במבחנה הדמיה וכימות של יעילות מיקוד והתרופות של אנלוגים של GnRH שכותרתו fluorescently

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לחקור ולנבא את היעילות של מערכות להובלת תרופות מבוססות GnRH בתרביות של תאי סרטן אנושיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הטיפול האנטי-סרטני הממוקד, כגון מידת היעילות שבה תאים מסוגי סרטן אנושיים שונים קולטים תרופות אנטי-סרטניות הממוקדות ל-GnRH. היתרון המרכזי של שיטה זו הוא השימוש באנלוגים חדשים של GnRH המסומנים פלואורסצנטית, המאפשרים שימוש סימולטני במיקרוסקופיה קונפוקלית ובניתוח באמצעות ציטומטריית זרימה.

להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על טיפול נגד סרטן, כיוון שקולטני GnRH מובעים ברמה גבוהה במספר סוגי תאי סרטן, מה שמאפשר מיקוד סלקטיבי שלהם. את הפרוצדורה תדגים ביאנקה גורבי, סטודנטית לדוקטורט מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הסיר את מצע הגידול מכל אחת משבע הבארות של למסלייד מיקרוסקופית שעליה נזרעו תאים.

לאחר מכן, הוסף 250 µL של המצע המלא שחומם מראש לבאר ביקורת השלילה, ו-250 µL של מצע הטיפול בזרעי GnRH fit שחומם מראש לכל אחת משש הבארות הנותרות. הדגר את השקף באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ובריכוז של 5% CO2 למשך חמש שעות. לאחר חמש שעות של הדגרה, שאב את המצע מכל באר ושטוף את התאים עם 250 µL של PBS.

לאחר מכן, הוסף 250 µL של תמיסת קיבוע לכל באר והדגר את השקופית בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר קיבוע התאים, שפך את תמיסת הקיבוע ושטוף את התאים עם 250 µL של PBS. הוסף 250 µL של תמיסת גשש פלואורסצנטי בריכוז 5 µM שהוכנה ב-PBS לכל באר, והדגר את השקופית בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר הסרת תמיסת הגשש הפלואורסצנטי, שטפו בזהירות את התאים פעמיים עם 250 microliters של PBS. לבסוף, הוסיפו שלוש עד ארבע טיפות של תמיסת קיבוע (mounting medium) לכל באר. שמרו את הזכוכית בחושך בטמפרטורת החדר עד לצילום תחת מיקרוסקופ.

הסיר את מצע התרבית מכל אחת מחמש הבארות של למסחה מיקרוסקופית זרועה. לאחר מכן, הוסף 250 microliters של המצע המלא שחומם מראש לבארת הביקורת השלילית ולבאר השנייה עם התאים שלא טופלו. טפל במקדימה את התאים בשלוש הבארות הנותרות באמצעות מצעי הטיפול שחוממו מראש ומכילים 10 micromolar GnRH FITC.

דגרו את השקופית באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך שעה אחת. לאחר מכן, הסירו את המצע מהתאים שעברו טיפול בלבד ושטפו את התאים עם 250 µL של מצע מלא שחומם מראש. לאחר מכן, הסירו את מצע השטיפה.

לאחר מכן, יש להוסיף 250 µL של המדיום המלא שחומם מראש לכל אחת משלוש הבארות. יש לדגור את הסלייד באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C, בריכוז של 5% CO2 למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, יש להסיר את המדיום מכל חמש הבארות ולשטוף את התאים עם 250 µL של PBS.

לאחר מכן, הסר את ה-PBS וקבע את התאים עם 250 microliters של תמיסת קיבוע בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, השלף את תמיסת הקיבוע ושטוף את התאים עם 250 microliters של PBS. הוסף 250 microliters של תמיסת חסימה לכל באר והדגר את הפלסטה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.

שאבו את תמיסת החסימה מכל באער למעט מהבקרה השלילית. לאחר שטיפת התאים ב-250 microliters של PBS, הוסיפו 250 microliters של תמיסת נוגדן ראשוני לכל באער. דגרו את הסלייד בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת במקום חשוך.

הסר את התמיסות מכל אחת מחמשת הבארות ושטוף את התאים עם 250 µL של PBS. לאחר מכן, הסר את ה-PBS והוסף 250 µL של תמיסת נוגדן משני. דגור את השקופית בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת בחושך.

שאבו את התמיסה מכל באער ושטפו את התאים ב-250 microliters של PBS. הסירו את ה-PBS המשמש לשטיפה ולאחר מכן הוסיפו 250 microliters של PBS המכיל probe פלואורסצנטי בריכוז של five micromolar לכל באער. הדגירו את הפלטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

הסיר את תמיסת הגשש הפלואורסצנטי מכל באער ושטוף בזהירות את התאים פעמיים עם 250 µL של PBS. לבסוף, הוסף שלוש עד ארבע טיפות של תמיסת קיבוע (mounting medium) לכל באער. שמור את השקופית בחושך בטמפרטורת החדר עד לצילומה תחת מיקרוסקופ.

בצעו הדמיה של התאים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר הפוך. הפעילו את הלייזרים ב-488 nanometer וב-633 nanometer. בדקו את הגברת הלייזר ואת גודל הפינוהול (pinhole).

בצעו דמיון של דגימת ביקורת השלילה. בצעו אופטימיזציה לאות הנצפה עבור הגרעין וכילו את אות ה-FITC וה-Alexa 546 כך שיהיה קרוב לאפס. לאחר מכן, השתמשו באותם פרמטרים כדי לבצע דמיון של הדגימות שעברו טיפול.

שפוך את המצע המלא מכל שבע הבארות של פלטת תרבית זרועה. לאחר מכן, הוסף 1 mL של מצע מלא שחומם מראש לבארת הביקורת השלילית ו-1 mL של מצע טיפולי שחומם מראש לשש הבארות הנותרות. הדגר את הפלטה באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C ו-5% CO2 למשך חמש שעות.

לאחר שפיכת המדיום מכל הבארים, שטפו בזהירות את התאים פעמיים עם שני מיליליטר של PBS. הסירו את ה-PBS ולאחר מכן הוסיפו 500 microliters של תמיסת Trypsin EDTA לכל באר. דגרו את הפלטה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עד להיתרקות התאים, תהליך שייקח כ-10 דקות.

השתמשו במיליליטר אחד של מצע מלא כדי לנטרל את ה-Trypsin בכל באר ונערו את הפלטה. לאחר מכן, השביו את התאים באמצעות פיפוט עדין. העבירו את התליות לשפופרות FACS נפרדות וסובבו את הדגימות ב centri-fuge ב-150 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך ארבע דקות.

שפכו בזהירות את העל-נוזלים (supernatants). לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של PBS קר מהקרח לכל מבחנת FACS וערבבו בעדינות להשעיה מחדש של התאים. שמרו את המבחנות על קרח עד לניתוח באמצעות FACS.

מוצג כאן ניתוח של ספיגת GnRH בתאי קרצינומה של הלוע. טיפול של חמש שעות בריכוז של one micromolar של קומפלקס פלואורסצנטי של GnRH הביא לספיגה קלה אך ניתנת להבחנה, שהתבטאה באות פלואורסצנטי ירוק הממוקם בתאי סרטן הלוע. הגדלה נוספת של מינון הקומפלקס הובילה לספיגה מוגברת, מה שמעיד על תלות במינון של ספיגת GnRH בתאי קרצינומה של הלוע.

ספיגה תלוית-רצפטור של GnRH וההתפלגות התאית של הליגנד ברצפטור שלו בתאי סרטן ריאה נותחו באמצעות טיפול סימולטני בקומפלקס GnRH פלואורסצנטי וצביעה של רצפטור GnRH מסוג 1 ושל הגרעינים. התוצאות מראות כי רצפטור GnRH מסוג 1 מקושר לממברנת התא, בעוד שחלבון ה-GnRH נספג לתוך התאים ונשאר בציטופלזמה שלהם. ספיגת GnRH בתאי קרצינומה של הלוע נחקרה גם היא באמצעות ניתוח FACS.

התוצאות מראות כי הספיגה של GnRH שנצפתה כאשר התאים טופלו ב-1 µM של תצמיד GnRH הוגברה משמעותית כאשר המינון שהוחל על התאים הועלה ל-10 µM. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בשמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוטוקול זה, חשוב לזכור להגן על הדגימות המטופלות ועל הצבעים הפלואורסצנטיים מאור ישיר.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקות חיוניות תאים או אפופטוזיס כדי לענות על שאלות נוספות, למשל, באיזו יעילות התרופה המכוונת ל-GnRH יכולה לעכב את הצמיחה של סוג מסוים של סרטן. פיתוח זה סלל את הדרך עבור חוקרים בתחום הטיפול בסרטן לבחון את היעילות של מערכות להולכת תרופות מבוססות GnRH בהיצמדות לתאי סרטן. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה כיצד להשתמש בקונוגטים של GnRH המסומנים פלואורסצנטית כדי לבחון את הרגישות של תאי סרטן לטיפולים המכוונים ל-GnRH.