ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים
3 ביולי 2017
אנו מתארים שיטה לניתוח כמותי וכמותי של גרגר גרגר הלחץ בתאי יונקים לאחר התאים מאותגרים עם חיידקים ומספר לחצים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מנת לחקור את התגובה גרגר הלחץ הסלולר במגוון רחב של אינטראקציות מארח חיידקי.
המטרה הכללית של ניסוי זה היא להעריך את ההשפעות של זיהום חיידקי על היכולת של תאי המאכסן להוות גרנולות תאב (stress granules) כמענה למעקה חיצוני. שיטה זו מהווה כלי בעל ערך בתחום המיקרוביולוגיה התאית להערכה אם פתוגן מסוים מסוגל לשנות או לעקוף את נתיב גרנולות התאב כולו. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח גרנולות תאב באופן איכותי וכמותי, בצורה קפדנית ואוטומטית, באמצעות תוכנות חינמיות לניתוח תמונות.
שיטה זו מספקת תובנה לגבי הדינמיקה של היווצרות גרנולות דחק (stress granules) והרכבן, וכיצד פרמטרים אלו מושפעים מפתוגן ספציפי. תודה. לפני תחילת האתגר, יש להחדיר מושבת חיידקי *S.flexneri* M90T אדומות מלוח tryptic soy agar עם 1% Congo red ששורטט לאחרונה, אל תוך מבחנה קונית בנפח 15 מיליליטר, המכילה שמונה מיליליטר של tryptic soy broth.
לאחר הידוק המכסה, הדגרו את המושבה למשך לילה עם ניעור ב-222 RPM ובטמפרטורה של 30 degrees Celsius. למחרת, בצעו תת-תרבית של 150 microliters מהחיידקים בתוך שמונה milliliters של tryptic soy broth טרי למשך כשעתיים ב-37 degrees Celsius ו-222 RPM, כדי להניע את ביטוי הגנים של העוצמה (virulence) בשלב אקספוננציאלי מאוחר ולהגביר את יכולת ההדבקה של החיידקים. כאשר הצפיפות האופטית (optical density) של תת-התרבית היא בין 0.6 ל-0.9, העבירו מיליליטר אחד של החיידקים לשפופרת של 1.5 milliliter לצורך איסופם באמצעות צנטריפוגה.
ששחקו שוב את המשקע במצע הדבקה בצפיפות אופטית של אחת. לאחר מכן, שאבו את העל-מclearfix (supernatants) מכל באר של תרבית תאי HeLa על זכוכית כיסוי. שטפו בזהירות את תאי ה-HeLa באמצעות 500 µL של מצע HeLa תרמי טרי בטמפרטורת החדר לכל באר.
החליפו את תמיסת השטיפה ב-500 µL של תווך הדבקה לכל באר, וסובבו את פלטת 24 הבארים בצנטריפוגה כדי להשקיע את החיידקים על התאים. העבירו את תרביות החיידקים השקועות למדגרה לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות כדי לאפשר את הדבקת תאי המאכסן. בתום הדגירה, הסירו את החיידקים החיצוניים מהתאים באמצעות שלושה שטיפות של 1 mL תווך תרבית HeLa טרי בטמפרטורה של 37 °C לכל שטיפה.
לאחר מכן, כסו את התאים המודבקים במיליליטר אחד של מצע גידול טרי המכיל gentamicin והחזירו את הצלחת לאינקובטור לתרבית תאים. בסיום הדגירה, החליפו את המצע ב-500 microliters של מצע הגידול המתאים, המועשר בגורם העקה (stressor) הרלוונטי, והחזירו את התאים לאינקובטור לתרבית רקמות. לאחר שעה אחת, שאבו את העלייה (supernatant) באופן מלא, וקבעו את הדגימות ב-0.5 milliliters של 4%paraformaldehyde ב-PBS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
בשלב הבא, יש להשליך את החומר המקבע למכל הפסולת המתאים, ולשטוף את הזכוכיות עם מיליליטר אחד של Tris-buffered saline למשך שתי דקות תוך ניעור עדין. בסיום השטיפה, יש לשאוב את ה-TBS לחלוטין ולהחדיר חומרים לתאים (permeabilization) בכל באר באמצעות 500 microliters של 0.3% Triton X-100 ב-TBS. לאחר 10 דקות, החליפו את תמיסת החדירה במיליליטר אחד של TBS, סובבו את הפלטה בעדינות, והחליפו את ה-TBS במיליליטר אחד של תמיסת חסימה (blocking solution) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
כדי לסמן את התאים באמצעות תערובת נוגדנים ראשוניים רצויה, טפטפו 50 µL של תערובת הנוגדנים הראשוניים לכל זכוכית כיסוי על גבי פיסת פראפילם (Parafilm) המודבקת היטב למשטח העבודה. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה כדי להרים את זכוכית הכיסוי הראשונה. טפיחו את קצה זכוכית הכיסוי על פיסת נייר סופג כדי להסיר את שאריות הנוזל.
הניחו בזהירות את לוחית הכיסוי על הטיפה והדגירו את לוחות הכיסוי תחת תנאי הסימון המתאימים. בסיום דגירת הסימון עם הנוגדן הראשוני, העבירו כל לוחית כיסוי לבאר נפרדת של פלטת 24 בארות חדשה המכילה 1 mL של TBS לכל באר, ושטפו את התאים בטמפרטורת החדר על מנער פלטות למשך חמש דקות, שלוש פעמים. לאחר השטיפה האחרונה, סמנו את התאים בכל לוחית כיסוי באמצעות תערובת קוקטייל הנוגדנים המשניים המתאימה, כפי שהודגם כעת.
הדגרימו את כיסויות הזכוכית בחושך למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. בסיום דגירת הסימון בנוגדן השני, שטפו את התאים ב-1 mL של PBS שלוש פעמים בלוח 24 בארות חדש תוך써 ניעור עדין כפי שהודגם, אך תוך הגנה מהאור. לאחר השטיפה האחרונה, טבלו את כל כיסוי בבדיוק קצר במים דה-יוניים להסרת המלח, ייבשו את קצוות הכיסויות בנייר סופג, והניחו בזהירות את הכיסויות על 5 µL של תמיסת קיבוע פלואורסצנטית לכל שקף מיקרוסקופ מזכוכית, ללא בועות.
לאחר מכן, אטמו את כיסית הזכוכית בעזרת לק. אחסנו את השקופיות כנדרש עד לביצוע הדימוג. כדי לדגם את התאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית, התחילו בבחירת העדשה המתאימה והערוצים הפלואורסצנטיים המתאימים לרכישת הדמויות.
לאחר מכן, רכשו מחסניות תמונות (image stacks) של התאים, באמצעות תוכנת הדימיון המתאימה. כאשר כל התמונות נלכדו, השתמשו בתוכנה המתאימה לניתוח תמונות כדי לכווץ את מחסניות התמונות ולשמור אותן כקבצי TIFF. בשלב הבא, טענו תמונת TIFF של ביקורת ותמונת TIFF ניסויית לפלטפורמת ניתוח התמונות, ובחרו ב-Lookup Table כדי לפתוח את פרמטרי הערוץ בחלון ה-Sequence.
לחצו על כל תיבות הסימון בלשונית הערוצים (channel tab) כדי לבטל את כל הערוצים. לאחר מכן לחצו על ערוץ אפס, ולחצו על פס הצבע של ערוץ אפס כדי לבחור את הצבע המועדף, תוך הגברת עוצמת הערוץ לפי הצורך כדי לה可ראות את כל המבנים. לאחר בחירה והתאמה של כל ערוצי הצבע המתאימים לאניליזה הניסויית, בחרו בלשונית הקנבס (canvas tab) והתאימו את לשונית הזום (zoom tab) כדי להציג כ-10 תאים לכל שדה ראייה.
בעזרת כלי הפוליגון, לחצו על התא הרלוונטי והמישיכו את הקו מסביב לתא כדי להגדיר את גבול התא. כדי להעניק שם לאזור עניין זה, בחלון אזורי העניין, לחצו לחיצה ימנית על התא הרלוונטי, ולחצו לחיצה כפולה על שם אזור העניין כדי לשנותו. לאחר בחירה ומתן שם לכל התאים הרלוונטיים באופן דומה, פתחו את אפליקציית ה-Spot Detector תחת לשונית הגילוי והמעקב (detection and tracking).
פתחו את לשונית ה-Pre Processing ובחרו את הערוץ לניתוח. בלשונית ה-Detector, בחרו ב-Detect bright spots over dark background ובחרו את קנה המידה והרגישות המתאימים. תחת לשונית ה-Region of Interest, בחרו את אזור העניין המוצע מתוך הרצף.
תחת לשונית Filtering, בחר NoFiltering. בלשונית Output, בחר את הפלט המתאים. בחר Remove previous spots rendered as regions of interest ולחץ על no file selected כדי לבחור את התיקייה לשמירת הקובץ.
לאחר מכן, תחת הלשונית Display, בחרו את האפשרויות הרלוונטיות המבוקשות ולחצו על Start Detection. בתוך התוכנה לניתוח הדמיות, ניתן להשתמש בגלאי הנקודות (spot detector) כדי לזהות את גרנולות העקה (stress granules) בתוך כל אחד מאזורי העניין שהוגדרו. לאחר מכן ניתן להפיק תמונה בינארית להצגת כל גרנולות העקה שזוהו.
ניתוח גרנולות דחק חייב להיות מותאם בקפידה לכל קבוצת גרנולות דחק הנבדקת. לדוגמה, שינוי בדרישות הגודל של אזור העניין (ROI) המזוהה, או שינוי ברגישות של פרמטרי הזיהוי, יובילו לתוצאות משתנות. במקשקול של גודל פיקסל גבוה יותר, גרנולות דחק קטנות יותר לא ייספרו, ומספר גרנולות הדחק יפחת.
בעוד שהעלאת הרגישות מובילה לעלייה במספר הגרנולות של הסטרס (stress granules). לדוגמה, בניסוי זה, קנה מידה של 2 עם רגישות של 100 הניב את התוצאה הטובה ביותר עבור הסמן G3BP1 לגרנולות סטרס. לעומת זאת, קנה מידה של 2 עם רגישות של 55 הניב את התוצאה הטובה ביותר עבור הסמן EIF3B לגרנולות סטרס.
ניתן לחשב את שטח הפנים על סמך גודלם של גרנולי הסטרס (stress granules). תרשימי התפלגות תדירויות שימושיים להדגשת שינויים בגודל גרנולי הסטרס בין אוכלוסיות תאים שונות. בנוסף, עצימות הפלואורסצנציה יכולה לספק מידע על איכות גרנולי הסטרס שנותחו.
ברגע שהשיטה נשלטת, ניתן לבצע את אתגר התא השלם בערך בשישה עד שבע שעות, ואת הניתוח ניתן להשלים בשעתיים עד שלוש שעות נוספות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לעבד תמיד את דגימות הביקורת ואת הדגימות הניסיוניות בו-זמנית ותחת אותם תנאים, כדי למזער את השונות בנתונים. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להרחיב את הניתוח לנפח תלת-ממדי כדי לקבל תובנות נוספות לגבי מיקום הגרנולות של הלחץ (stress granules).
פרוצדורה חצי-אוטומטית זו מאפשרת ניתוח קפדני ובלתי מושפע של גרנולות עקה (stress granules) בתאים לא מזוהמים ובתאים מזוהמים. היא עשויה לחשוף שיבושים שטרם היו ידועים במסלול של גרנולות העקה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו מזהמים תאים בחיידקים, כיצד להשרות היווצרות של גרנולות עקה, וכיצד להשתמש בגישה חצי-אוטומטית לניתוח גרנולות עקה באופן איכותני וכמותי.
ואל תשכחו כי עבודה עם *Shigella flexneri* וחומרים המשרים גרנולות של עקה (stress granules) כגון clotrimazole עלולה להיות מסוכנת, וכי נדרשים אמצעי זהירות כגון חבישת כפפות, עבודה במעבדת BL2 וסילוק נאות של כל הרכיבים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה לניתוח היווצרות של גרנולות דחק (stress granules) בתאי יונקים בתגובה לחשיפה לחיידקים ולסוגים שונים של עקה. הפרוטוקול רלוונטי לחקירת תגובות תאיות באינטראקציות בין מאחס לחיידקים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרוביולוגיה תאית
- מנגנוני תגובה למעמדה (Stress Response)
- אינטראקציות מאח-פתוגן
רקע
- גרנולות דחק (Stress granules) הן אגרגטים ציטופלזמיים הנוצרים בתגובה לדחק.
- הבנת תהליך היווצרותם חיונית להשגת תובנות לגבי תגובות למעקה תאי.
- זיהומים חיידקיים יכולים להשפיע על מסלול הגרנולות של העקה (stress granules).
- מחקר זה מספק שיטה לניתוח כמותי של השפעות אלו.
מטרת המחקר
- להערכת ההשפעה של זיהומים חיידקיים על היווצרות גרנולות דחק (stress granules).
- לקביעה האם פתוגנים יכולים לשנות את התגובה של גרנולות הדחק.
- לספק שיטה קפדנית לניתוח הדינמיקה של גרנולות דחק.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדבקת חיידקי S.flexneri M90T לתוך מצע גידול.
- ניתוח איכותני וכמותי של גרנולות דחק (stress granules).
- שימוש בתוכנות חינמיות לניתוח תמונות לצורך ניתוח נתונים.
- הערכת הדינמיקה של גרנולות דחק בתגובה לאתגרים בקטריאליים.
תוצאות עיקריות
- השיטה מאפשרת ניתוח אוטומטי של היווצרות גרנולות עקה (stress granules).
- תובנות לגבי האופן שבו פתוגנים ספציפיים משפיעים על הדינמיקה של גרנולות עקה.
- הדגמה של תועלת הפרוטוקול במחקרים של מיקרוביולוגיה תאית.
- אספקת מסגרת למחקרים עתידיים על אינטראקציות בין מאחס לפתוגן.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל לחקר תגובות של גרנולות דחק (stress granules) בתאי יונקים.
- הוא משפר את ההבנה של התגובה התאית לזיהומים חיידקיים.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על שיטה זו כדי לבחון פתוגנים שונים.
שאלות נשאלות שכיחות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכת שינויים בהיווצרות גרנולות לחץ (stress granules) במארח שנגרמו על ידי פתוגנים מספקת תובנה מכניסטית לגבי האופן שבו חיידקים מעקפים תגובות לחץ תאיות, שיקול מרכזי בתיקוף של מטרות אנטימיקרוביאליות. דימות כמותי של דינמיקת גרנולות לחץ מאפשר השוואה אובייקטיבית בין תנאי זיהום לתנאי ביקורת, ובכך תומך בהחלטות go/no-go מבוססות נתונים בשלבי הגילוי המוקדמים. גישה זו תורמת לביטחון בחיזוי על ידי קישור תגובות לחץ פנוטיפיות למנגנוני virulent של הפתוגן.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן האם פתוגן יכול לשנות את מסלול גרגרי העקה (stress granules), ובכך מסייע בבחירת מטרות לאסטרטגיות אנטי-וירולנטיות.
- ערך תפעולי: מאפשר כימות סטנדרטי ואוטומטי של היווצרות גרגרי עקה באמצעות כלי ניתוח תמונות בקוד פתוח.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי חשיפת האופן שבו פתוגנים מווסתים תגובות עקה של המארח שעשויות להשפיע על סיגנלינג במורד המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות תאיים שעברו תיקוף לסריקת תרכובות המווסתות את היווצרות גרנולות הלחץ (stress granules) בהקשר של זיהום.
- ערך תפעולי: שימוש בפרמטרי זיהוי נקודות (קנה מידה ורגישות) כדי להפיק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של מספר וגודל גרנולות הלחץ.
- מוכנות הבדיקה: מאפשר השוואה ברמת ביטחון גבוהה של דינמיקת גרנולות הלחץ בין תנאים ניסיוניים שונים באמצעות מדדי עוצמת פלואורסצנציה והתפלגות תדירויות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מקשרת בין פנוטיפים של גרנולות סטרס (stress granules) במערכות in vitro לרלוונטיות פוטנציאלית in vivo באינטראקציות בין מאחס לפתוגן.
- קידום מותאם סיכון: מספקת נתונים פנוטיפיים לצורך תעדוף תרכובות המשקמות או מווסתות את היווצרות גרנולות הסטרס שהופרה על ידי פתוגנים.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתמקדת בהרכב ובמיקום של גרנולות הסטרס כביומארקרים לתקינות המסלול תחת אתגר זיהומי.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), כאשר היווצרות גרנולות של עקה (stress granules) משמשת כקריאה פנוטיפית של מודולציה של המסלול על ידי פתוגנים או מועמדים טיפוליים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי השאלה האם אפקטורים חיידקיים מפריעים להרכבה או לפירוק של גרנולות לחץ (stress granules).
- סריקה: מספק פלטים כמותיים (מספר גרנולות לחץ, התפלגות גדלים, עוצמת פלואורסצנציה) לצורך אישור פגיעות (hits) ומחקרי קשר מבנה-פעילות.
- אנליטיקה: מייצר תמונות בינאריות וגרפי התפלגות שכיחויות המאפשרים השוואה סטטיסטית של אוכלוסיות גרנולות לחץ בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין הדינמיקה של גרנולות לחץ לתגובות לחץ תאיות רחבות יותר הרלוונטיות למודלים של מחלות זיהומיות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה סטנדרטית וחלקית-אוטומטית, הישמה על פני פתוגנים וגורמי עקה מרובים בסריקה של חומרים אנטימיקרוביאליים המכוונים למארח.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות באופן שבו פתוגנים משפיעים על מסלולי גרנולות הלחץ של המארח.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזור באמצעות תנאי קיבוע, חדירה (permeabilization), חסימה ודימות סטנדרטיים בדגימות ביקורת ובדגימות ניסוייות.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של תרכובות המשפיעות על המסלול לפני השקעה פרה-קלינית יקרה.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם-סיכון של פגיעות (hits) המדגימות הצלה של היווצרות גרנולות לחץ בתאים נגועים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתרבית חיידקים, הדבקת תאי יונקים וסימון אימונופלואורסצנטי.
- תלוי במיקרוסקופיית קונפוקלית פלואורסצנטית ובפלטפורמות ניתוח תמונות בקוד פתוח (למשל, ICY) בעלות יכולות זיהוי נקודות.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי רכישת תמונות (זום, הגדרות ערוצים) וספי ניתוח (קנה מידה, רגישות) עבור כל סמן של גרנולות הסטרס.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה על סוגי תאים, פתוגנים או משרהי סטרס שונים מעבר ל-Shigella flexneri ו-clotrimazole.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך באופטימיזציה של פרמטרי הזיהוי (קנה מידה, רגישות) לכל סמן, שכן קני מידה גבוהים יותר עלולים להחמיץ גרנולות קטנות ורגישות מוגברת עלולה להעלות את מספר התוצאות החיוביות השגויות.
