פרוטוקולים לחקירת הפצת Host-הרקמה, הילוכים-mode, ואת ההשפעה על כושר Host של Densovirus ב bollworm הכותנה
12 באפריל 2017
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לחקור את חלוקת מארח-רקמות, מצב שידור, וכן השפעה על כושר המארח של densovirus בתוך מינים פרפראים, את bollworm הכותנה. פרוטוקול זה יכול לשמש גם עבור לימוד האינטראקציה בין וירוסים דרך פה-המשודר אחרים ומארחי החרקים שלהם.
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לחקור את ההשפעה של דנסו-וירוס, HaDV2, על המארח שלו, תולעת כותנה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האינטראקציה של מארח הווירוסים, כגון ההשפעה של וירוסים העומדים כעת בנתיב על המארחים שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו שהזחלים משתמשים בה לבניית זנים חיוביים ושליליים של הנגיף נגזר מאותם מארחים משותפים, מה שמבטיח את אותו רקע גנטי.
כדי להתחיל את הניסוי, שמונה הזדווגות של זוג יחיד של עשים סגורים חדשים על ידי שימוש בכלוב פלסטיק לזוג מכוסה בגזה כותנה כדי להבטיח אוורור טוב ולשמש כמצע מיקום ביצית. כדי להגדיל את הסבירות להשיג מושבה נקייה מווירוסים, השתמש לפחות ב-30 זוגות של זוגות הזדווגות בודדים. האכילו עש בוגרים בכדור צמר גפן ספוג בתמיסת 10% סוכר ו-2%, וחידשו את התמיסה מדי יום.
לאחר ההזדווגות של היום, כאשר נקבות בוגרות מטילות את ביציהן על גזה כותנה, מתחילות להחליף את הגזה מדי יום. אספו ותחזקו ביצים המכילות גזה באותו חדר גידול כמו העשים הבוגרים עד שהביצים בוקעות. העבר מיד זחלים שזה עתה בקעו לצלחות חדשות של 24 בארות עם פרט אחד לכל באר.
חמישה ימים לאחר מועד הטלת הביצים הראשון, אספו את עש ההורים ואחסנו אותם בחנקן נוזלי. בדוק אם יש HaDV2 של ההורים המשתמשים ב-PCR עם פריימרים ספציפיים, ושמור את האנשים ללא HaDV2 כזן שאינו נגוע ב-HaDV2. אוספים עשים בוגרים בנפרד ומאחסנים אותם מיד בחנקן נוזלי.
טוחנים לחלוטין עשים בודדים שנאספו בחנקן נוזלי באמצעות מרגמה ועלי מעוקרים. העבירו כ-10 מיקרוגרם פסולת לצינור נקי של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן העבירו את שארית הפסולת לצינור חדש ואז אחסנו אותם מיד בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס.
חלץ DNA מ-10 מיקרוגרם של פסולת בהתאם לפרוטוקולים שסופקו על ידי היצרן. לאחר בידוד ה-DNA של העש, בדוק אם יש HaDV2 באמצעות הפרוטוקול. על פי התוצאות, חלקו את הפסולת הנותרת לשתי קבוצות: HaDV2 חיובי ו-HaDV2 שלילי.
הוסף מיליליטר אחד של מי מלח עם חוצץ פוספט, או PBS, לכל אדם כדי להמיס לחלוטין את שאריות הזחל שנותרו. מצננים מראש את הצנטריפוגה ארבע מעלות צלזיוס, ואז מסובבים את ההומוגנט. על קרח, מסננים את הנוזל בעזרת מסנן הממברנה 0.22 מיקרון.
אוספים 200 מיקרוליטר לכל שפופרת של הנוזלים המסוננים, ומאחסנים אותם מיד בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס. כדי לקבוע את יעילות ההדבקה בפה עם נוזלים מסוננים נגועים ב-HaDV2 בריכוזים שונים על ידי דילול הנוזל המכיל HaDV2. במכסה אדים מורחים באופן שווה 200 מיקרוליטר של HaDV2 המכילים נוזלים מסוננים לכל ריכוז על פני התזונה המלאכותית המוצקה.
לאחר מכן, התחל להעביר 100 זחלים טריים שבקעו ל- HaDV2 המכיל תזונה מלאכותית בצלחת פטרי. דפקו בעדינות את גזה הכותנה כולל זחלים טריים שבקעו כדי להעביר את הזחלים מהגזה לדף נייר לבן. דפקו את הנייר בעדינות כך שהזחלים יסתובבו משי ויבלחו את הנייר.
השתמש במלקחיים מעוקרים כדי לגעת במשי ולהעביר את הזחלים לצלחת פטרי. לאחר 48 שעות, העבירו זחל בודד אחד לכל באר בתזונה המלאכותית לצלחות של 24 בארות. לגדל מחדש את הזחלים שחוסנו ב-HaDV2, תוך שימוש באותם ריכוזים לשלב הבוגר.
בדוק את מצב ההדבקה ב- HaDV2 של המבוגרים המשתמשים בפרוטוקול. מבוגרים שחוסנו ב-10 עד מספר העותק השמיני למיקרוליטר של HaDV2 הניבו 100% הדבקה והם נשמרים כזן חיובי ל-HaDV2. כדי למנוע זיהום, יש לעקר את המלקחיים והמספריים באתנול 75% שלוש פעמים ואז לחמם אותם בלהבה של מנורת אלכוהול.
בעזרת איזון אנליטי שקלו את הצינורות הריקים שישמשו לאחסון הרקמות. לאחר מכן הניחו את הזחלים והעשים הבוגרים מהזן הנגוע על קרח למשך כחמש דקות. תקן את הזחלים הקפואים על ציסטוספיאציה באמצעות שני סיכות חרקים המוחדרות בקרומים הבין-סגמנטליים ליד הראש ובקטע הבטן האחרון.
ואז בבטן האחורית, חותכים את פרולג הזחלים כך שההמולימפה יזרום החוצה. השתמש בפיפטה כדי לפיפטה כ-10 מיקרוליטר של המולימפה זחל תוך כ-10 שניות כדי למנוע השחמה וקרישה של המולימפה. בעזרת מספריים בצע חתך בציפורן החל מהקרום הבין-סגמנטלי האחרון ועד לראש.
בעזרת שני מלקחיים, נתחו את המעי הקדמי, המעי האמצעי, המעי האחורי, גוף השומן וצינורות מלפיגיים. כדי למנוע זיהום של הרקמות הנותרות עם המולימפה במהלך הדיסקציה, שטפו את הרקמות המנותחות במאגר PBS. מערבבים דגימות רקמה משלושה אנשים יחד כרפליקנט אחד.
העבירו מיד כל רקמה לצינורות בחנקן נוזלי. בצלחת פטרי נקייה המכילה בופר PBS, נתחו את הרקמות של נקבות וזכרים בוגרים והעבירו מיד כל רקמה לצינורות בחנקן נוזלי. שקלו את הצינורות ואת הרקמות הנ"ל יחד בנפרד וחשבו את מסת הרקמות.
חלץ DNA מרקמות אלה ובצע kPCR כדי לכמת את הטיטר הנגיפי של כל רקמה. הניחו לפחות 100 גלמים או עשים בוגרים שזה עתה הופיעו שמקורם בזן הלא נגוע בכלוב רשת תיל מכוסה גזה כותנה בנפח 5 ליטר. לאחר יומיים, נקבות בוגרות מזווגות יתחילו להטיל ביצים על גזה הכותנה.
אוספים ומתחזקים את גזה הכותנה המכילה את הביצים. המשך בחיסון זחלי יילודים על ידי העברת זחלי היילודים של הזן הלא נגוע לתזונה מלאכותית המכילה HaDV2 כדי לבסס את הזן הנגוע. באופן דומה, העבירו זחלי יילודים לתזונה המלאכותית המכוסה בנוזל מסונן נטול HaDV2 כדי לבסס את קבוצות הביקורת, הזן הלא נגוע.
כלול לפחות 240 זחלים בכל טיפול. לאחר 48 שעות מעבירים זחל בודד אחד לכל באר לצלחות של 24 בארות. מספור כל זחל בכל באר ברצף, ורשום את שלב הכוכב ומצב ההישרדות מדי יום.
כחמישה ימים לאחר מכן, כאשר התזונה המלאכותית מתדרדרת, העבירו את האנשים הללו במקביל לצלחת חדשה של 24 בארות המכילה תזונה מלאכותית טרייה. שקלו את הזחלים מהיום השביעי עד ה-11 באמצעות איזון אנליטי. לאחר השקילה, החזירו את הזחלים בנפרד לצלחת 24 הבארות.
עם ההיתוך לכוכב החמישי, כעשרה ימים לאחר הבקיעה, העבירו את הזחלים לצינורות זכוכית. העבירו את האנשים לצינור הזכוכית באותה שעה בכל יום. ניתן לזהות זחלי כוכב חמישי גם על ידי רוחב קפסולת הראש.
לאחר מכן, קודד כל זחל עם מספר ההתייחסות המקורי שלו על צינור הזכוכית באמצעות צבע או טושים. רשום את מצב הזחל מדי יום. רשום את הגלמים ותאריך האקלוזיה של כל פרט בצינור הזכוכית, ורשום את המסה של גלמים בני שלושה ימים.
לאחר האקלוזיה, הכניסו נקבה אחת וזכר אחד לכלוב יחיד עם תמיסת סוכרוז של 10% ויטמינים 2%. מלאו את תמיסת הסוכרוז מדי יום. רשום את תאריך הפטירה של כל עש.
כאשר מטילים ביצים, החלף את גזה הכותנה מדי יום. ספרו מיד את מספר הביצים. לבסוף, ספרו צאצאים שזה עתה בקעו בזמן שהם בוקעים.
נערכו טרי-אלים כדי להבטיח את איכות הדגימות ששימשו בניסוי. צאצאים מההורים הזכרים והנקבות שאנו ללא HaDV2 גודלו כזן לא נגוע. הצלחנו להגביר את גן האקטין בהורים ובצאצאים באמצעות אותה תבנית דנ"א, מה שמרמז על כך שתבניות הדנ"א היו באיכות טובה.
שמונת הצאצאים שנבחרו באקראי היו גם נקיים מ-HaDV2, HaNPV ו-Wolbachia. עקומה סטנדרטית המגדירה את הקשר בין לוג איכות החומר המוצא לערכי ה-CT שנצברו מראה מתאם ליניארי חזק בין ערכי ה-CT לבין הלוג של מספר עותק הגן הראשוני של HaDV2. מספר העותקים של HaDV2 חושב למיקרוגרם של כל רקמה, ואחוז הטיטר הכולל של HaDV2 עבור הרקמה הספציפית הראה כי HaDV2 מפוזר בעיקר בגוף השומן.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לטפל בזחלים העדינים במהלך חמשת הימים הראשונים לאחר בקיעתם במהלך הליך הצמיג.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה בוחן את התהודה ברקמות המאכסן, את אופן ההעברה ואת ההשפעות על כשירות המאכסן של ה-densovirus HaDV2 בתוך תולעת השֶּׁרָה של הכותנה. ניתן ליישם אותו גם כדי לחקור אינטראקציות בין וירוסים אחרים המועברים דרך הפה לבין המאכסנים החרקיים שלהם.
מרכיבי מפתח במחקר
תחום המדע
- וירולוגיה
- אנטומולוגיה
- אינטראקציות מאח-פתוגן
רקע
- דנסו-וירוסים (Densoviruses) הם קבוצה של נגיפים העשויים להדביק מאכסנים שהם חרקים.
- תולעת השֶּׁרִיב של הכותנה היא מזיק חקלאי משמעותי.
- הבנת האינטראקציות בין הנגיף למאכסן עשויה לסייע בגיבוש אסטרטגיות להדברה.
- פרוטוקול זה מאפשר ביצוע מחקרים מבוקרים של השפעות הנגיף על כשירות המאכסן.
מטרת המחקר
- לבחון את ההשפעות של HaDV2 על תולעת השש של הכותנה.
- לחקור את דרכי ההדבקה של דנסו-וירוסים (densoviruses).
- להעריך את השפעת הנגיף על כשירות והישרדות המארח.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השבאה של זוגות בודדים של עשים שסגרו לאחרונה בכלובים מאווררים.
- שימוש במושבה נקייה מווירוסים באמצעות השבאה מבוקרת.
- האכלת עשים בוגרים בתמיסת סוכר וויטמינים.
- חידוש יומי של תמיסת ההאכלה להבטחת תזונה.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מאפשר יצירת זנים חיוביים ושליליים לנגיף.
- שמירה על רקע גנטי עקבי בקרב נשואי הניסוי.
- מקל על חקר השפעות הנגיף על כשירות המאכסן.
- מספק תובנות לגבי דינמיקת העברת נגיפים באוכלוסיות חרקים.
מסקנות
- שיטה זו יעילה לחקר אינטראקציות של densovirus עם מאפחים מסדרת הפרפרים (lepidopteran).
- ניתן להתאימה עבור וירוסים אחרים המועברים דרך הפה.
- הממצאים עשויים לתרום לאסטרטגיות יעילות יותר להדברת מזיקים בחקלאות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
פרוטוקול זה מאפשר חקירה מבוקרת של אינטראקציות בין וירוס למארח במודלים של חרקים, ותומך בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלב מוקדם של תיקוף מטרות עבור תרופות ביולוגיות או אסטרטגיות להדברת מזיקים מבוססות RNAi. באמצעות הקמת מושבות איזוגניות הנגועות והבלתי נגועות, הוא מפחית שונות גנטית מבלבלת, ובכך מגביר את הביטחון החזוי בתוצאות של סריקת פנוטיפים. גישה זו מספקת רלוונטיות תרגומית להערכת יעילות ההעברה הפהית וטרופיזם ספציפי לרקמות, ובכך מסייעת בתכנון וקטורים ובניבוי טווח מארחים בפיתוח תרופות אנטי-ויראליות או פסטה-ביולוגיות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי בידוד השפעות הנגיף על כשירות המארח באמצעות השוואת זנים איזוגניים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אישור שהתוצאות הפנוטיפיות מיוחסות לנגיף ולא לסחף גנטי של המארח.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: יצירת מערכות ביולוגיות סטנדרטיות עם טיטרים ויראליים כמותיים ברקמות, המאפשרות קלט ניסויי הדיר בבדיקות לסריקת תרכובות או גנוטיפים.
- ערך תפעולי: מקל על המוכנות לבדיקה באמצעות פרוטוקולי הדבקה אוראלית המניבים ספיגה עקבית של זחלים ופרמטרים מדידים של טבלת חיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממפה את ההתפלגות ברקמות המאכסן (למשל, לוקליזציה בגוף השומן) כדי לזהות סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או אתרים של השפעות לא מכוונות באורגניזמים שאינם מטרה.
- ערך תפעולי: תומך במידול יעילות ההעברה, החיוני לניבוי עמידות סביבתית והפצה אופקית ביישומים שטח.
שילוב צינור עיבוד וזרימת עבודה
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה החל משלבי הגילוי המוקדמים ועד לשלב הפרה-קליני, בכך שהיא מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה להערכה של מערכות הולכה אוראליות ושל פעילות ספציפית למארח של סוכנים אנטומופתוגניים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות על השפעות כשירות המתווכות על ידי וירוסים, ותומכת בתיקוף מטרות באמצעות ניתוח טבלאות חיים של התפתחות, הישרדות ופוריות.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים כגון משך שלב הזחל/בובה ושיעורי פוריות, ומאפשרת הערכת תגובה למספר (dose-response) לאורך ריכוזים ויראליים שונים.
- אנליטיקה: מייצרת נתונים של עומס ויראלי ספציפי לרקמה באמצעות qPCR, מה שמאפשר קורלציה בין הטיטר לתוצאות פנוטיפיות לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מודלי זיהום מבוססי מעבדה לתוצאות רלוונטיות לשטח על ידי הערכת פוטנציאל העברה אנכית ואופקית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר לסריקה של וירוסים מרובים המועברים דרך הפה במודלים של פרפרי לבידופטרה (lepidopteran), ובכך מצמצמת פיתוח כפיל של מושבות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בקרה של הגנטיקה של המארח וסטנדרטיזציה של נתיבי ההדבקה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות מעקב מסונכרן אחר מחזור החיים ופרוטוקולים סטנדרטיים להפרדת רקמות.
- ערך אסטרטגי: משפר קבלת החלטות מסוג go/no-go בפיתוח ביולוגיים על ידי אספקת נתונים מוקדמים על השפעות הכשירות (fitness) במערכות מארח רלוונטיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים ויראליים בהתבסס על פרופילי טרופיזם לרקמות ויעילות העברה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול חרקים, כימות נגיפי באמצעות qPCR וטכניקות של ניתוח רקמות.
- תלוי בגישה למערכות סינון סטריליות, ציוד PCR ותאי סביבה מבוקרים לתרבית חרקים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים בדירוג הזיהום וברישום טבלאות חיים כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה כאשר מרחיבים את הבדיקה למאוכלים שאינם מסדר ה-Lepidoptera, בשל הבדלים בפיזיולוגיה של המעי ובמנגנוני כניסת נגיפים.
- מגבלות מעשיות כוללות טיפול פרטני עתיר עבודה בזחלים והצורך בגדלי מדגם גדולים כדי לזהות השפעות קלות על הכשירות הביולוגית.
שאלות נפוצות בנושא ביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:40
Construction of the HaDV2-free Cotton Bollworm Colony
2:02
Preparation of HaDV2-containing Liquid Fluids
3:28
Construction of the HaDV2-infected Cotton Bollworm Colony
4:57
Tissue Distribution of HaDV2
7:01
Bioassays Testing the Effect of HaDV2 on Host Development
9:36
Results: Characterization of Effects of Densovirus on Bollworms
10:44
Conclusion
