Name: ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: למדו ניתוח Immunofluorescence של גרגרי מתח בקשר לזיהומים חיידקיים בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת הערכה איכותית וכמותית של תגובות תאיות ללחצים חיצוניים ולפתוגנים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

נ.ב. היא נמענת של ביל ומלינדה גייטס גרנט האתגר הגדול OPP1141322. PV נתמך על ידי קרן המדע הלאומית השוויצרית מוקדמות פוסטדוק ניידות מילגות רוסט-קנטאריני פוסט דוקטורט. PJS נתמך על ידי מענק HHMI ו- ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

<ol><li>Reineke, L. C., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversion+of+stress+granules+and+P-bodies+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection.</a> Virology. 436 (2), 255-267 (2013).</li>
<li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules+and+cell+signaling%3A+more+than+just+a+passing+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li>
<li>Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+modulates+stress+granule+composition+and+inhibits+stress+granule+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation.</a> Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).</li>
<li>Kolobova, E., Efimov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-dependent+association+of+AKAP350A+and+CCAR1+with+RNA+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules.</a> Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+the+Tao+of+RNA+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+biochemical+sciences%22%5BJournal%5D)">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressful+initiations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stressful initiations.</a> J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).</li>
<li>Mohr, I., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+translation+at+the+nexus+of+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Host translation at the nexus of infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).</li>
<li>Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+formation+mediates+the+inhibition+of+colonic+Hsp70+translation+by+interferon-+and+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor.</a> Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).</li>
<li>Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+pitfalls+in+Shigella+vaccine+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Progress and pitfalls in Shigella vaccine research.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).</li>
<li>Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Causes+of+Diarrheal+Disease+Mortality+in+Children%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children.</a> PloS One. 8 (9), 72788(2013).</li>
<li>Ashida, H., Ogawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+deploy+multiple+countermeasures+against+host+innate+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses.</a> Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).</li>
<li>Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+are+versatile+mucosal+pathogens+that+circumvent+the+host+innate+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system.</a> Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li>
<li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+inside%3A+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Re.+Micro%22%5BJournal%5D)">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

הפרוטוקול המתואר כאן מתאר את אינדוקציה, לוקליזציה וניתוח של SGS בתאים שאינם נגועים ותאים נגועים הפתוגן cytosolic S. flexneri בנוכחות או היעדר הלחץ אקסוגני. באמצעות תוכנת הדמיה חופשית, פרוטוקולים מאפשר ניתוח איכותי וכמותי מדויק של היווצרות SG לזהות וכתובת סטטיסטית ההבדלים פנוטיפים נתון. ישנם מספר צעדים קריטיים במסגרת הפרוטוקול עבור הזיהום, SG- השראה חלקים הדמיה. עבור זיהום, חשוב אינטראקציה חיידקית עם תאים...

ויזואליזציה של אינטראקציות בין מחוללי מארח-פתוגן ברמה התאית היא שיטה רבת עוצמה להשגת תובנות לגבי אסטרטגיות פתוגניות ולזיהוי מסלולים סלולריים מרכזיים. ואכן, פתוגנים יכולים לשמש כלים כדי לאתר מטרות או מבנים סלולריים חשובים, כמו פתוגנים התפתחו כדי לחתור התהליכים הסלולר המרכזי כאסטרטגיה ההישרדות שלהם או התפשטות. ויזואליזציה של רכיבים סלולריים יכולה להיות מושגת על ידי רקומביננטי להביע fluorescently מתויג חלבונים מארח. בעוד זה מאפשר ניתוח בזמן אמת, הדור של שורות תאים עם ספציפית מתויג חלבונים מארח הוא מאוד מייגע עלול לגרום לתופעות לוואי לא רצויות. יותר נוח הוא זיהוי של גורמים סלולריים באמצעות נוגדנים ספציפיים, כי גורמים מרובים המארח ניתן לנתח בו זמנית ואחד אינו מוגבל לסוג תא מסוים. החיסרון הוא רק תצוגת סטטי ניתן ללכוד כמו ניתוח immunofluorescence מחייב fixat תא המארחיוֹן. עם זאת, יתרון חשוב של הדמיה immunofluorescence היא שזה בקלות משאיל את עצמו הן ניתוח איכותי וכמותי. זה בתורו יכול לשמש כדי להשיג הבדלים משמעותיים מבחינה סטטיסטית כדי לספק תובנות חדשות אינטראקציות מארח פתוגן. ניתוח פלורסנט תוכניות ניתוח הם כלי ניתוחי רב עוצמה לביצוע 3D ו 4 D ניתוח. עם זאת, העלות הגבוהה של התוכנה ותחזוקה שלה לעשות שיטות המבוססות על תוכנות קוד פתוח חינם יותר אטרקטיבי. ניתוח תמונה זהיר באמצעות ביו ניתוח תוכנה הוא בעל ערך כפי שהוא מבסס ניתוח ויזואלי, כאשר הקצאת משמעות סטטיסטית, מגביר את הביטחון בנכונות פנוטיפ נתון. בעבר, SGs נותחו באמצעות תוכנת ImageJ חינם, אשר מחייב זיהוי ידני של SGS 4 בודדים. כאן אנו מספקים פרוטוקול אינדוקציה וניתוח של SG SG הסלולר בהקשר של bacזיהומים טרליים באמצעות קוד פתוח חופשי ניתוח תמונה תוכנה ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). תוכנת ניתוח ביו התמונה יש מובנית גלאי נקודה תוכנית כי הוא מתאים מאוד לניתוח SG. זה מאפשר כוונון עדין של תהליך זיהוי אוטומטי באזורים ספציפיים של ריבית (ROIs). זה מתגבר על הצורך בניתוח ידני של SGs הפרט מסיר הטיה הדגימה. רבים סביבתיים מדגיש לגרום היווצרות של SGS, שהם שלב cytosolic צפופה שלב, מבנים שאינם קרום של 0.2 - 5 מיקרומטר בקוטר 5 , 6 . תגובה סלולרית זו נשמרת בצורה אבולוציונית בשמרים, בצמחים וביונקים, והיא מתרחשת כאשר תרגום החלבון העולמי מעוכב. זה כרוך צבירה של מתחמי היזום התרגום נתקע לתוך SGs, אשר נחשבים מקומות החזקת עבור mRNAs translationally-inactive, המאפשר תרגום סלקטיבי של קבוצת משנה של mRNAs הסלולר.עם הסרת הלחץ, SGs לפזר את שיעורי הגלובלית של סינתזת החלבון לחדש. SGs מורכבים תרגום התארכות גורמים הארכה, חלבונים המעורבים RNA מטבוליזם, RNA מחייב חלבונים, כמו גם חלבונים פיגומים וגורמים המעורבים תא המארח איתות 2 , למרות ההרכב המדויק יכול להשתנות בהתאם ללחץ מוחל. גורמים סביבתיים אשר מעוררים היווצרות SG כוללים רעב חומצות אמינו, קרינה UV, הלם חום, הלם אוסמוטי, מתח reticulum endoplasmic, היפוקסיה וזיהום ויראלי 2 , 7 , 8 . התקדמות רבה נעשתה בהבנת האופן בו וירוסים מעוררים וגם מערערים את מבנה ה- SG, בעוד שרק מעט ידוע עדיין על האופן שבו פתוגנים אחרים, כגון פתוגנים, חיידקים פטרייתיים או פרוטוזנים, משפיעים על תגובת המתחים הסלולרית 1 , 7 . שיגLla flexneri הוא גרם שלילי pathulative cytosolic הפתוגן של בני האדם ואת הגורם הסיבתי של שלשולים חמורים או shigellosis. Shigellosis הוא נטל בריאות הציבור העיקרי ומוביל 28,000 מקרי מוות בשנה אצל ילדים מתחת לגיל 5 של 9 , 10 . ס flexeneri מדביק את אפיתל הקולוני ומתפשט תא לתא ידי חטיפת המרכיבים cytoskeletal של המארח 11 , 12 . זיהום של אפיתל תומך שכפול של ס flexeneri בתוך cytosol אבל מקרופאגים נגועים למות דרך תהליך דלקתיות המוות הנקרא pyroptosis. זיהום מוביל לגיוס מסיבי של נויטרופילים ודלקת חמורה המלווה בחום, מתח חמצוני והרס רקמות. לכן, בעוד תאים נגועים כפופים ללחצים פנימיים המושרה על ידי זיהום, כגון הפרעות Golgi, מתח genotoxic ו סידור מחדש של cytoskeletalS, תאים נגועים הם גם נתון ללחץ סביבתי עקב תהליך דלקתי. אפיון ההשפעה של זיהום S. flexneri על היכולת של תאים להגיב על מדגיש סביבתי באמצעות מספר סמנים SG הוכיח כי זיהום מוביל הבדלים איכותיים כמותיים הרכב SG 3 . עם זאת, מעט ידוע על פתוגנים חיידקים אחרים. כאן אנו מתארים מתודולוגיה של זיהום של תאים המארח עם הפתוגן cytosolic S. flexneri , הדגשת תאים עם מדגיש סביבתי שונים, תיוג של רכיבי SG, ואת ניתוח כמותי וכמותי של SG הרכב והרכב בהקשר של נגוע ותאים שאינם נגועים. שיטה זו מיושמת באופן נרחב פתוגנים חיידקים אחרים. בנוסף, ניתוח התמונה של היווצרות SG עשוי לשמש זיהומים על ידי וירוסים או פתוגנים אחרים. זה יכול לשמש כדי לנתח SGהיווצרות זיהום או השפעת זיהום על היווצרות SG בתגובה ללחץ אקסוגני.

<table><tbody><tr><td><נוגדנים חזקים>ראשוניים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eIF3b (N20), מקור עז&nbsp;</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-16377</td><td>סמן SG חזק ונמצא בשימוש נרחב. צביעה ציטוזולית מאפשרת תיחום תאים. דילול 1:300</td></tr><tr><td>eIF3b (A20), מקור עז&nbsp;</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-16378</td><td>אותה מטרה כמו eIF3b (N20) ובידינו הייתה זהה ל-eIF3b (N20). דילול 1:300</td></tr><tr><td>eIF3A (D51F4), ארנב מקור (MC: חד שבטי)</td><td>איתות תאים</td><td>3411</td><td>חלק מקומפלקס eIF3 מולטי-חלבון עם eIF3b. דילול 1:800</td></tr><tr><td>eIF4AI, עז מקור&nbsp;</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-14211</td><td>מומלץ על ידי (Ref # 13). דילול 1:200</td></tr><tr><td>eIF4B, מקור ארנב</td><td>Abcam</td><td>ab186856</td><td>סמן גרגירי מתח טוב בידינו. דילול 1:300</td></tr><tr><td>eIF4B, מקור ארנב</td><td>איתות תאי</td><td>3592</td><td>מומלץ על ידי Ref # 13. דילול 1:100</td></tr><tr><td>eIF4G, ארנב מקור</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-11373</td><td>סמן SG בשימוש נרחב. (הפניה # 13): ייתכן שלא יעבוד טוב בשורות תאי עכבר. דילול 1:300</td></tr><tr><td>G3BP1, ארנב מקור (MC: חד שבטי)BD</td> <td>Biosciences</td><td>611126</td><td>סמן SG בשימוש נרחב. דילול 1:300</td></tr><tr><td>Tia-1, מקור עז&nbsp;</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-1751</td><td>סמן SG בשימוש נרחב. ניתן למצוא גם בגופי P כאשר SG נוכחים (Ref # 13). דילול 1:300</td></tr><tr><td><חזק>אלכסה מצומד נוגדנים משניים </חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A488 נגד עזים, חמור מוצא</td><td>תרמו פישר</td><td>A-11055</td><td>קרוס נספג. דילול 1:500</td></tr><tr><td>A568 נגד עזים, חמור מקור</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11057</td><td>Cross נספג. דילול 1:500</td></tr><tr><td>A488 נגד עכבר, חמור מקור</td><td>תרמו פישר</td><td>A-21202</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>A568 נגד עכבר, חמור מקור</td><td>תרמו פישר</td><td>A10037</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>A647 נגד עכבר, חמור מקור</td><td>תרמו פישר</td><td>A31571</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>A488 נגד ארנב, חמור מקור</td><td>תרמו פישר</td><td>A-21206</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td>A568 אנטי ארנב, חמור מקור</td><td>Thermo Fisher</td><td>A10042</td><td>דילול 1:500</td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים אחרים</חזקים><</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>em>Shigella flexneri</td><td></td><td></td><td>זמין במעבדות שונות על פי בקשה</td></tr><tr><td>מרק טריפטון קזאין סויה (TCS) BD</td><td>Biosciences</td><td>211825</td><td>מדיום גידול סטנדרטי לשיגלה, יישום - גידול חיידקים</td></tr><tr><td>TCS agar</td><td>BD Biosciences</td><td>236950</td><td>אגר גידול סטנדרטי לשיגלה, יישום - גידול חיידקים</td></tr><tr><td>קונגו אדום</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>27215.01</td><td>כלי דיסטרימינציה לשיגל שאיבדו את פלסמיד האלימות, יישום - גידול חיידקים</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין (PLL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1274</td><td>שימושי לציפוי חיידקים להגברת זיהום, יישום - זיהום</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td>הרג סלקטיבי של חיידקים חוץ-תאיים אך לא ציטוזוליים, יישום - זיהום</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630-056</td><td>מאגר PH שימושי כאשר תאים מודגרים ב-RT, יישום - תרבית</td></tr><tr><td>תאים מדיום הנשר השונה (DMEM) Life</td> <td>Technologies</td><td>31885</td><td>מדיום תרבית סטנדרטי לתאי HeLa, יישום - תרבית תאים</td></tr><tr><td>סרום עגל עוברי (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S1810-100</td><td>תוסף 5% המשמש למדיום תרבית תאי HeLa, יישום - תרבית תאים</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td>דילול 1:100 המשמש למדיום תרבית תאי HeLa, יישום - תרבית תאים</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>מדלל ריאגנט, יישום - תרבית תאים</td></tr><tr><td>נתרן ארסניט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7400</td><td>משרה גרגירי מתח חזק (הערה: רעיל מאוד, נדרש טיפול וסילוק מיוחדים), יישום - משרה מתח</td></tr><tr><td>Clotrimazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6019</td><td>משרה גרגירי מתח חזק (הערה: סכנה בריאותית, נדרש טיפול וסילוק מיוחדים), יישום - משרה מתח</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA</td><td>Electron Microscopy Scences</td><td>15714</td><td>4% PFA משמש לקיבוע סטנדרטי של תאים, יישום - קיבוע</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>משמש ב-0.03% לחדירות של תאי מארח לפני צביעה אימונופלואורסצנטית, יישום - חדירות</td></tr><tr><td>A647-phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>A22287</td><td>דילול הוא ב-1:40, עדיף להוסיף במהלך צביעת נוגדנים משנית, יישום - צביעת</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>צביעת חומצת גרעין המשמשת להמחשת גרעין המארח והחיידקים, יישום - צביעת</td></tr><tr><td>סרט פרפין</td><td>Parafilm Sigma-Aldrich</td><td>BR701501</td><td>שימושי לצביעה אימונופלורסנט של כיסויים, יישום - צביעה</td></tr><tr><td>Prolong Gold</td><td>Thermo Fisher</td><td>36930</td><td>אמצעי הרכבה חזק שעובד היטב עבור רוב הפלואורופורים, יישום - הרכבה</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>מדיום הרכבה זול וחזק שעובד היטב עבור רוב הפלואורופורים, יישום - הרכבה</td></tr><tr><td>של צלחת תרבית תאים 24 בארות</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527</td><td>לוחות תרבית רקמות סטנדרטיים, יישום - תרבית תאים</td></tr><tr><td>12 מ"מ&nbsp; כיסויי זכוכית</td><td>NeuVitro</td><td>1001/12</td><td>תמיכה בתרבית תאים ליישומים אימונופלואורסצנטיים, יישום - מלקחיים לתמיכה בתא</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>אמצעי הרכבה זול וחזק שעובד היטב עבור רוב הפלואורופורים, יישום - הרכבה</td></tr><tr><td><חזקה>תוכניות וציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism</td><td>תוכנת</td><td></td> GraphPad <td>ניתוח נתונים ותוכנית גרפים עם אפשרויות בדיקה סטטיסטיות חזקות, יישום - ניתוח נתונים</td></tr><tr><td>Leica SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>מיקרוסופ קונפוקלי, יישום - תמונה רכישה</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>תוכנה מקצועית לניתוח תמונה, אפליקציה - ניתוח נתונים</td></tr><tr><td>אקסל</td><td>מיקרוסופט</td><td></td><td>תוכנה לניתוח נתונים וגרפים, אפליקציה - ניתוח נתונים</td></tr></tbody></table>

ניתוח immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

הדמיה פלואורסצנטית של רכיבים סלולריים היא כלי יעיל לחקור אינטראקציות מארח פתוגן. פתוגנים יכולים להשפיע על מאפיינים שונים של תאים נגועים, כולל אולטרה אולטרה, ארגון רשת cytoskeletal, כמו גם תהליכים סלולריים כגון גרגר מתח (SG) היווצרות. האפיון של כמה פתוגנים לחתר תהליכים מארח הוא חלק חשוב ואינטגרלי של השדה הפתוגנזה. בעוד שפנוטיפים משתנים עשויים להיות גלויים לעין, הניתוח המדויק של ההבדלים האיכותיים והכמותיים במבנים הסלולאריים הנגרמים על ידי אתגר הפתוגן הוא הכרחי להגדרת הבדלים משמעותיים בין דגימות ניסוייות ובקרה. גיבוש SG הוא תגובת מתח משמרת אבולוציונית המוביל לתגובות אנטי ויראליות ונחקרה זמן רב תוך שימוש בזיהומים ויראליים 1 . גיבוש SG משפיע גם מפלי איתות עשוי להיות conseq אחרים עדיין לא ידוע2 . אפיון תגובה זו ללחץ לפתוגנים, מלבד וירוסים, כגון פתוגנים חיידקיים, הוא כיום תחום מחקר חדש. לעת עתה, ניתוח כמותי ואיכותי של היווצרות SG עדיין לא נעשה שימוש שגרתי, גם במערכות ויראלי. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה עבור גרימת ואפיון SG המבנה בתאי נגוע ובתאים נגועים פתוגן חיידקי cytosolic, אשר משפיע על היווצרות של SG בתגובה למתח אקסוגני שונים. ניתוח של היווצרות SG והרכב מושגת באמצעות מספר סמנים שונים SG גלאי נקודה התוספת של ICY, כלי ניתוח קוד פתוח התמונה.

כדי להסביר ולהמחיש את הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה, אנו מאופיין את התמונה של clotrimazole- המושרה SGS ב תאים hella נגוע או לא עם הפתוגן cytosolic S. flexneri . מתווה של הנוהל מוצג בתרשים 1 , וכולל נגיפי ואכזרית ס. Flexneri מפוספס על קונגו צלחות אדומות, הכנת חיידקים, זיהום, תוספת של מתח סביבתי, קיבוע מדגם מכתים, הדמיה מדגם quantitation, כמו גם ניתוח תמונה . מספר לחצים שונים עשויים לשמש כדי ליצור גיבוש S...

אנו מתארים שיטה לניתוח כמותי וכמותי של גרגר גרגר הלחץ בתאי יונקים לאחר התאים מאותגרים עם חיידקים ומספר לחצים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מנת לחקור את התגובה גרגר הלחץ הסלולר במגוון רחב של אינטראקציות מארח חיידקי.

ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להעריך את ההשפעות של זיהום חיידקי על היכולת של תאי המאכסן להוות גרנולות תאב (stress granules) כמענה למעקה חיצוני. שיטה זו מהווה כלי בעל ערך בתחום המיקרוביולוגיה התאית להערכה אם פתוגן מסוים מסוגל לשנות או לעקוף את נתיב גרנולות התאב כולו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח גרנולות תאב באופן איכותי וכמותי, בצורה קפדנית ואוטומטית, באמצעות תוכנות חינמיות לניתוח תמונות.שיטה זו מספקת תובנה לגבי הדינמיקה של היווצרות גרנולות דחק (stress granules) והרכבן, וכיצד פרמטרים אלו מושפעים מפתוגן ספציפי. תודה. לפני תחילת האתגר, יש להחדיר מושבת חיידקי *S.flexneri* M90T אדומות מלוח tryptic soy agar עם 1% Congo red ששורטט לאחרונה, אל תוך מבחנה קונית בנפח 15 מיליליטר, המכילה שמונה מיליליטר של tryptic soy broth.לאחר הידוק המכסה, הדגרו את המושבה למשך לילה עם ניעור ב-222 RPM ובטמפרטורה של 30 degrees Celsius. למחרת, בצעו תת-תרבית של 150 microliters מהחיידקים בתוך שמונה milliliters של tryptic soy broth טרי למשך כשעתיים ב-37 degrees Celsius ו-222 RPM, כדי להניע את ביטוי הגנים של העוצמה (virulence) בשלב אקספוננציאלי מאוחר ולהגביר את יכולת ההדבקה של החיידקים. כאשר הצפיפות האופטית (optical density) של תת-התרבית היא בין 0.6 ל-0.9, העבירו מיליליטר אחד של החיידקים לשפופרת של 1.5 milliliter לצורך איסופם באמצעות צנטריפוגה.ששחקו שוב את המשקע במצע הדבקה בצפיפות אופטית של אחת. לאחר מכן, שאבו את העל-מclearfix (supernatants) מכל באר של תרבית תאי HeLa על זכוכית כיסוי. שטפו בזהירות את תאי ה-HeLa באמצעות 500 µL של מצע HeLa תרמי טרי בטמפרטורת החדר לכל באר.החליפו את תמיסת השטיפה ב-500 µL של תווך הדבקה לכל באר, וסובבו את פלטת 24 הבארים בצנטריפוגה כדי להשקיע את החיידקים על התאים. העבירו את תרביות החיידקים השקועות למדגרה לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות כדי לאפשר את הדבקת תאי המאכסן. בתום הדגירה, הסירו את החיידקים החיצוניים מהתאים באמצעות שלושה שטיפות של 1 mL תווך תרבית HeLa טרי בטמפרטורה של 37 °C לכל שטיפה.לאחר מכן, כסו את התאים המודבקים במיליליטר אחד של מצע גידול טרי המכיל gentamicin והחזירו את הצלחת לאינקובטור לתרבית תאים. בסיום הדגירה, החליפו את המצע ב-500 microliters של מצע הגידול המתאים, המועשר בגורם העקה (stressor) הרלוונטי, והחזירו את התאים לאינקובטור לתרבית רקמות. לאחר שעה אחת, שאבו את העלייה (supernatant) באופן מלא, וקבעו את הדגימות ב-0.5 milliliters של 4%paraformaldehyde ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.בשלב הבא, יש להשליך את החומר המקבע למכל הפסולת המתאים, ולשטוף את הזכוכיות עם מיליליטר אחד של Tris-buffered saline למשך שתי דקות תוך ניעור עדין. בסיום השטיפה, יש לשאוב את ה-TBS לחלוטין ולהחדיר חומרים לתאים (permeabilization) בכל באר באמצעות 500 microliters של 0.3% Triton X-100 ב-TBS. לאחר 10 דקות, החליפו את תמיסת החדירה במיליליטר אחד של TBS, סובבו את הפלטה בעדינות, והחליפו את ה-TBS במיליליטר אחד של תמיסת חסימה (blocking solution) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.כדי לסמן את התאים באמצעות תערובת נוגדנים ראשוניים רצויה, טפטפו 50 µL של תערובת הנוגדנים הראשוניים לכל זכוכית כיסוי על גבי פיסת פראפילם (Parafilm) המודבקת היטב למשטח העבודה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להרים את זכוכית הכיסוי הראשונה. טפיחו את קצה זכוכית הכיסוי על פיסת נייר סופג כדי להסיר את שאריות הנוזל.הניחו בזהירות את לוחית הכיסוי על הטיפה והדגירו את לוחות הכיסוי תחת תנאי הסימון המתאימים. בסיום דגירת הסימון עם הנוגדן הראשוני, העבירו כל לוחית כיסוי לבאר נפרדת של פלטת 24 בארות חדשה המכילה 1 mL של TBS לכל באר, ושטפו את התאים בטמפרטורת החדר על מנער פלטות למשך חמש דקות, שלוש פעמים. לאחר השטיפה האחרונה, סמנו את התאים בכל לוחית כיסוי באמצעות תערובת קוקטייל הנוגדנים המשניים המתאימה, כפי שהודגם כעת.הדגרימו את כיסויות הזכוכית בחושך למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסיום דגירת הסימון בנוגדן השני, שטפו את התאים ב-1 mL של PBS שלוש פעמים בלוח 24 בארות חדש תוך써 ניעור עדין כפי שהודגם, אך תוך הגנה מהאור. לאחר השטיפה האחרונה, טבלו את כל כיסוי בבדיוק קצר במים דה-יוניים להסרת המלח, ייבשו את קצוות הכיסויות בנייר סופג, והניחו בזהירות את הכיסויות על 5 µL של תמיסת קיבוע פלואורסצנטית לכל שקף מיקרוסקופ מזכוכית, ללא בועות.לאחר מכן, אטמו את כיסית הזכוכית בעזרת לק. אחסנו את השקופיות כנדרש עד לביצוע הדימוג. כדי לדגם את התאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית, התחילו בבחירת העדשה המתאימה והערוצים הפלואורסצנטיים המתאימים לרכישת הדמויות.לאחר מכן, רכשו מחסניות תמונות (image stacks) של התאים, באמצעות תוכנת הדימיון המתאימה. כאשר כל התמונות נלכדו, השתמשו בתוכנה המתאימה לניתוח תמונות כדי לכווץ את מחסניות התמונות ולשמור אותן כקבצי TIFF. בשלב הבא, טענו תמונת TIFF של ביקורת ותמונת TIFF ניסויית לפלטפורמת ניתוח התמונות, ובחרו ב-Lookup Table כדי לפתוח את פרמטרי הערוץ בחלון ה-Sequence.לחצו על כל תיבות הסימון בלשונית הערוצים (channel tab) כדי לבטל את כל הערוצים. לאחר מכן לחצו על ערוץ אפס, ולחצו על פס הצבע של ערוץ אפס כדי לבחור את הצבע המועדף, תוך הגברת עוצמת הערוץ לפי הצורך כדי לה可ראות את כל המבנים. לאחר בחירה והתאמה של כל ערוצי הצבע המתאימים לאניליזה הניסויית, בחרו בלשונית הקנבס (canvas tab) והתאימו את לשונית הזום (zoom tab) כדי להציג כ-10 תאים לכל שדה ראייה.בעזרת כלי הפוליגון, לחצו על התא הרלוונטי והמישיכו את הקו מסביב לתא כדי להגדיר את גבול התא. כדי להעניק שם לאזור עניין זה, בחלון אזורי העניין, לחצו לחיצה ימנית על התא הרלוונטי, ולחצו לחיצה כפולה על שם אזור העניין כדי לשנותו. לאחר בחירה ומתן שם לכל התאים הרלוונטיים באופן דומה, פתחו את אפליקציית ה-Spot Detector תחת לשונית הגילוי והמעקב (detection and tracking).פתחו את לשונית ה-Pre Processing ובחרו את הערוץ לניתוח. בלשונית ה-Detector, בחרו ב-Detect bright spots over dark background ובחרו את קנה המידה והרגישות המתאימים. תחת לשונית ה-Region of Interest, בחרו את אזור העניין המוצע מתוך הרצף.תחת לשונית Filtering, בחר NoFiltering. בלשונית Output, בחר את הפלט המתאים. בחר Remove previous spots rendered as regions of interest ולחץ על no file selected כדי לבחור את התיקייה לשמירת הקובץ.לאחר מכן, תחת הלשונית Display, בחרו את האפשרויות הרלוונטיות המבוקשות ולחצו על Start Detection. בתוך התוכנה לניתוח הדמיות, ניתן להשתמש בגלאי הנקודות (spot detector) כדי לזהות את גרנולות העקה (stress granules) בתוך כל אחד מאזורי העניין שהוגדרו. לאחר מכן ניתן להפיק תמונה בינארית להצגת כל גרנולות העקה שזוהו.ניתוח גרנולות דחק חייב להיות מותאם בקפידה לכל קבוצת גרנולות דחק הנבדקת. לדוגמה, שינוי בדרישות הגודל של אזור העניין (ROI) המזוהה, או שינוי ברגישות של פרמטרי הזיהוי, יובילו לתוצאות משתנות. במקשקול של גודל פיקסל גבוה יותר, גרנולות דחק קטנות יותר לא ייספרו, ומספר גרנולות הדחק יפחת.בעוד שהעלאת הרגישות מובילה לעלייה במספר הגרנולות של הסטרס (stress granules). לדוגמה, בניסוי זה, קנה מידה של 2 עם רגישות של 100 הניב את התוצאה הטובה ביותר עבור הסמן G3BP1 לגרנולות סטרס. לעומת זאת, קנה מידה של 2 עם רגישות של 55 הניב את התוצאה הטובה ביותר עבור הסמן EIF3B לגרנולות סטרס.ניתן לחשב את שטח הפנים על סמך גודלם של גרנולי הסטרס (stress granules). תרשימי התפלגות תדירויות שימושיים להדגשת שינויים בגודל גרנולי הסטרס בין אוכלוסיות תאים שונות. בנוסף, עצימות הפלואורסצנציה יכולה לספק מידע על איכות גרנולי הסטרס שנותחו.ברגע שהשיטה נשלטת, ניתן לבצע את אתגר התא השלם בערך בשישה עד שבע שעות, ואת הניתוח ניתן להשלים בשעתיים עד שלוש שעות נוספות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבד תמיד את דגימות הביקורת ואת הדגימות הניסיוניות בו-זמנית ותחת אותם תנאים, כדי למזער את השונות בנתונים. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להרחיב את הניתוח לנפח תלת-ממדי כדי לקבל תובנות נוספות לגבי מיקום הגרנולות של הלחץ (stress granules).פרוצדורה חצי-אוטומטית זו מאפשרת ניתוח קפדני ובלתי מושפע של גרנולות עקה (stress granules) בתאים לא מזוהמים ובתאים מזוהמים. היא עשויה לחשוף שיבושים שטרם היו ידועים במסלול של גרנולות העקה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מזהמים תאים בחיידקים, כיצד להשרות היווצרות של גרנולות עקה, וכיצד להשתמש בגישה חצי-אוטומטית לניתוח גרנולות עקה באופן איכותני וכמותי.ואל תשכחו כי עבודה עם *Shigella flexneri* וחומרים המשרים גרנולות של עקה (stress granules) כגון clotrimazole עלולה להיות מסוכנת, וכי נדרשים אמצעי זהירות כגון חבישת כפפות, עבודה במעבדת BL2 וסילוק נאות של כל הרכיבים.

immunofluorescence-analysis-stress-granule-formation-after-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Cayron, J., et al. ניתוח רב-ממדי של צמיחת חיידקים תחת טיפולי לחץ. J. Vis. Exp. (2019).סרטון זה מדגים כיצד להכין ולהשתמש בצלחת מיקרופלואידית להדמיית תאי חיידקים בתנאי עקה. הוא מתאר את תהליך החדרת תרבית חיידקים ומדיום אנטיביוטי מעורר מתח, ואחריו העמסת תאים והתקנה מיקרוסקופית. לאחר מכן משתמשים בהדמיית זמן-lapse במצב ניגודיות פאזה כדי לצפות בהתפתחות של תאים מוארכים וחוטיים עם תכולת DNA מוגברת עקב חלוקת תאים מעוכבת.

ניתוח מיקרוסקופי של גידול חיידקים תחת לחץ באמצעות תאים מיקרופלואידיים

מקור: וונאש, פ. ואח', ניתוח אימונופלואורסצנציה של יצירת גרנולות לחץ לאחר אתגר חיידקי של תאי יונקים. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים את זיהום תאי האפיתל בחיידק הפתוגני Shigella flexneri ואת תגובת התאים המארחת שנוצרת. חלבוני אפקטור חיידקיים משבשים את תרגום המארח, וגורמים להיווצרות אברונים חסרי ממברנה הנקראים גרגירי מאמצים, המשקפים את תגובת התא האדפטיבית לזיהום.

יצירת גרגירי לחץ במהלך זיהום שיגלה בתאי אפיתל סרטניים

סרטון זה מדגים בדיקה לאפיון וכימות גרגרי עקה של יונקים, המורכבים מ-mRNAs, חלבונים קושרי RNA (RBPs) וחלבונים שונים אחרים.

בדיקת אימונופלואורסנציה לאפיון וכימות גרגרי עקה של יונקים

פיתחנו פלטפורמה מיקרופלואידית לבדיקות רגישות לאנטיביוטיקה במהירות. נוזל מועבר במהירויות גבוהות על חיידקים משותקים בתחתית ערוץ מיקרופלואידי. בנוכחות מתח ואנטיביוטיקה, זנים רגישים של חיידקים מתים במהירות. עם זאת, חיידקים עמידים יכולים לשרוד את התנאים מלחיצים אלה.

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

גרגרי מתח (SGS) הם גרגרי cytoplasmic RNA המכילים חלקיקים נתקע ribonucleoprotein (RNPs), וחשובים בתגובה תאית ללחצים שונים. דינמיקה של SGS יכולה להיות מיושמת בתאי חיים על ידי הדמיה הלוקליזציה של רכיב מתויג של SGS בתאים ראשוניים transfected אחרי המתח.

ויזואליזציה של מתח G3BP גרגרי Dynamics בראשי תאים בשידור חי

גרגרי מתח (SGs) הם מבנים cytoplasmic לא ממברנות אשר יוצרים בתאים חשופים למגוון של לחצים. SGS מכילים mRNAs, RNA מחייב חלבונים, יחידות קטנות ריבוזומליות, גורמים הקשורים לתרגום, וחלבונים שונים איתות איתות. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה המשתמשת במספר גישות ניסיוניות כדי לזהות, לאפיין, לכמת SGs בתום לב .

שיטות לסיווג מוקדים Cytoplasmic כמו גרגרי מתח יונקים

אנו מציגים פרוטוקול להצפנה באמצעות מיקרוסקופ STED בו-זמנית תמונה אקטין מבנים, microtubules של microtubule פלוס-end מחייב חלבונים בתאי B שהופצו על coverslips מצופה נוגדנים לקולטן B-cell, מודל עבור השלב הראשוני היווצרות מערכת החיסון סינפסה.

להמחיש את אקטין ואת Microtubule Cytoskeletons על הסינפסה B-cell המערכת החיסונית באמצעות מיקרוסקופ דלדול (STED) פליטה מאולצת

פיתחנו assay מבוססי לזיהוי של עיצוב רב טוב עבור בודק את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד. Assay הזה הוא תואם cytometry זרימה immunostaining, מיקרוסקופ כוח המתיחה, המאפשרות מדידות כמותיים של אינטראקציות biomechanical בין תאים, מטריצה חוץ-תאית, לבין חיידקים פתוגניים.

Assay מבוססי לזיהוי עיצוב רב טוב ללמוד את ההשפעה של מטריצה חוץ-תאית נוקשות על זיהום חיידקי של תאים חסיד

פרוטוקול זה מאפשר תיאור בזמן הפתרון של גידול חיידקי בתנאי לחץ בתא בודד ואת רמות האוכלוסייה התא.

רב היקף ניתוח של צמיחה חיידקים תחת טיפולי סטרס

אנו מציגים זרימת עבודה זמינה בחופשיות שנבנתה לחיפוש מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתאי תא ספציפיים בתמונות מיקרוסקופית הקרינה. זרימת עבודה ידידותית למשתמש זו מיועדת לתוכנה הפתוחה בקוד הפתוח אייסי ומשתמשת גם בפונקציות ImageJ. הצינור הוא במחיר סביר ללא ידע בניתוח תמונה.

מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית

למדו ניתוח Immunofluorescence של גרגרי מתח בקשר לזיהומים חיידקיים בתאי יונקים. שיטה זו מאפשרת הערכה איכותית וכמותית של תגובות תאיות ללחצים חיצוניים ולפתוגנים.

ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

גלה סרטונים נוספים