במבחנה הדמיה וכימות של יעילות מיקוד והתרופות של אנלוגים של GnRH שכותרתו fluorescently

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחקור ולחזות את היעילות של מערכות אספקת תרופות מבוססות GnRH בתרביות תאי סרטן אנושיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הטיפול הממוקד נגד סרטן, כגון באיזו יעילות תאים מסוגי סרטן אנושיים שונים לוקחים תרופות אנטי-סרטניות ממוקדות GnRH. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא משתמשת באנלוגים חדשים של GnRH המסומנים בפלואורסצנט המאפשרים שימוש בו זמנית במיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח ציטומטריית זרימה.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול אנטי-סרטני מכיוון שקולטני GnRH באים לידי ביטוי גבוה במספר סוגי תאים סרטניים, מה שמאפשר מיקוד סלקטיבי שלהם. מי שתדגים את ההליך תהיה ביאנקה גורבי, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, הסר את המדיום המתורבת מכל אחת משבע הבארות של מגלשה מיקרוסקופית זרועה.

לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר מהמדיום השלם שחומם מראש לבאר הבקרה השלילית ו-250 מיקרוליטר של המדיה לטיפול בזרעים GnRH שחוממה מראש לכל אחת משש הבארות הנותרות. דגרו את המגלשה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזי פחמן דו חמצני למשך חמש שעות. לאחר חמש שעות דגירה, יש לשאוב את המדיום מכל באר ולשטוף את התאים עם 250 מיקרוליטר PBS.

לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע לכל באר ודגר את השקופית בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר תיקון התאים, השליכו את תמיסת הקיבוע ושטפו את התאים עם 250 מיקרוליטר PBS. הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת בדיקה פלואורסצנטית מיקרוטולרית שהוכנה ב-PBS לכל באר ודגר את השקופית בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.

לאחר הסרת תמיסת הבדיקה הפלואורסצנטית, יש לשטוף בזהירות את התאים פעמיים עם 250 מיקרוליטר PBS. לבסוף, הוסף שלוש עד ארבע טיפות של מדיום הרכבה לכל באר. שמור את השקופית בחושך בטמפרטורת החדר עד להדמיה במיקרוסקופ.

הסר את המדיום המתורבת מכל אחת מחמש הבארות של מגלשה מיקרוסקופית זרועה. לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר מהמדיום השלם שחומם מראש לבאר הבקרה השלילית ולבאר השנייה עם התאים הלא מטופלים. טפל בתאים בשלוש הבארות הנותרות עם אמצעי הטיפול שחומם מראש המכיל 10 מיקרומולרי GnRH FITC.

דגרו את המגלשה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזי פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר מכן הסר את המדיה רק מהתאים המטופלים ושטוף את התאים עם 250 מיקרוליטר מהמדיום השלם שחומם מראש. לאחר מכן, הסר את אמצעי הכביסה.

לאחר מכן, הוסף 250 מיקרוליטר מהמדיום השלם שחומם מראש לכל אחת משלוש הבארות. דגרו את המגלשה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוזי פחמן דו חמצני למשך שעה. לאחר הדגירה יש להשליך את המדיה מכל חמש הבארות ולשטוף את התאים עם 250 מיקרוליטר PBS.

לאחר מכן, הסר את ה- PBS ותקן את התאים עם 250 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. לאחר מכן, השליכו את תמיסת הקיבוע ושטפו את התאים עם 250 מיקרוליטר PBS. הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת חסימה לכל באר ודגר את השקופית בטמפרטורת החדר למשך שעה.

שאפו תמיסת חסימה מכל באר למעט הבקרה השלילית. לאחר שטיפת התאים עם 250 מיקרוליטר PBS, הוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר. דגרו את השקופית בטמפרטורת החדר למשך שעה במקום חשוך.

הסר תמיסות מכל אחת מחמש הבארות ושטוף את התאים עם 250 מיקרוליטר PBS. לאחר מכן, הסר את ה-PBS והוסף 250 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים משנית. דגרו את המגלשה בטמפרטורת החדר למשך שעה בחושך.

שאפו את התמיסה מכל באר ושטפו את התאים עם 250 מיקרוליטר PBS. הסר את הכביסה PBS ולאחר מכן הוסף 250 מיקרוליטר של PBS המכיל חמישה בדיקה פלואורסצנטית מיקרומולרית לכל באר. דגרו את השקופית למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את תמיסת הבדיקה הפלואורסצנטית מכל באר ושטוף בזהירות את התאים פעמיים עם 250 מיקרוליטר PBS. לבסוף, הוסף שלוש עד ארבע טיפות של מדיום הרכבה לכל באר. שמור את השקופית בחושך בטמפרטורת החדר עד להדמיה במיקרוסקופ.

דמיין את התאים תחת מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי הפוך. הפעל את הלייזרים של 488 ננומטר ו-633 ננומטר. בדוק את הלייזר ampאת ואת גודל חור הסיכה.

דמיין את דגימת הבקרה השלילית. בצע אופטימיזציה של האות שנצפה עבור הגרעין והתאם את האות של FITC ו- Alexa 546 כך שיהיה קרוב לאפס. לאחר מכן, באמצעות אותם פרמטרים, דמיין את הדגימות המטופלות.

השלך את המדיום השלם מכל שבע הבארות של צלחת תרבית זרעים. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום שלם שחומם מראש לבאר הבקרה השלילית ומיליליטר אחד של אמצעי הטיפול שחומם מראש לשש הבארות הנותרות. דגרו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, חמישה אחוז פחמן דו חמצני למשך חמש שעות.

לאחר השלכת המדיום מכל הבארות, יש לשטוף בזהירות את התאים פעמיים עם שני מיליליטר PBS. הסר את ה-PBS ולאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת Trypsin EDTA לכל באר. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס עד לניתוק התאים, מה שייקח כ -10 דקות.

בעזרת מיליליטר אחד של מדיום שלם, נטרלו את הטריפסין בכל באר ונערו את הצלחת. לאחר מכן השעו את התאים על ידי פיפטינג עדין. העבירו את המתלים לצינורות FACS נפרדים וצנטריפוגה את הדגימות ב-150 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות.

שפכו את הסופרנטנטים בזהירות. לאחר מכן, הוסיפו 500 מיקרוליטר של PBS קר כקרח לכל צינור FACS והשעו בעדינות את התאים. שמור את הצינורות על קרח עד לניתוח על ידי FACS.

מוצג כאן ניתוח של ספיגת GnRH בתאי קרצינומה של הלוע. טיפול של חמש שעות במיקרוטולר אחד של קומפלקס פלואורסצנטי של GnRH הביא לצריכה קלה, אך ניתנת להבחנה המתבטאת כאות פלואורסצנטי ירוק הממוקם בתאי סרטן הלוע. עלייה נוספת במינון המורכב הובילה לספיגה מוגברת, והדגימה תלות במינון של ספיגת GnRH בתאי קרצינומה של הלוע.

ספיגה תלויה בקולטן של GnRH וההתפלגות התאית של הליגנד בקולטן שלו בתאי סרטן ריאות נותחו על ידי טיפול סימולטני בקומפלקס GnRH פלואורסצנטי וצביעה של קולטן GnRH וגרעינים מסוג 1. התוצאות מראות כי קולטן GnRH מסוג 1 קשור לקרום התא בעוד שחלבון GnRH מופנם בתאים ונשאר בציטופלזמה שלהם. ספיגת GnRH בתאי קרצינומה של הלוע נחקרה גם באמצעות ניתוח FACS.

התוצאות מראות כי ספיגת GnRH שנצפתה כאשר תאים טופלו במיקרו-מולרית אחת של מצומד GnRH השתפרה מאוד כאשר המינון שהוחל על התאים הוגדל ל-10 מיקרומולר. לאחר שליטה, ניתן לסיים טכניקה זו תוך שמונה שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגן על הדגימות המטופלות וצבעי הפלואורסצנט מפני אור ישיר.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו כדאיות תאים או בדיקות אפופטוזיס על מנת לענות על שאלות נוספות כמו עד כמה יעילה התרופה הממוקדת GnRH יכולה לעכב את הצמיחה של סוג נתון של סרטן. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הטיפול בסרטן לחקור את היעילות של מערכות אספקת תרופות מבוססות GnRH בהיצמדות לתאים סרטניים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש במצומדי GnRH אלה המסומנים פלואורסצנטית כדי לחקור את הרגישות של תאים סרטניים לטיפולים ממוקדי GnRH.