שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

המטרה הכוללת של מסך זה היא לזהות מעכבי חלבון קינאז של מולקולות קטנות המווסתים את פלוריפוטנטיות תאי הגזע העובריים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האיתות של תאי גזע עובריים על ידי זיהוי מסלולי איתות חדשים של חלבון קינאז המווסתים את הפלוריפוטנטיות של תאי גזע עובריים. אז היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהמסך קל יחסית לביצוע באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי וריאגנטים זמינים.

הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כשהבנו שרוב המחקר במסלולי איתות פלוריפוטנטי התעלם לחלוטין מגלים עצומים של הקינום. הכינו מנות מצופות ג'לטין של 10 סנטימטר על ידי הוספת חמישה מיליליטר של 0.1% ג'לטין לצלחות של 10 סנטימטרים. לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, שואבים את הג'לטין ונותנים לצלחת להתייבש במשך שתי דקות.

לאחר מכן, צלח כל קו תאי ES סטנדרטי של עכבר על הכלים המצופים במדיה תאית ES סטנדרטית של עכבר המכילה 100 ננוגרם למיליליטר של LIF מתויג GST, סרום עגל עוברי 10% ו-5% תחליף סרום נוק-אאוט. תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס 5% CO2 והחלפת המדיה מדי יום. העבירו את תאי ה-ES של העכבר בסביבות 80% מפגש כל יומיים על ידי שאיבת המדיה ושטיפה עם חמישה מיליליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט לכל צלחת.

לאחר מכן, הוסיפו מיליליטר אחד של טריפסין EDTA לכל צלחת של תאי ES של עכבר ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הדגירה, השעו מחדש את התאים הטריפסינים בארבעה מיליליטר מדיה וצנטריפוגה את התאים ב-1200 סל"ד למשך חמש דקות. השעו מחדש ביסודיות את גלולת התא המתקבלת בחמישה מיליליטר של מדיה, פיפטינג למעלה ולמטה כדי ליצור תרחיף תא בודד.

ספרו את התאים על ידי שילוב של תרחיף תאים של 10 מיקרוליטר ו-10 מיקרוליטר של טריפאן כחול. מניחים את התערובת בתא ספירת תאים או משתמשים בהמוציטומטר ובמיקרוסקופ אור. לאחר מכן, זרעו 3000 תאי ES של עכברים לתוך צלחות 96 בארות מצופות ג'לטין 0.1% בנפח סופי של 100 מיקרוליטר מדיה באמצעות פיפטה רב-ערוצית.

לאחר מכן, יש למרוח מעכבי קינאז בדילול של 1 עד 100 באמצעות פיפטה רב-ערוצית. פיפטה בעדינות את המדיה כדי לערבב את המעכב ואת תרחיף התאים. לאחר מכן, אפשר לתאים להתיישב במכסה המנוע של תרבית רקמה למשך שעה אחת כדי להבטיח פיזור שווה על פני משטח הציפוי.

תרבית התאים למשך 48 שעות מבלי לשנות את המדיה. כדי להתחיל בניתוח הסינון, שטפו 96 צלחות תאי ES של עכבר באר ב-200 מיקרוליטר PBS באמצעות שואב רב ערוצי ופיפטות. לאחר הכביסה מערבבים תמציות תאים ב -150 מיקרוליטר של מאגר ליזה.

הבהירו את התמציות על ידי צנטריפוגה ב -1500 פעמים G למשך 30 דקות בצלחות באר 96 עם תחתית V. לאחר מכן, קבעו 100 מיקרוליטר של סופרנטנטים על קרום ניטרוצלולוזה באמצעות סעפת עלילת נקודות ואקום של 96 בארות. יבש את הממברנה והכתם עם 40 מיליליטר Ponceau S כדי להבטיח העברה עקבית.

לאחר שטיפת הממברנה ב- TBST, חסום אותה ב- TBST בתוספת 3% חלב. לאחר מכן, דגרו את הממברנה בנוגדנים Nanog ו-Dnmt3b בדילול של 1 עד 1000 במאגר החוסם למשך הלילה. למחרת יש לשטוף את הממברנה שלוש פעמים למשך 10 דקות ב- TBST.

לאחר מכן, דגרו אותו ב-30 מיליליטר של נוגדנים משניים בדילול של 1 עד 10,000 במאגר חוסם. לפתח את הממברנה באמצעות מערכת הדמיה דיגיטלית של אימונובלוטינג. זה קריטי לאמת מעכבי קינאז שזוהו במסך באמצעות אימונובלוטינג קונבנציונלי לפני שתמשיך.

זה עוזר להסיר תוצאות חיוביות שגויות לפני ניתוח נוסף במורד הזרם. נתח את נתוני המסך ואמת מעכבים כמווסתי פלוריפוטנטיות אמיתיים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מוצגת כאן תרשים נקודות Nanog מייצג מהמסך שבוצע.

מודגשים מעכבי בקרה חיוביים המניעים פלוריפוטנטיות ראשונית או נאיבית. מוצגת גם עלילת נקודות מייצגת של Dnmt3b מהמסך שבוצע. מעכבי בקרה חיוביים המניעים פלוריפוטנטיות ראשונית או נאיבית מודגשים שוב.

בתרשים זה, המעכבים דורגו ליחס Nanog ל-Dnmt3b. סף יחס Nanog ל-Dnmt3b כפול נקבע כדי לזהות מעכבים המייצבים פלוריפוטנטיות נאיבית או מוכנה. מסופקים גם אותות Nanog ו-Dnmt3b מסוכמים.

בנוסף, מציינים מעכבי קינאז שנבחרו לאימות נוסף. מוצג כאן אימות אימונובלוט קונבנציונלי של מעכבי קינאז נבחרים, Nanog ו-Dnmt3b immunoblots, כמו גם יחס Nanog ל-Dnmt3b והאות הכולל מסופקים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לזהות מעכבי קינאז של מולקולות קטנות המווסתים את פלוריפוטנטיות תאי הגזע העובריים.

לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך 72 שעות אם היא מבוצעת כראוי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מסלולי איתות הקינאז השולטים בפלוריפוטנטיות, ניתן ליישם אותה גם על התמיינות תאי גזע עובריים ומערכות רגולטוריות אחרות כגון שינויים אפיגנטיים. בעקבות ההליך, ניתן להשתמש בספריות אחרות של מעכבי מולקולות קטנות, כגון אלה המכוונות לשינויים אפיגנטיים, כדי לזהות שחקנים חדשים בוויסות פלוריפוטנטיות.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לקבוצת המחקר שלנו להבהיר מסלולי איתות פלוריפוטנטיים חדשים. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי לזהות תפקיד חדש למסלול המוגבר בוויסות פלוריפוטנטיות.