ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את ההשפעות של זיהום חיידקי על יכולתם של תאים מארחים ליצור גרגירי לחץ כדי להגיב ללחץ אקסוגני. שיטה זו היא כלי רב ערך בתחום המיקרוביולוגיה התאית להערכת האם פתוגן נתון מסוגל לשנות או לחתור תחת כל מסלול גרגירי הלחץ. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנתח גרגירי מתח באופן איכותי וכמותי בצורה קפדנית ואוטומטית באמצעות תוכנות ניתוח תמונות בחינם.

שיטות אלה מספקות תובנה לגבי הדינמיקה של היווצרות והרכב גרגירי הלחץ וכיצד פרמטרים אלה מושפעים מפתוגן ספציפי. תודה. לפני שתתחיל באתגר, חסנו מושבת חיידקים S.flexneri M90T אדומה מצלחת אגר סויה טריפטית 1% קונגו אדום לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר, המכיל שמונה מיליליטר מרק סויה טריפטי.

לאחר הידוק המכסה, דגרו את המושבה למשך הלילה עם ניעור ב -222 סל"ד ו -30 מעלות צלזיוס. למחרת, תת-תרבית של 150 מיקרוליטר של החיידקים בשמונה מיליליטר של מרק סויה טריפטי טרי למשך כשעתיים ב-37 מעלות צלזיוס ו-222 סל"ד כדי ליזום אינדוקציה מאוחרת של שלב אקספוננציאלי של ביטוי גנים אלימים וכדי לשפר את יכולת ההדבקה של החיידקים. כאשר הצפיפות האופטית של תת-התרבות היא בין 0.6 ל-0.9, העבירו מיליליטר אחד של החיידקים לצינור של 1.5 מיליליטר לאיסוף שלהם על ידי צנטריפוגה.

ולהשעות מחדש את הגלולה במדיום זיהום בצפיפות אופטית של אחד. לאחר מכן, שאפו את הסופרנטנטים מכל באר של תרבית כיסוי תאי HeLa. ושטפו בזהירות את תאי הלה עם 500 מיקרוליטר של מדיום תאי HeLa טרי בטמפרטורת החדר לכל באר.

החלף את הכביסה ב-500 מיקרוליטר של מדיום זיהום לכל באר, וצנטריפוגה את צלחת 24 הבארות כדי לסובב את החיידקים לתאים. העבירו את תרבויות החיידקים המיושבות לאינקובטור תרבית רקמה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי להקל על זיהום התא המארח. בתום הדגירה יש להסיר את החיידקים האקסוגניים מהתאים בשלוש שטיפות במיליליטר אחד של מדיום תרבית HeLa טרי של 37 מעלות צלזיוס לכל שטיפה.

לאחר מכן מכסים את התאים הנגועים במיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי המכיל גנטמיצין ומחזירים את הצלחת לחממת תרבית התאים. בתום הדגירה, החלף את המדיום ב -500 מיקרוליטר של מדיום התרבות המתאים, בתוספת גורם הלחץ המעניין, והחזיר את התאים לחממת תרבית הרקמות. לאחר שעה, שאפו את הסופרנטנט לחלוטין, וקבעו את הדגימות ב-0.5 מיליליטר של טמפרטורת החדר 4% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 30 דקות.

לאחר מכן, השליכו את הקיבוע למיכל הפסולת המתאים, ושטפו את הכיסויים במיליליטר אחד של מי מלח עם טריס למשך שתי דקות בניעור עדין. בתום הכביסה יש לשאוב לחלוטין את ה- TBS ולחלחל את התאים בכל באר עם 500 מיקרוליטר של 0.3% Triton X-100 ב- TBS. לאחר 10 דקות, החלף את תמיסת החדירה במיליליטר אחד של TBS, סובב את הצלחת בעדינות והחלף את ה- TBS במיליליטר אחד של תמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר.

כדי לתייג את התאים עם קוקטייל נוגדנים ראשוני מעניין, הבחין ב-50 מיקרוליטר של תערובת הנוגדנים העיקרית בכל כיסויהחלקה על פיסת פרפילם מפלסטיק המודבקת היטב על משטח הספסל. לאחר מכן השתמש בפינצטה כדי להרים את הכיסוי הראשון. וטפחו את קצה הכיסוי על פיסת נייר טישו כדי להסיר את עודפי הנוזלים.

הנח בזהירות את הכיסוי על הטיפה ודגר את הכיסוי בתנאי התיוג המתאימים. בתום הדגירה העיקרית של תיוג הנוגדנים, העבירו כל כיסוי לבאר בודדת של צלחת חדשה של 24 בארות המכילה מיליליטר אחד של TBS לבאר, ושטפו את התאים בטמפרטורת החדר על שייקר צלחת למשך חמש דקות שלוש פעמים. לאחר הכביסה האחרונה, סמן את התאים על כל כיסוי בתערובת קוקטייל הנוגדנים המשנית המתאימה, כפי שהודגם זה עתה.

ודגרו את הכיסויים בחושך למשך שעה בטמפרטורת החדר. בתום הדגירה המשנית של תיוג הנוגדנים, שטפו את התאים במיליליטר אחד של PBS שלוש פעמים בצלחת חדשה של 24 בארות עם ניעור עדין כפי שהודגם זה עתה, אך מוגנת מפני אור. לאחר הכביסה האחרונה, טבלו בקצרה כל כיסוי במים נטולי יונים כדי להסיר את המלח, טפחו את קצוות הכיסוי על רקמה, והרכיבו בזהירות את הכיסוי על חמישה מיקרוליטר של מדיום הרכבה פלואורסצנטי לכל שקופית מיקרוסקופ זכוכית ללא בועות.

ואז אטום את הכיסוי עם לק. ואחסן את השקופיות לפי הצורך עד להדמיה. כדי לדמות את התאים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית, התחל בבחירת המטרה המתאימה וערוצי הפלואורסצנט המתאימים לרכישת תמונה.

לאחר מכן רכוש ערימות תמונות של התאים, באמצעות תוכנת ההדמיה המתאימה. לאחר שכל התמונות נלכדו, השתמש בתוכנת ניתוח ההדמיה המתאימה כדי לכווץ את ערימות התמונות ולשמור את האוספים כקובצי TIFF. לאחר מכן, טען פקד ותמונת TIFF ניסיונית לפלטפורמת ניתוח התמונות ובחר טבלת בדיקת מידע כדי לפתוח את פרמטרי הערוץ בחלון רצף.

לחץ על כל תיבות הסימון של כרטיסיית הערוצים כדי להשבית את כל הערוצים. לאחר מכן לחצו על ערוץ אפס, ולחצו על סרגל הצבע של ערוץ אפס כדי לבחור את הצבע המועדף, ולהגדיל את עוצמת הערוץ בהתאם לצורך להמחשת כל המבנים. לאחר בחירה והתאמה של כל אחד מערוצי הצבע המתאימים לניתוח הניסיוני, בחר את כרטיסיית בד הציור והתאם את כרטיסיית גודל התצוגה כדי להציג באופן חזותי כ- 10 תאים לכל שדה תצוגה.

בעזרת כלי המצולע, לחץ על התא המעניין והאריך את הקו סביב התא כדי לתחום את גבול התא. כדי לתת שם לאזור עניין זה, בחלון אזור העניין, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על התא המעניין ולחץ פעמיים על שם אזור העניין כדי לשנות אותו. לאחר בחירה ומתן שמות לכל התאים המעניינים באותו אופן, פתח את אפליקציית Spot Detector בכרטיסיית הזיהוי והמעקב.

פתח את הכרטיסייה Pre Processing ובחר את הערוץ לניתוח. בכרטיסייה גלאי, בחר זהה נקודות בהירות על רקע כהה ובחר את קנה המידה והרגישות המתאימים. תחת הכרטיסיה אזור עניין, בחר את אזור העניין המוצע מהרצף.

תחת הכרטיסיה סינון, בחר ללא סינון. בכרטיסייה פלט, בחר את הפלט המתאים. בחרו 'הסר נקודות קודמות שעובדו כאזורי עניין' ולחצו על 'לא נבחר קובץ' לבחירת התיקייה לשמירת הקובץ.

לאחר מכן, תחת הכרטיסייה תצוגה, בחר את האפשרויות המתאימות המעניינות ולחץ על התחל זיהוי. בתוך תוכנת ניתוח ההדמיה, ניתן להשתמש בגלאי הספוט כדי לזהות את גרגירי המתח בכל אחד מאזורי העניין המיועדים. לאחר מכן ניתן ליצור תמונה בינארית כדי להציג את כל גרגירי הלחץ שזוהו.

ניתוח גרגירי מתח חייב להיות מותאם בקפידה לכל שוק גרגירי מתח שנותח. לדוגמה, שינוי דרישת הגודל של אזור העניין שזוהה, או שינוי הרגישות של פרמטרי הזיהוי מובילים לתוצאות משתנות. בסולמות גדולים יותר של פיקסלים, גרגירי מתח קטנים יותר לא ייספרו, ומספר גרגירי הלחץ יקטן.

בעוד הגדלת הרגישות מביאה לעלייה במספר גרגירי הלחץ. לדוגמה, בניסוי זה, סולם של שניים עם רגישות של 100 נתן את התוצאה הטובה ביותר מסמן גרגיר המתח G3BP1. בעוד שסולם של שניים עם רגישות של 55 נתן את התוצאה הטובה ביותר עבור סמן גרגיר המתח EIF3B.

לאחר מכן ניתן לחשב את שטח הפנים מגודל גרגירי הלחץ. תרשימי התפלגות תדרים שימושיים להדגשת שינויים בגודל גרגירי הלחץ בין אוכלוסיות תאים שונות. בנוסף, עוצמת הקרינה יכולה לספק מידע על איכות גרגירי הלחץ שנותחו.

לאחר השליטה, ניתן לבצע את כל אתגר התא תוך כשש עד שבע שעות, וניתן להשלים את הניתוח תוך שעתיים-שלוש נוספות. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור תמיד לעבד את הבקרה ואת דגימות הניסוי בו-זמנית ובאותם תנאים כדי למזער את השונות בתוך הנתונים. בעקבות הליך זה, ניתן להרחיב את הניתוח גם לנפח תלת מימדי כדי לקבל תובנות נוספות לגבי לוקליזציה של גרגירי לחץ.

הליך חצי אוטומטי זה מאפשר ניתוח קפדני וחסר פניות של גרגירי מתח בתאים לא נגועים ונגועים. זה יכול לחשוף חתרנות שלא הייתה ידועה בעבר של מסלול גרגירי הלחץ. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להדביק תאים בחיידקים, כיצד לגרום להיווצרות גרגירי מתח וכיצד להשתמש בגישה חצי אוטומטית לניתוח גרגירי לחץ בצורה איכותית וכמותית.

ואל תשכח שעם שיגלה פלקסנרי וגרגירי מתח חומרים מעוררי גרגירים כמו קלוטרימזול יכולים להיות מסוכנים, וכי אמצעי זהירות כמו לבישת כפפות, עבודה במעבדת BL2 והשלכה נכונה של כל הריאגנטים נחוצים.