td>25300054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר</td><td>סיגמא</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>תרמו</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 צלחות באר</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td>< חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>מאגר ליזה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris מאגר</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>1% NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>סיגמא</td><td>D6750-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>&בטא;-גליצרופוספט</td><td>סיגמא</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירופוספט</td><td>סיגמא</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד</td><td>סיגמא</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אורתוואנדאט</td><td>סיגמא</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז מלא</td><td>סיגמא</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><<tr><td>strong>שם</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>אבקת חלב</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Catalog Number</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Western Blotting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 ניטרוצלולוז 0.45 &micor; M&nbsp; גודל נקבוביות (20 ס"מ x 20 ס"מ גיליונות) (25 גיליונות)</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>ציוד מעבדה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיניפולד I מערכת</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc imager</td><td>BioRad</td><td>1708280&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey Imager</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</strong</td><td>>Comments</strong</td></tr><tr><td>>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Nanog</td><td>Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dnmt3b</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW חמור נגד ארנב</td><td></td><td>Licor 926-32213</td><td></td></tr><tr><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>נגד עכבר-HRP</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf2</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>R& D Systems</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4</td><td>סנטה קרוז</td><td>SC-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

תאי גזע עובריים (ESCs) יכולים לחדש את עצמם או לבדל אותם לכל סוגי התאים, תופעה הידועה בשם pluripotency. מדינות מובחנות מובחנות תוארו, מכנות &quot;יכולת נאיביות&quot; ו&quot;מתוחכמת &quot;. המנגנונים השולטים במעבר מתוחכם נאיבי אינם מובנים כלל. בפרט, אנו נשארים גרועים על קינאזות חלבון המציינות מדינות pluripotent נאיבי ו מתוחכם, למרות זמינות מוגברת של תרכובות כלי באיכות גבוהה כדי לחקור פונקציה קינאז. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מדרגית לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים kinase של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם ESCs העכבר. גישה זו מנצלת תנאים פשוטים תרבות התא ריאגנטים סטנדרטיים, חומרים וציוד לחשוף ולאמת מעכבי קינאז עם השפעות שטרם הוערכו עד כה על pluripotency. אנו דנים ביישומים פוטנציאליים לטכנולוגיה זו, כולל הקרנה של מולקולה קטנה אחרתאוספים כגון מעכבי קינאז מתוחכמים יותר ויותר וספריות מתפתחות של תרכובות כלי אפיגנטיות.

באמצעות הנוהל המוצג כאן ( איור 1 ), אנו המסך הספרייה LINCS של 228 מעכבי קינאז עוצמה סלקטיבית לזהות את אלה אשר לווסת את mESC pluripotency. הספרייה מוכנה בריכוז של 0.1 מ&quot;מ עבור דילול 1: 100 וריכוז ההקרנה הסופית של 1 מיקרומטר ב mESCs. 48 שעות מאוחר יותר, mESCs היו lysed ותמציות מוכן ניתוח כמותי כתם נקודה של הביטוי Nanog ו Dnmt3b ( איור 2 , למעלה). תוצאות מריכוזי הקרנה אחרים אינם מיוצגים כאן לקיצור. ננוג: יחס Dnmt3b נקבעת עבור כל מעכב קינאז ותרכובות מדורגות חתך 2x להחיל ( איור 2 , התחתון). סך הכל Nanog ו- Dnmt3b האות ביחס לשליטה הוא עלים על דירוג מעכבים ונתונה חתך 0.5x, כדי לאפשר triaging של מעכבים אשר מראים משמעותי mESC רעילות. בחר מעכבי קינאז אשר לייצב את sta נאיביTe מאומתים באמצעות immunoblotting רגיל Nanog / Dnmt3b ( איור 3 ). היעדים העיקריים של קינאז של מעכבים אלה מוצגים בטבלה 1 . כמו כן, אנו מדגימים את הישימות של המסך הזה כדי לזהות מעכבים אשר מייצבים את המדינה מכווצת 14 . <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> איור 1: זרימת עבודה להקרנת מעכבי קינאז המווסתים מעבר נאיבי. MESC טופלו עם ספריית מעכב Kinase 228 תרכובת בריכוז סופי של 1 מיקרומטר. Lysates הוכנו הועברו על קרומי ניטרוצלולוז עבור ניתוח כתם נקודות החיסונית, ואת רמות Nanog ו Dnmt3b נקבע (איור מותאם וויליאמס ואח &#39;14 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג את אל</a><html> גרסת האפר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> איור מס &#39;2: נייף- primed pluripotency מסך ניתוח זיהוי מעכבי. (למעלה) נציג Nanog ו Dnmt3b אימונו כתם נקודות כתם. (תחתית) ערכי Nanog ו- Dnmt3b עבור כל מעכב קינאז נקבעו ביחס לבקרת DMSO, וננוג: יחסי Dnmt3b וסיגנל Nanog + Dnmt3b היחסי שנקבע והמעכבים מדורגים בהשוואה לשליטה ב- DMSO. מעכבים מצאו לשנות Nanog: יחס Dnmt3b מעבר סף פי 2 מעל או מתחת לשליטה DMSO זוהו כנהגים של pluripotency נאיבי או מתוחכם. סף של 2x מתחת DMSO שליטה נקבע מעכבי triage אשר להתפשר mES הישרדות. מעכבים שנבחרו לאימות נוסף מודגשים. (איור מותאם וויליאמס ואח &#39;14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> איור 3: אימות תרכובות התאמה שנבחרו מזוהות. MESCs טופלו גם עם 1 מיקרומטר AZD4547 (מעכב FGFR סלקטיבית) או מעכבי המצוין מזוהה מהמסך באיור 2. Nanog: רמות Dnmt3b שנקבעו על ידי תקן SDS-PAGE וניתוח immunoblot. ערכים נומריים של ננוג יחסית: Dnmt3b ו Nanog + Dnmt3b מצוינים בטבלה שלהלן, ומעכבים המייצבים את המצב המצויר המוטבע בירוק. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מתחם </td><td colspan="2"> יעדים עיקריים </td><td> מטרות אחרות </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, ערכת, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> Src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> סיק </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR ו TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> טבלה 1: תרכובות פגיעה נבחרות ויעדי קינאז ראשוניים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כמותי וניתן להרחבה לבצע מסכי מולקולה קטנים ממוקד עבור הרגולטורים קינאז של המעבר pluripotent נאיבי מתוחכם.

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

המטרה הכוללת של מסך זה היא לזהות מעכבי חלבון קינאז של מולקולות קטנות המווסתים את פלוריפוטנטיות תאי הגזע העובריים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האיתות של תאי גזע עובריים על ידי זיהוי מסלולי איתות חדשים של חלבון קינאז המווסתים את הפלוריפוטנטיות של תאי גזע עובריים. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהמסך קל יחסית לביצוע באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי וריאגנטים זמינים.הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשהבנו שרוב המחקר במסלולי איתות פלוריפוטנטי התעלם לחלוטין מגלים עצומים של הקינום. הכינו מנות מצופות ג'לטין של 10 סנטימטר על ידי הוספת חמישה מיליליטר של 0.1% ג'לטין לצלחות של 10 סנטימטרים. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, שואבים את הג'לטין ונותנים לצלחת להתייבש במשך שתי דקות.לאחר מכן, צלח כל קו תאי ES סטנדרטי של עכבר על הכלים המצופים במדיה תאית ES סטנדרטית של עכבר המכילה 100 ננוגרם למיליליטר של LIF מתויג GST, סרום עגל עוברי 10% ו-5% תחליף סרום נוק-אאוט. תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס 5% CO2 והחלפת המדיה מדי יום. העבירו את תאי ה-ES של העכבר בסביבות 80% מפגש כל יומיים על ידי שאיבת המדיה ושטיפה עם חמישה מיליליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט לכל צלחת.לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של טריפסין EDTA לכל צלחת של תאי ES של עכבר ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, השעו מחדש את התאים הטריפסינים בארבעה מיליליטר מדיה וצנטריפוגה את התאים ב-1200 סל"ד למשך חמש דקות. השעו מחדש ביסודיות את גלולת התא המתקבלת בחמישה מיליליטר של מדיה, פיפטינג למעלה ולמטה כדי ליצור תרחיף תא בודד.ספרו את התאים על ידי שילוב של תרחיף תאים של 10 מיקרוליטר ו-10 מיקרוליטר של טריפאן כחול. מניחים את התערובת בתא ספירת תאים או משתמשים בהמוציטומטר ובמיקרוסקופ אור. לאחר מכן, זרעו 3000 תאי ES של עכברים לתוך צלחות 96 בארות מצופות ג'לטין 0.1% בנפח סופי של 100 מיקרוליטר מדיה באמצעות פיפטה רב-ערוצית.לאחר מכן, יש למרוח מעכבי קינאז בדילול של 1 עד 100 באמצעות פיפטה רב-ערוצית. פיפטה בעדינות את המדיה כדי לערבב את המעכב ואת תרחיף התאים. לאחר מכן, אפשר לתאים להתיישב במכסה המנוע של תרבית רקמה למשך שעה אחת כדי להבטיח פיזור שווה על פני משטח הציפוי.תרבית התאים למשך 48 שעות מבלי לשנות את המדיה. כדי להתחיל בניתוח הסינון, שטפו 96 צלחות תאי ES של עכבר באר ב-200 מיקרוליטר PBS באמצעות שואב רב ערוצי ופיפטות. לאחר הכביסה מערבבים תמציות תאים ב -150 מיקרוליטר של מאגר ליזה.הבהירו את התמציות על ידי צנטריפוגה ב -1500 פעמים G למשך 30 דקות בצלחות באר 96 עם תחתית V. לאחר מכן, קבעו 100 מיקרוליטר של סופרנטנטים על קרום ניטרוצלולוזה באמצעות סעפת עלילת נקודות ואקום של 96 בארות. יבש את הממברנה והכתם עם 40 מיליליטר Ponceau S כדי להבטיח העברה עקבית.לאחר שטיפת הממברנה ב- TBST, חסום אותה ב- TBST בתוספת 3% חלב. לאחר מכן, דגרו את הממברנה בנוגדנים Nanog ו-Dnmt3b בדילול של 1 עד 1000 במאגר החוסם למשך הלילה. למחרת יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים למשך 10 דקות ב- TBST.לאחר מכן, דגרו אותו ב-30 מיליליטר של נוגדנים משניים בדילול של 1 עד 10,000 במאגר חוסם. לפתח את הממברנה באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית של אימונובלוטינג. זה קריטי לאמת מעכבי קינאז שזוהו במסך באמצעות אימונובלוטינג קונבנציונלי לפני שתמשיך.זה עוזר להסיר תוצאות חיוביות שגויות לפני ניתוח נוסף במורד הזרם. נתח את נתוני המסך ואמת מעכבים כמווסתי פלוריפוטנטיות אמיתיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוצגת כאן תרשים נקודות Nanog מייצג מהמסך שבוצע.מודגשים מעכבי בקרה חיוביים המניעים פלוריפוטנטיות ראשונית או נאיבית. מוצגת גם עלילת נקודות מייצגת של Dnmt3b מהמסך שבוצע. מעכבי בקרה חיוביים המניעים פלוריפוטנטיות ראשונית או נאיבית מודגשים שוב.בתרשים זה, המעכבים דורגו ליחס Nanog ל-Dnmt3b. סף יחס Nanog ל-Dnmt3b כפול נקבע כדי לזהות מעכבים המייצבים פלוריפוטנטיות נאיבית או מוכנה. מסופקים גם אותות Nanog ו-Dnmt3b מסוכמים.בנוסף, מציינים מעכבי קינאז שנבחרו לאימות נוסף. מוצג כאן אימות אימונובלוט קונבנציונלי של מעכבי קינאז נבחרים, Nanog ו-Dnmt3b immunoblots, כמו גם יחס Nanog ל-Dnmt3b והאות הכולל מסופקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות מעכבי קינאז של מולקולות קטנות המווסתים את פלוריפוטנטיות תאי הגזע העובריים.לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מסלולי איתות הקינאז השולטים בפלוריפוטנטיות, ניתן ליישם אותה גם על התמיינות תאי גזע עובריים ומערכות רגולטוריות אחרות כגון שינויים אפיגנטיים. בעקבות ההליך, ניתן להשתמש בספריות אחרות של מעכבי מולקולות קטנות, כגון אלה המכוונות לשינויים אפיגנטיים, כדי לזהות שחקנים חדשים בוויסות פלוריפוטנטיות.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לקבוצת המחקר שלנו להבהיר מסלולי איתות פלוריפוטנטיים חדשים. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לזהות תפקיד חדש למסלול המוגבר בוויסות פלוריפוטנטיות.

a-simple-method-to-identify-kinases-that-regulate-embryonic-stem-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

אנו מתארים את השימוש assay ES תא העכבר מבוסס לזהות חלונות זמן קריטי עבור Wnt / β-catenin והפעלה BMP אות במהלך אינדוקציה קרדיוגני. השיטה מספקת פלטפורמה סטנדרטית אשר מכמת אמין יעילות קרדיוגני, וזה החלים על המחקר של שושלות תאים אחרים.

השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני

אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת culturing תא אוטומטי עם דימות גבוהה תוכן כדי לחזות ולכמת תהליכים תאיים רבים ומבנים, באופן תפוקה גבוהה. שיטות כאלה יכולות לסייע ביאור תפקודית נוספת של הגנום, כמו גם לזהות את הגן למחלה רשתות מטרות סמים פוטנציאליים.

הקרנת תוכן גבוהה במחלות ניווניות

אנו מתארים assay כתב הקרינה במהירות לזהות ולאפיין את הגנים המווסתים גזע עובריים של עכברים תא תחזוקה עצמית והתחדשות.

Oct4GiP Assay כתב ללמוד גנים המווסתים גזע עובריים עכבר נייד תחזוקה עצמית והתחדשות

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי תרבית תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC), המבוססים על גידול חד-שכבתי (NCM) שאינו מסוג מושבה של תאים בודדים מנותקים. שיטה חדשה זו, המשתמשת במעכבי קינאז הקשורים ל-Rho או באיזופורם הלמינין 521 (LN-521), מתאימה לייצור כמויות גדולות של hPSCs הומוגניים, מניפולציה גנטית וגילוי תרופות.

תרבויות אלטרנטיבי לפלוריפוטנטיים אנושיים לתאים גזע ייצור, תחזוקה וניתוח גנטי

הפרוטוקולים מתארים שתי מערכות במבחנת רעילות התפתחותית מבחן (UKK וUKN1) המבוססים על תאי גזע עובריים אנושיים ומחקרי transcriptome. מערכות הבדיקה לחזות סיכון לרעילות התפתחותית אדם, ועשויות לתרום לצמצום ניסויים בבעלי חיים, עלויות והזמן הנדרשים לבדיקת בטיחות כימית.

תאי גזע אנושיים pluripotent בהתבסס התפתחותית רעילות מבחני לביולוגיה הקרנה ומערכות בטיחות כימית נתונים דור

זרחון חלבונים הוא מאפיין מרכזי של האופן שבו תאים מפרשים ומגיבים למידע בסביבה החוץ-תאית שלהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינון בתפוקה גבוהה באמצעות קינאזות מטוהרות מתאי יונקים כדי לזהות במהירות קינאזות המזרחנות סובסטרט (ים) מעניין.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה

הפרוטוקול המובא במחקר זה מתאר שיטות לניטור בזמן אמת של התקדמות מחדש באמצעות מדידת הקינטית של סמנים בתאי גזע פלוריפוטנטיים חיוביים ושליליים באמצעות ניתוח תזרים cytometry. הפרוטוקול גם כולל את הערכה המבוססת על הדמיה של מורפולוגיה, סמן או ביטוי הכתב במהלך הדור iPSC.

מדידת קינטי Real Time ויזואליזציה של תכנות מחדש סומטיים

פרוטוקול המובאת כאן מתאר פלטפורמה לזיהוי מולקולות קטנות לטיפול של מחלת כבד. תיאור שלב אחר שלב מוצגת המפרט איך להבדיל iPSCs לתוך תאים בעלי מאפיינים hepatocyte ב 96-ובכן צלחות, כדי להשתמש בתאים על המסך עבור מולקולות קטנות עם פוטנציאל פעילות טיפולית.

שימוש האדם המושרה תאים דמויי Hepatocyte נגזר תאי גזע Pluripotent לגילוי סמים

נייר זה משתמש assay המבוססות על זרימת-cytometry לספריות מסך של מעכבי כימיים לצורך זיהוי מעכבי ו המטרות שלהם להשפיע על איתות לקולטן T-cell. ניתן להרחיב את השיטות המתוארות כאן גם עבור הקרנות תפוקה גבוהה.

זיהוי של מתווכים של קולטן תא T איתות באמצעות הקרנת הסרט מעכב כימי ספריות

המטרה של פרוטוקול זה היא תווית להעשיר, לזהות סובסטרטים של קינאז CK2 מתוך מדגם ביולוגיים מורכבים כגון תא lysate או homogenate הרקמה. שיטה זו ממנפת את ההיבטים הייחודיים של הביולוגיה CK2 למטרה זו.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

פרוטוקול מפורט ליצירת מיקרומערכים של חלבון אנושי מורכב באמצעות הקרנת מעכבי הסרט מוצג.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

למד שיטת סינון לזיהוי מעכבי קינאזות המווסתות פלוריפוטנטיות של תאי גזע עובריים בעכברים. הפרוטוקול משתמש בציוד סטנדרטי ומספק תוצאות תוך 72 שעות.

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

גלה סרטונים נוספים