הערכה של חלופה ספונטנית, זיהוי אובייקטים רומנטי ו Clbing איברים מודלים עכבר מהונדס של Amyloid-β ו נוירופתולוגיה טאו
28 במאי 2017
תיאר כאן היא מבוימת, התנהגות ההקרנה התנהגותית שניתן להשתמש בהם כדי המסך עבור תרכובות כי התערוכה יעילות vivo על התנהגויות מוטוריות קוגניטיבית ופונקציונלית מודלים עכבר מהונדס של עמילואידוזיס β ו tauopathy. שיטות אלה מותאמות לתצוגת תרכובות עבור פעילות במשימות זיכרון לטווח קצר ולזיכרון עבודה.
המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד התנהגויות חריגות הנפוצות במודלים של עכברים של מחלת אלצהיימר בצורה סטנדרטית על מנת לסנן תרכובות שעשויות להיות בעלות השפעות מועילות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום גילוי תרופות פרה-קליניות למחלת אלצהיימר, כגון האם תרכובת יעילה או כיצד תרכובת עשויה לעבוד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא עוקבת אחר מספר התנהגויות שונות באמצעות גישה מדורגת שהיא רגישה וספציפית כאחד.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי טיפולים יעילים למחלת אלצהיימר, ניתן ליישם אותה גם על מודלים עכבריים אחרים של דמנציה או תפקוד קוגניטיבי לקוי כגון דמנציה פרונטו-טמפורלית, פגיעה מוחית טראומטית או אוטיזם. לפני השימוש במבוך ה-Y, נקו אותו היטב עם מגבון קוטל חיידקים אקונומיקה ללא ריח. לאחר מכן נגב אותו עם אתנול 70% ושטוף אותו במים.
הכן את מערכת רכישת הנתונים או מצלמות הווידאו כדי לעקוב כראוי אחר העכברים בזמן שהם מריצים את המבוך. במהלך תהליך זה, הקליטו תמונה של מקל מדידה במבוך כדי לכייל את המרחקים שבהם הם נמצאים. כעת, העבירו בעדינות רבה את כלוב העכבר לשולחן בסמיכות למבוך.
הסר את העכבר מהכלוב והנח אותו בעדינות בזרוע אחת של מבוך ה-Y הפונה למרכז. לאחר מכן התרחק מספיק מהמבוך כדי שהעכבר לא יוכל לראות אותך והתחל מיד את הקלטת הווידאו. הקלט את העכבר למשך 10 דקות.
לאחר 10 דקות, הסר בעדינות את העכבר והחזיר אותו לכלוב הביתי שלו. לפני שתמשיך עם העכבר הבא, שטוף היטב את מבוך ה- Y שוב באמצעות הליך הכביסה בן שלושת השלבים. לפני בדיקה זו, שטפו את זירת השדה הפתוח בדיוק כפי שנעשה עם מבוך Y.
יום לפני חשיפת החפצים, הרגילו את העכברים לזירה. ודא שמערכת המעקב פועלת. וכיול מרחקים באמצעות מקל מדידה כמו קודם.
גם בתוכנת התיוג, סמנו את פינות הזירה. כעת, הניחו בעדינות את כלוב העכבר על שולחן קרוב לזירה. הסר את העכבר והנח אותו בעדינות במרכז הזירה.
לאחר מכן התחל במהירות את ההקלטה ואפשר לעכבר לחקור את הזירה למשך חצי שעה. הקפידו להיות מחוץ לטווח הראייה של בעל החיים ואל תפריעו לו במהלך הבדיקה. לאחר מפגש ההרגלה, החזירו את העכברים לכלוב הביתי שלהם.
ולנקות את הזירה ביסודיות כמו קודם לפני הרגיל את העכבר הבא. שעתיים-שלוש לאחר מכן, בצע את שלב הדגימה של בדיקת הזיכרון. שנה את הזירה על ידי הצבת שני אובייקטים זהים בתוכה שניהם מיושרים באופן שווה לקיר אחד.
תקן את החפצים במקומם בעזרת מרק הרכבה. בתוכנה, רשום את מיקומם של שני האובייקטים כמו גם את פינות הזירה. שטפו את החפצים והזירה כרגיל לפני הצגת עכבר.
ערכו את הבדיקה כמו מפגש ההרגלה, והניחו את העכבר בזירה מול האובייקטים. כעת, תנו לעכבר לחקור את הזירה רק למשך 15 דקות. שעתיים-שלוש לאחר מכן, ערכו את השלב האחרון של מבחן הזיכרון.
עבור מפגש זה, שמור אובייקט מוכר אחד באותו מיקום והסר את האובייקט המוכר השני, והחלף אותו באובייקט חדש שהוצג לאחרונה. השאירו מספיק מרחק בין הקירות לחפצים כדי שהעכברים יוכלו לחקור בחופשיות את העצמים מכל הזוויות. וכמו קודם, אבטח את החפצים בעזרת מרק.
בכל קבוצות המבחן במחקר, הקפידו על איזון מיקומים עבור אובייקטים חדשים ומוכרים. נהל את המפגש האחרון כמו בשני המפגשים האחרים, אך הקלט את התנהגות העכבר רק למשך 10 דקות. אחיזת גפיים היא בדיקה מוטורית תפקודית המכמתת ליקויים בתפקוד הקורטיקו-שדרה.
עבור בדיקה זו, השתמש במכשיר כף יד כדי להקליט וידאו את כל הפגישה. התחילו בהנחת כלוב הבית על שולחן נקי ותיעוד תעודת הזהות של בעל החיים.לאחר מכן הוציאו בעדינות את העכבר מהכלוב שלו והחזיקו אותו תלוי בזנב למשך חמש עד 10 שניות תוך מיקוד הסרטון בתנועות כף הרגל האחורית והכף הקדמית של החיה. הטיפול בעכבר כדי שלא ינסה לברוח דורש תרגול.
לאחר צילום לפחות חמש שניות של וידאו, החזר את העכבר לכלוב הביתי שלו. והחזירו את הכלוב למתלה. לאחר מכן נקה את השולחן לפני שתחזור על ההליך בעכבר הבא.
מאוחר יותר, ציין את ההתנהגות בסרטונים בסולם מאפס עד ארבע. באמצעות בדיקת מבוך Y, קו עכברים טרנסגניים מזדקנים המציג פתולוגיה דמוית מחלת אלצהיימר חשף פגם חילופין ספונטני צפוי. לעומת זאת, קו עכברי מודל אחר של אלצהיימר הראה חילופין ספונטני מוגבר שנבע מהיפראקטיביות קיצונית וסטריאוטיפים בקו.
התנהגויות אלו מפריעות באופן משמעותי למדידת ההחלפה הספונטנית. במבחן האובייקט החדש, במהלך ההתרגלות ניתן להעריך היפראקטיביות והתנהגויות סטריאוטיפיות אחרות. במהלך שלב הדגימה, חקר כל אובייקט נמדד בנפרד כדי לזהות בעלי חיים ללא הטיית אובייקט.
מעגלים פתוחים מראים בעלי חיים שהראו הטיה ולא נכללו בשלב הבדיקה. שלב הבדיקה נותח בשלוש דרכים שונות. כאשר זמן החקירה הכולל היה דומה בין קבוצות, נותח זמן החקירה הגולמי של כל אובייקט.
כאשר הקבוצות המושוות חקרו פרקי זמן שונים, נעשה שימוש בהעדפת חידוש או במדד אפליה כדי לתת ציון למבחן. אחיזת גפיים שאינה מדד קוגניטיבי נצפתה במספר מודלים של עכברי זנב טרנסגניים. התנהגות זו מסכמת חלק מהליקויים המוטוריים התפקודיים שנצפו במחלת אלצהיימר בשלב מאוחר.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בעכברים בעדינות ולמזער כל הפרעה בסביבת הבדיקה כגון רעשים חזקים או ריחות חדשים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבוך מים מרחבי או התניה הקשרית של פחד על מנת לענות על שאלות נוספות כמו האם תרכובת משפיעה באופן ספציפי על תפקוד ההיפוקמפוס. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לסנן את היעילות של תרכובות במודלים של עכברים של מחלת אלצהיימר באמצעות מבחן מבוך Y, מבחן זיהוי אובייקטים חדשני ומבחן אחיזת גפיים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג גישת סריקה התנהגותית להערכת תרכובות לבדיקת יעילותן לתפקוד קוגניטיבי ומוטורי במודלים של עכברים טרנסגניים למחלת אלצהיימר. השיטות מתמקדות בהערכת משימות של זיכרון לטווח קצר וזיכרון עבודה, ומספקות דרך סטנדרטית למדידת התנהגויות חריגות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- הערכה התנהגותית
- מחקר על מחלת אלצהיימר
רקע
- מחלת אלצהיימר מאופיינת בליקויים קוגניטיביים ומוטוריים.
- מודלים של עכברים טרנסגניים משמשים לחקר ליקויים אלו.
- בדיקות התנהגותיות סטנדרטיות יכולות לסייע בזיהוי תרכובות טיפוליות פוטנציאליות.
- מבוך ה-Y ומבחני אובייקט חדש הם שיטות מפתח במחקר זה.
מטרת המחקר
- למדידת התנהגויות קוגניטיביות ומוטוריות במודלים של עכברים למחלת אלצהיימר.
- לסריקת תרכובות שעשויות לשפר התנהגויות אלו.
- לספק תובנות לגבי גילוי תרופות בשלב הפרה-קלניי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מבחן מבוך Y להערכת הזיכרון והתפקוד הקוגניטיבי.
- מבחן אובייקט חדש להערכת התנהגות חקירה וזיכרון.
- מבחן כיווץ גפיים (Limb clasping) לכימות פגמים בתפקוד המוטורי.
- ניקוי והכנה סטנדרטיים של סביבות הבדיקה.
תוצאים עיקריים
- בדיקות התנהגותיות חשפו הבדלים בביצועים קוגניטיביים בין קווי עכברים טרנסגניים.
- נצפו היפראקטיביות והתנהגויות סטריאוטיפיות, אשר השפיעו על תוצאות הבדיקה.
- תרכובות נסרקו כדי לבחון את יעילותן בשיפור תפקודים קוגניטיביים ומוטוריים.
- התוצאות תומכות בשימוש בשיטות אלו להערכת טיפולים פוטנציאליים למחלת האלצהיימר.
מסקנות
- גישת הסריקה ההתנהגותית המדורגת יעילה להערכת יעילות של תרופות.
- התובנות שהתקבלו יכולות להנחות מחקרים עתידיים בטיפולים למחלת אלצהיימר.
- מחקרים נוספים עשויים לבחון בדיקות התנהגותיות נוספות לצורך הערכה מקיפה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מובילה
פרדיגמה זו של סריקה התנהגותית מאפשרת הערכה פרה-קלינית של יעילות תרכובות על נקודות סוף קוגניטיביות ומוטוריות במודלים של מחלת אלצהיימר, ובכך היא תומכת בתיקוף מטרה (target validation) ובהפחתת סיכונים מנגנוניים. באמצעות שילוב של מבחני החלפה ספונטנית, זיהוי אובייקט חדש וקיפול גפיים (limb clasping), גישה זו מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור עבור זיכרון לטווח קצר, זיכרון עבודה ותפקוד קורטיקו-ספינלי. זרימת עבודה מדורגת זו מסייעת בתעדוף של תרכובות בעלות פעילות ביולוגית רלוונטית למחלה לפני המעבר למחקרים הדורשים משאבים רבים יותר.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את תפקודי המעגלים ההיפוקמפליים והקורטיקליים הרלוונטיים לפתופיזיולוגיה של מחלת אלצהיימר, ומאפשר בדיקת היפותזות ממוקדות.
- ערך תפעולי: מספק נקודות סיום מוגדרות בבירור עם בדיקות בקרת איכות מובנות, דבר המפחית את השונות בסקרים ראשוניים.
- ערך חזוי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי קישור השפעות של תרכובות לדומיינים תפקודיים הפגועים במחלה בבני אדם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מדד את היכולת להבחין בין אובייקטים חדשים ואת ההחלפה הספונטנית כמדדים עקיפים לנפח זיכרון לטווח קצר וזיכרון עבודה.
- ערך תפעולי: תוכנן לתפוקה בינונית עם התערבות מינימלית של החוקר, מה שמקל על סריקת ספריות של תרכובות.
- מוכנות הבדיקה: כולל נהלי ניקוי סטנדרטיים, הרגלה ומיקום אובייקטים כדי להבטיח הדירות בין הרצות שונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: לחיצת גפיים מכמתת פגמים קורטיקו-ספינליים המדמים פגיעה מוטורית בשלבים מאוחרים של מחלת אלצהיימר, ובכך מאפשרת התאמה של ביומרקרים תפקודיים.
- מערכת רלוונטית למחלה: ישימה עבור מודלים טרנסגניים של עמילואידוזיס וטאוופתיה, ובכך תומכת בתיקוף של מעורבות המטרה (target engagement).
- קידום מותאם סיכונים: מזהה תרכובות המשפרות פגמים קוגניטיביים ומוטוריים, ובכך מספקת בסיס להחלטות go/no-go לצורך אופטימיזציה של תרופה מובילה (lead optimization).
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי המולקולה המובילה (lead identification), ומספקת פנוטיפ התנהגותי המגשר בין ממצאים in vitro לבין יעילות פרה-קלינית.
- ביולוגיית גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות של ויסות מעגלים קוגניטיביים ומוטוריים על ידי תרכובות במערכות הרלוונטיות למחלה.
- סריקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (אחוז החלפה, מדד הבחנה, ציון clasping) לצורך השוואה בין תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים סטטיסטיים (העדפת חידוש, מדד הבחנה) להערכת השפעות הטיפול בין קבוצות.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין פנוטיפים של זיכרון ומוטוריקה לסמפטומטולוגיה של אלצהיימר, ובכך תומך בתוקף פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה התנהגותית סטנדרטית הניתנת ליישום במודלים מרובים של דמנציה וליקויים קוגניטיביים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי במודולציה של המטרה באמצעות מדדי קריאה קוגניטיביים ומוטוריים תפקודיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה (scalability) בין אתרי בדיקה ומנות של תרכובות.
- ערך אסטרטגי: מיון מושכל של הפורטפוליו באמצעות נתוני סריקה מכניסטיים ופנוטיפיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף מותאם סיכון המבוסס על הצלה (rescue) של התנהגויות רלוונטיות למחלה.
שיקולי יישום
- מומחיות בטיפול במכרסמים, נוירו-ביולוגיה התנהגותית ומערכות מעקב מבוססות וידאו.
- ציוד לבדיקות במבוך Y ובזירה פתוחה (open field), הקלטת וידאו וכיול תוכנת מעקב.
- סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי ניקוי, הרגלה ומיקום חפצים.
- שיקולי התאמה עבור זני עכברים שונים, גילאים ומודלי מחלה המפגינים היפראקטיביות או התנהגויות סטריאוטיפיות.
- מגבלות מעשיות כוללות הפרעה פוטנציאלית כתוצאה מהיפראקטיביות, הדורשת קריטריוני החרגה ואיזון (counterbalancing) של מיקומי החפצים.
