Name: ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: למד ניתוח מולקולה בודדת של חיבורים בין-שרשרתיים ב-DNA באמצעות לייזר ממוקד לחקר תגובות תאיות לנזקי DNA. שיטה זו מאפשרת הדמיה ישירה של פגיעות גנומיות ומסייעת להבנת מנגנוני תיקון DNA בחקר מולקולרי מתקדם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן בחלקו על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון הלאומי להזדקנות (Z01 AG000746-08) וקרן מחקר אנמיה Fanconi.

1. הכנת Dig-TMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 50 מ&quot;ג (0.18 mmoles) של 4&#39;-chloromethyl-4,5&#39; , 8-trimethylpsoralen ו 590 מ&quot;ג (2.7 mmoles) של 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-אמין ב סבב 25 מ&quot;ל יבש בקבוק -bottom תחת חנקן. להוסיף 10 מ&quot;ל טולואן ריפלוקס עבור 12 h. הסר ממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את השאריות ידי כרומטוגרפיה בעמודה פלאש מעל ג&#39;ל סיליקה. Elute הטור עם כלורופורם, מתנול, פתרון אמוניה 28% (9: 1: 0.5). לאדות את הממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת, וכן לשחזר את טהור 4 &#39;- [N- (13-אמינו-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen כמו צהוב חיוור צמיג נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 5.5 מ&quot;ג (0.012 mmoles) של 4 &#39;- [N- (13-אמינו-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen עם 5 מ&quot;ג (0.008 mmoles) של אסתר NHS digoxigenin ב בקבוק מסביב לתחתית יבש תחת חנקן. להוסיף 0.5 לפוראמיד דימתיל נטול מ&quot;ל (DMF) עלד 3.4 μL של trimethylamine ומערבבים על 50 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את שאריות בסכום מינימום של dichloromethane. החל את פתרון 2 נקודות μL אופקית לאורך החלק התחתון של צלחת שכבה דקה ההכנה עם ג&#39;ל סיליקה כשלב נייח. הפעל את TLC ההכנה כלורופורם: מתנול: אמוניום הידרוקסיד 28% (8: 1: 0.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסוות את הצלחת להוציא את הקצוות האנכיים ולזהות את הלהקה של המוצר עם מנורה ננומטר 254 UV באורך גל קצר. גרד את המוצר מהצלחת עם מרית לבודד את המוצר הטהור באמצעות כלורופורם: מתנול: אמוניום הידרוקסיד 28% (8: 1: 0.1) תערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר ממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת. ממיסים את כדורי שיורית 1 מ&quot;ל של 50% EtOH: H 2 O, לוותר לתוך 50 aliquots μL ב 1.5 מ&quot;ל צינורות (~ 20 aliquots) ויבש המאייד צנטריפוגלי עד שכל הממס הוא התאדה (~ 3 h). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">Redissolve כל aliquot ב 200 μL של 50% EtOH: H 2 O ויבש שוב המאייד צנטריפוגלי. ממיסים כל aliquot שוב 200 μL של 50% EtOH: H 2 O, יבש בתוך כדורי המאייד וחנות צנטריפוגלי ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש, לפזר את הגלולה ב 50 μL של EtOH 50%: H 2 O. כן 1: דילול 100 של Dig-TMP מומס H 2 O ולמדוד OD ב 250 ננומטר. מקדם הכחדה של Dig-TMP הוא 25,000. הפתרון הוא יציב במשך חודש על אותם אם הם נמצאים -20 ° C. בדוק את הריכוז ידי מדידת OD ב 250 ננומטר לפני כל שימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ריכוז המניות: ABS x 100 x10 6 / 25,000 = ריכוז (ב מיקרומטר). בדרך כלל פתרון המניות הוא כ 3 מ&quot;מ. חשוב להיות בטווח זה על מנת למזער את היקף EtOH מתווסף בינוני. </li></ol></li></ol> 2. לייזר מותאם למקום Dig-TMP ICLs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלוקליזציה לייזר rform עם מיקרוסקופ confocal עם לייזר חנקן SRS (337 ננומטר) נשאבים באמצעות תא צבע פולטות קו של 365 ננומטר ו ירי 3 פולסים NS ב 10 הרץ, עם כוח של 0.7 NW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך סימן אנכי בצד של זכוכית 35 מ&quot;מ תחתי צלחת תרבית תאים עם עט סימון. גרד צלב במרכז הזכוכית על פני השטח בתרבות עם עט יהלום כזה פס שחור בצד של המנה הוא בראש זרוע אחת של הצלב. הצלב הוא מסומן על פני שטח הצמיחה של הזכוכית כך והתאים יהיו באותו מישור המוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הצלחת לאחר סימון עם שטיפה של 70% EtOH. ניקוי לפני ציפוי התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פלייט (זני מעבדה סטנדרטיים כגון הלה או U2OS) ב cross המסומנים מנות תרבות אחת או ימים לפני. תא צריך להיות חלוקה פעילה 50-70% ומחוברים ביום הניסוי. דגירה 24 שעות עם 1 מיקרומטר 5-כלורו-2-deoxyuridine (CldU) ל- DNA תווית באופן אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהוֹסִיףDig-TMP ב EtOH 50%: H 2 O ל תרבית תאים בינוניים לריכוז סופי של 20 מיקרומטר. תביא את המדיום כדי 37 מעלות צלזיוס. שינוי המדיום מעל התאים ומכניסים אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור 30 דקות כדי לאפשר Dig-TMP כדי לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התאים דוגרים, להקים את x / y של שדה ראייה שבה הליזר פעיל. בצע את הליך הכיול של היצרן שבו הלייזר מכוון על ידי תוכנה כדי לחרוט שקופית זכוכית מראות לאורך קו אופקי אלכסוני. שתי השורות להגדיר את גבולות התחום שבו הלייזר יכול להכות מטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת בתא הסביבתי, ב 37 מעלות צלזיוס עם נשלט CO 2 ולחות, על במת מיקרוסקופ ולהתמקד במטרת שמן 60X על ההצטלבות של הצלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את קרן לייזר 365 ננומטר ל ROI, הוקמה על ידי החוקר עם כלי הצורה בתוכנה, כדי ליצור פס של 3 &amp;# 181; MX 0.6 מיקרומטר. המתווה של ROI מושמת על ידי סמן גרעינים של תאים הממוקמים בסביבה הקרובה של ההצטלבות של הצלב. התאם את המטוס z מוקד למקד את מידוויי לייזר דרך הגרעין. השתמש בלייזר בטווח של 350-370 ננומטר. 405 nm לייזרים לא יכול לגרום crosslinks 19. הערה: אנו לאתר את ההחזר על ההשקעה באזורים nucleoplasmic מחוץ nucleoli, אשר ניתן להבחין בין nucleoplasm בניגוד התערבות ההפרש (DIC) הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המיקוד ואת הפעילות של הלייזר על ידי הגדלת ההספק לרמה מספיקה כדי למחוק תא (תא תחשיך ואז נעלמים). זהו אבחון חשוב עבור נתיב האור הפרעה עבור לייזר באמצעות מיקרוסקופ ואז דרך coverslip ו לתוך התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הגדרת הכוח מספיק כדי להפעיל את psoralen ואת DDR המושרה כיל (זו צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל לייזר / מיקרופוןroscope שילוב). השתמש עוצמת הלייזר הגדרת (1.7% כאן) כי אינו להפעיל את DDR בהעדר psoralen (פיקוח על ידי היווצרות של γ-H2AX). הערה: זוהי קביעה חשובה ואת ההגדרות עשויות לדרוש התאמה אם מקור הליזר או רכיב בנתיב האור משתנה. בצע את ההצטברות של GFP מתויגת חלבוני תיקון כגון XPC או FAN1, אשר שניהם גייסו במהירות (תוך שניות) אל פסי psoralen ליזר, אבל לא לרועי חשופי הליזר לבד. חלבונים מסוימים של DDR להופיע בתוך שניות, תוך דקות אחדות עשויות להידרש ואחרים. יש צורך לבצע קביעות כמובן זמן עבור כל חלבון של עניין. נציין כי בתאים שלא נחשפו לייזר אין פסים של חלבונים להגיב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל מתאים בשדה היה ממוקד מהלך הצליחו לתחום חדש, להישאר קרוב לצומת של הצלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים שנועדו determine חלוקת מרחקי נגע שאר לחשוף תאים אל הליזר ב 20-25 שדות (4-5 תאים / שדה) סביב הצומת. על מנת לנתח דפוסים שכפולים בסביבה של ICLs המקומי לדגור תאים עם 10 מיקרומטר 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) לאחר ירי ליזר. הערה: זמן דגירה עם IdU היא שרירותית. השתמשנו קצר ככל 20 דקות וכל עוד 60 דק &#39;(ראה להלן). פולסים ארוכים יותר (כמה שעות) לעתים לגרום שטחים שכפולים מרובים התגבשו, ובכך לאבד את הזדמנות תמונת התקדמות מזלגות חד. בניסויים מסוימים CES מסומנים עם CldU עבור 24 שעות כדי אחיד DNA התווית לפני חשיפה לחפור-TMP ואחריו תיוג הדופק של שטחים שכפול. </li></ol> קציר 3. תאים ומתיחה של סיבי DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת מן הבמה, להסיר את המדיום, ולשטוף עם בופר פוספט (PBS). הסר את פתרון PBS. מניחים ירידה 10 μL של טריפסין מסחרי/ פתרון EDTA על ההצטלבות של הצלב באמצע משטח הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 3-4 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולאחר מכן לצייר את הפתרון טריפסין עם תאים מנותקים לתוך קצה pipet. אין צורך לנטרל את טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את טיפת טריפסין / EDTA עם תאים בקצה אחד של המיקרוסקופ שקופית זכוכית silanized. Lyse את התאים לשחרר את ה- DNA על ידי תוספת של 10 μL של פתרון 0.5% SDS דגירה במשך 3-4 דקות ב RT ערבוב בעדינות עם קצה pipet, המאפשר בפריפריה של הבריכה לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את השקופית 20º ולאפשר את הנוזל לרוץ עד הסוף. סיבי DNA מורחבים / נמתחו על ידי הכוחות הידרודינמית של הנוזל זורם. תנו אוויר יבש מגלשות (~ 10 דקות) ולתקן ב 3: 1 מתנול / חומצה אצטית עבור 10 דקות. הסר את השקופיות מפתרון לתקן ואוויר יבש שוב. בשלב זה הם יכולים להיות מאוחסנים ללא הגבלת זמן ב 70% EtOH ב -20 מעלות צלזיוס. על הסרה מן EtOH 70% ולאפשר לאוויר יבש לפני neצעד XT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות PBS, ולאחר מכן לפגל ב 2.5 M HCl עבור 1 ש &#39;ב RT. טיפול זה depurinates DNA שהופך את nucleobases הלוגנים משולב נגישה נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל שקופיות 0.4 M Tris-HCl, 7.4 pH. פעמיים לשטוף ב PBS / 0.5% Tween-20 (PBST) במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק מחליק עם 5% שור סרום אלבומין (BSA) ו 10% בסרום עיזים ב PBS. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm להפיץ את הפתרון חוסם באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה של 1 ש &#39;ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 100 μL של 1: 200 דילול פתרון חסימה של האנטי-bromodeoxyuridine חולדה (במיוחד מזהה CldU) נוגדן ראשוני לכל שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm להפיץ את דילול באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה בתא humidified עבור 1 ש &#39;ב RT. הסר את parafilm לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 100 μL של מדולל (1: 100) עז נגד עכברוש אלקסה פלואוריד 647 בחסימת פתרון לכל שקופית. תכסה אתמחליק בעדינות עם parafilm ו דגירה של 45 דקות ב RT. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 100 μL של דילול (01:40) עכבר bromodeoxyuridine אנטי (מזהה ldU ו CldU זה סגוליות כפול מצריך חסימת CldU ידי BrdU אנטי עכברוש הדגירה לפני.) נוגדן ראשוני ארנב אנטי DIG נוגדן (1: 200 ) בחסימת פתרון לכל שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm ו דגירה בתא humidified עבור 1 ש &#39;ב RT. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 100 μL של מדולל (1: 100) עז נגד העכבר Alexa פלואוריד 488 andc (1: 5000) בדיקה נגד ארנב עיזים (למשל, Qdot 655) בחסימת פתרון לכל שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm ו דגירה של 45 דקות ב RT. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנני PBST העודף על גבי מגבת נייר. להוסיף 50 μL של antifade הרכבה בינונית על כל שקופית ומכסים coverslip. תמונה או חנותלא יותר מ 48 שעות ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. הדמיה סיבים ידי הקרינה מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע רכישת התמונה דרך אובייקטיבית 63X על מיקרוסקופ הפוכה עם גלגל מסנן ממונע המצורפת במלואה עם FITC, Cy5 ו- Q Dot 655 זיהוי. מסנן העירור הוא 425 ננומטר, ואת מסנן הפליטה הוא 655 ננומטר עם 20 ננומטר מרוכזים בשיא הפליטה 20. </li></ol>

<ol><li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+%28Nobel+Lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li>
<li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%3A+three+levels+of+DNA+repair+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272(2013).</li>
<li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li>
<li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li>
<li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+DNA+double-strand+breaks%3A+production%2C+fidelity+of+repair%2C+and+induction+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li>
<li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+dose-rate+effects%2C+endogenous+DNA+damage%2C+and+signaling+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li>
<li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+of+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li>
<li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts%3A+their+role+in+carcinogenesis%2C+epidemiology%2C+and+risk+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li>
<li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs%3A+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li>
<li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li>
<li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li>
<li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li>
<li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li>
<li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li>
<li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255(2011).</li>
<li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li>
<li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+translocase+FANCM%2FMHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84(2016).</li>
<li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+damage+response%3A+making+it+safe+to+play+with+knives%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li>
<li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+%286-4%29+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li>
<li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA%3A+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li>
<li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li>
</ol>

החוקרים אין לחשוף.

הטכנולוגיה לוקליזציה לייזר מחייב שימוש בתאי חסיד עם גרעינים הנראים מיקרוסקופ שדה בהיר. ניסינו לצרף תאי nonadherent, כגון לימפוציטים עיקרי, או תאים בתרבית חסיד רופף כמו AD293, אל משטח הזכוכית עם הכנות דבקות תא כגון polylysine או קולגן, או תערובות מורכבות יותר. למרות טיפולים אלה עשויים להיקשר לתאים פני השטח, אנו מוצאים כי הם נשארים בדרך כלל מעוגלים מה שהופך אותו מאוד קשה להתמקד לתוך הגרעינים. יתר על כן, התאים לעיתים קרובות אינם מצליחים לשרוד את שטיפת הראשונית לאחר הסרת מדיום הגידול....

DNA נמצאת תחת מתקפה מתמדת מצד סוכנים חיצוניים כגון קרינה, אור אולטרה סגול, רעלים סביבתיים, תוצרי בעירה, וכו &#39;בנוסף, הוא תקף גם על ידי מינים רדיקליים אנדוגניים מיוצרים על ידי מטבוליזם חמצונים. לכל אלה פוטנציאל כימי או פיזי לשבש את תקינות DNA 1. הפרעות בגנום יכול להפעיל את תגובת נזק לדנ&quot;א (DDR), גיוס ומתפזרות שינוי פוסט translational עם מאות, אם לא אלפי, של חלבונים מיקרו-רנ&quot;א מעורב תיקון הנגע, הסדרת מחזור התא, אפופטוזיס, הזדקנות, והמסלולים דלקתיות 2. רוב המידע שלנו לגבי DDR מגיע ממחקרים עם DSBs. זהו במידה רבה בשל הזמינות של טכנולוגיות מציגים הפסקות, כוללים רצף הפסקות ספציפיות, ב DNA הגנומי בתאים חיים 3. בנוסף, propensity של הפסקות לגרום מוקדים של חלבונים DDR, אשר יכול להיות מוצג על ידי immunofluorescence, עזר לי מאוד לזיהוי קינטיקה והדרישות של חלבונים להגיב. אחת מהטכנולוגיות מפתח ללימוד DDR הוצג על ידי בונר ועמיתיו, שהשתמשו קרן לייזר לכוון פס של DSBs בתוך &quot;אזור של אינטרס&quot; (ROI) האצור בגרעיני התאים החיים 4. למעשה, הם יצרו מוקד ארוך, שבו חלבונים של DDR יכולים להיות מזוהים על ידי immunofluorescence. הדבר הומחש על ידי ההפגנה שלהם של הפס החזק של H2AX היסטון פוספורילציה (γ-H2AX) בתאים שנחשפו הליזר. מאז, הגישה לייזר כבר המועסקים מחקרים רבים של DDR המושרה על ידי DSBs. למרות חזק ופופולרי, ואת המקור של תמונות immunofluorescence דרמטיות, יש לציין כי ברוב הניסויים עוצמי הליזר מותאם על מנת לייצר תוצאות נצפות, בלי דאגת זהות נגע,צפיפות, או ריווח. ואכן, זה יכול להיות קשה לבצע אומדנים אלה. לכן הם התעלמו במידה רבה, למרות ריבוי הנגעים הציגו לתוך ה- DNA על ידי לייזרים 5. זה תורם סתירות רבות בספרות 6. בניגוד DSBs, השינויים הכימיים ביותר של דנ&quot;א לא לעורר היווצרות מוקדים הנפרדים של חלבוני DDR. זה חשוב לאור ההבנה הנוכחית שלנו של תדרי נגע. ההערכה היא כי תאי האדם בתרבות נגרמו רבים ככל 50 DSBs לכל מחזור התא, נוצר ברובו במהלך S שלב 7, 8, 9. פחות נוצרים בתאים שאינם מתרבים. זאת בניגוד מספר הפסדים nucleobase או אירועים שינוי, אשר נמצאים עשרות אלפי לכל תא / יום 1, 10. לפיכך, אנו יודעים הכימהרפובליקה מושרה על ידי אירועים נדירים יחסית, והרבה פחות על אלה המושרים על ידי נגעים מעוותי סליל, אשר במצטבר שכיח הרבה יותר. על מנת לענות על שאלות לגבי תגובת התאים קוולנטיים שינויים של DNA גנומי, רצינו לעבוד עם adduct DNA מעוותת Helix שיש פעילות אינדוקציה DDR הטבועה. יתר על כן, כדי להקל על עיצוב ניסיוני ופרשנות היינו מעוניינים מבנה המבוא אשר יכול להיות נשלט ביחס לזמן והיה מקובל ויזואליזציה. בהתאם לכך, פיתחנו אסטרטגיה המבוססת על psoralen. Psoralens גם מאופיינים intercalators DNA photoactive העדפת 5&#39; ת&quot;א: באתרים. בניגוד סוכנים crosslinking אחרים כגון חרדל חנקן ו mitomycin C (MMC) הם אינם DNA תגובתי אלא חשופים גל ארוך UV (UVA) אור. מולקולות intercalated מגיבות עם בסיסי תימין על גדילי היפך לייצר crosslinks interstrand מעוותת סליל (ICLs11). עם psoralen trimethyl השתמש בניסויים שלנו רוב המוצרים הם ICLs, מעטים יחסית monoadducts נוצר (פחות מ 10%) 12, ו crosslinks intrastrand בין בסיסים הסמוכים על גדיל אחד לא נוצר. מכיוון שהם אבני עוצמה כדי שכפול שעתוק, psoralen וסוכני crosslinking אחרים, כמו ציס-פלטינה ו- MMC, משמשים בדרך כלל כימותרפיה. לפיכך psoralen לאפשר מחקרים שלאחר הפעלת DDR ידי מבנה מעוות Helix, וגם ספקו תובנה התגובה התאית למתחם עם חשיבות קלינית. אנחנו מסונתז ריאגנט שבו psoralen trimethyl היה מקושר digoxigenin (DIG) חברה sterol הצמח לא נמצא בתאי יונקים שימוש תכוף כמו immunotag. הדרישה עבור photoactivation מתיר לוקליזציה ידי אור לייזר (365 ננומטר) של ICLs psoralen ב ROI מוגדר בגרעין בתאים חיים. אלה יכולים להיות מוצגים על ידי IMMunofluorescence נגד תג Dig. תיקון דנ&quot;א וחלבונים DDR הופיעו פסים של לייזר מקומי 13 ICLs, 14. מהרפובליקה מופעל על ידי בעוצמות לייזר גבוהה משמש לייצור DSBs יכול להיות בגלל הנזק מבודד או מקובצים 15, 16. כתוצאה מכך, את הרלוונטיות של תוצאות מניסויים אלה המתרחשים נגעים טבעיים, נוכח הרבה ריכוז נמוך, אינו ברור. כדי לענות על שאלות דומות לגבי תדירות adduct psoralen והריווח ב DNA, לקחנו את היתרונות של טכנולוגיית סיבים DNA 17 ונקודות immunoquantum. נקודות קוונטיות הן הרבה יותר בהירות צבעי ניאון ואינם מולבנות על ידי חשיפה לאור. לכן הם משמשים לעתים קרובות עבור הדמית מולקולה בודדת 18, בקשה אשר צבעי ניאון בהירים מספיק. ניתן למתוח סיבי DNA בודדים על gמגלשות נַעֲרָה ויכולים להיות מוצגות על ידי immunofluorescence נגד אנלוגים nucleoside שולבו במהלך incubations לפני תא קציר. התייחסנו תאים עם Dig-psoralen וחשף את ההחזר על ההשקעה הקרנה מיקרו לייזר. סיבים הוכנו מן התאים adducts Dig-psoralen הפרט יכול להיות דמיינו עם הנקודות immunoquantum. חשיפת תאי nucleoside אנלוגים לזמנים קצרים יחסית (20-60 דקות) מאפשרת את התצוגה של שטחים שכפולים בסביבה של ICLs הליזר מקומי.

<table><tbody><tr><td>דיגוקסיגנין אסטר NHS</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>כלורו-פסורלן</td><td>ברי ושות'</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>דיאמינוגליקול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>369519</td><td>4,7,10-טריאוקסה-1,13-טרידקנדיאמין</td></tr><tr><td>כלורופורם</td><td>אקרוס אורגניקס</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אמוניום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>לוחות TLC</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>עמוד זכוכית Flass 24/40, 100 מ"ל</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Nikon T2000_E2 דיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי, מצויד בתא בקרה אוטומטי וסביבתי ומחזיק צלחת</td><td>פרקין אלמר</td><td></td><td>עם תוכנת Volocity</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&nbsp;</td><td>אנדור טכנולוגיות</td><td></td><td>עם לייזר פועם חנקן&nbsp;</td></tr><tr><td>תא צבע</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>365 צבע</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>לוחות בוטום זכוכית 35 מ"מ 1.5 כיסוי, קוטר זכוכית 10 מ"מ,</td> שקופיות מיקרוסקופ <td>Matek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td> חדשות חלק אספקת <td>Comer</td><td># 5070</td><td>שקופיות סילאן חדשות</td></tr><tr><td>עכבר נוגדן נגד BrdU (IdU)</td> <td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 ב 40</td></tr><tr><td>נוגדן נגד BrdU חולדה (CldU)</td> <td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 ב 200& נ.ב.פ;</td></tr><tr><td>ארנב נגד חפירה נוגדן</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 ב 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 עז אנטי ארנב IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 ב 5,000</td></tr><tr><td>AF647- עז אנטי עכברוש IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 ב 100</td></tr><tr><td>AF488-עז אנטי עכבר IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 ב 100</td></tr><tr><td>Zeiss epifluorescent מיקרוסקופ A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&nbsp; עם תוכנת Axiovision</td></tr><tr><td>מסנן Q-dot 655</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר psoralen adducts

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

תגובת נזק לדנ&quot;א (DDR) התאפיינה בהרחבה במחקרים של הפסקות גדיל כפול (DSBs) המושרה על ידי הקרנה קרן מיקרו לייזר בתאים חיים. המזרח-גרמנית Helix מעוותת שינויים DNA קוולנטי, כולל crosslinks interstrand DNA (ICLs), הוא לא כמו גם מוגדר. למדנו את DDR מגורה על ידי ICLs, למקום על ידי לייזר photoactivation של psoralens immunotagged, האצור בגרעיני התאים לחיות. על מנת לענות על שאלות בסיסיות אודות חלוקת adduct ומפגשים מזלג שכפול, שילבנו לוקליזציה לייזר עם שתי טכנולוגיות אחרות. סיבים DNA משמשים לעתים קרובות כדי להציג את ההתקדמות של מזלגות שכפול ידי immunofluorescence של אנלוגים nucleoside שולבו במהלך פולסים קצרים. נקודות Immunoquantum הועסקו נרחב עבור הדמית מולקולה בודדת. לפי הגישה החדשה, סיבים DNA מתאי נושאת ICLs מקומי לייזר פרוסים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. ICLs מתויגת מוצגת עם נקודות immunoquantum ו המרחקי e-נגע השאר נקבעו. שכפול מזלג התנגשויות עם ICLs ניתן דמיינו ודפוסי מפגש שונים מזוהים ונרשמים.

Dig-TMP מקומי לייזר (איור 1A) ICLs ניתן להציג על ידי immunofluorescence נגד Dig-תג צמוד psoralen. למרות הליזר יכול להיות הופנה לשבות בשטח של איזשהו חלק, פסים הם לא &quot;טבעיות&quot; צורות בתאים, אותות לגיטימיים ניתן להבחין בקלות בין חפצים בשל כריכה הלא ספציפית על ידי נוגדנים ראשוניים או משניים. תכונה זו שימושית בעת שימוש נוגדנים של פחות מ סגולי מושלם. דוגמא של הסמן הידוע של DDR, γ-H2AX, הוארה בפס ICLs Dig-TMP מוצגת באיור 1...

לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבצע ניתוח של מולקולה בודדת של התפלגות קשרי צלב בין-גדיליים (interstrand crosslinks) הממוקמים באמצעות לייזר ב-DNA גנומי, וזאת כדי לחקור תגובות תאיות לקשרי צלב בין-גדיליים ב-DNA. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום תיקון ה-DNA, בנוגע להתפלגות נגעי DNA שנוצרו באמצעות טכנולוגיית לייזר, המהווה כלי ניסויי נפוץ. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת דימוי ישיר של נגעי DNA שנוצרו על ידי תרכובת המופעלת בלייזר בתוך DNA גנומי.בעבר הדבר לא היה אפשרי. את הפרוצדורה יעמידו ג'וליה גיצ'ימו (Julia Gichimu) והימה גאלי (Hima Gali) מהמעבדה שלנו. בכל פעם שמשתמשים בלייזר המכוון, חשוב לבצע כיול של שקופית המראה כדי לוודא שהלייזר פוגע בקואורדינטות XYZ המתאימות, ולהגדיר את שטח השדה הנלכד על ידי המצלמה שבו ניתן להגדיר את נקודת הפגיעה של הלייזר.מצאו בשקופית שטח שעבר תהליך תערוץ מוקדם. הגדירו את זמן החשיפה ועוצמת הלייזר. לאחר מכן, כוונו את המיקוד כדי לעבור לשטח סמוך שאינו מטרה על שקופית המראה.התחילו את הליך הכיול. התוכנה תפעיל את הלייזר כדי לחרוץ את שקופית המראה לאורך קווים אופקיים ואלכסוניים. קווים אלו מגדירים את גבולות השטח שבו הלייזר יכול לפגוע בתא מטרה.הגדירו מספר אזורי עניין, או ROIs, בתוך השדה והפעילו את הלייזר כדי לוודא שהוא פוגע באזורים שנבחרו ובכך פוגע בקואורדינאטות XYZ המתאימות. יש לבצע גם כיול ביולוגי בעת הגדרת מערכת לייזר המכוונת של המיקרוסקופ. השלב הראשון הוא להגדיר את הספק הלייזר המינימלי הדרוש כדי להפעיל פוטו-כימית trimethylpsoralen, או TMP, להשרות קשרי הצלבה בין-גדיליים, ולגרום לגיוס של גורם תיקון המסומן ב-GFP, שאת הקינטיקה שלו ניתן לאפיין מראש.במעבדה זו נעשה שימוש בשורת תאי U2OS שעברו טרנספקציה יציבה עם פלסמיד המבטא GFP fan one. כפי שמוצג כאן, כאשר תאים נחשפים ל-6 µM TMP ולקרן לייזר בעוצמה של 1.2% למשך 10 דקות, צפייה ברצף התמונות כסרטון מאשרת את הגיוס של GFP fan one ל-ROI המיועד. השלב השני הוא לוודא שהגדרת הספק זו אינה מעוררת גיוס בהיעדר התרכובת.כפי שניתן לראות כאן, כאשר תאים חשופים ללייזר בלבד בהספק של 1.2% למשך 10 דקות והתמונה נצפית כסרטון, לא נצפית גיוס של GFP fan one ל-ROI המיועד. שלישית, חשוב להגדיר את הגדרת העוצמה המינימלית המסוגלת לגרום לפיצוץ של תא (blow out). את היכולת לגרום לפיצוץ של תא בהגדרת עוצמה זו יש לבחון ככיול ביולוגי שגרתי בכל יום שבו נעשה שימוש בלייזר המכוון.הגדירו את ה-ROI בתוך הגרעין תוך הימנעות מהגרעיניות. כוון את המיקוד. הגדירו את עוצמת הלייזר ל-12% והפעילו.לבסוף, חיוני לקבוע את מישור המוקד במרכז התא כדי להשיג כיוון נכון. כדי להדגים זאת, שלושה תאים כוונו לשלושה מישורי מוקד. מרכז התא.גבוה מדי. ונמוך מדי. שלוש דקות לאחר מכן, נוצר ערימה של תמונות המכסה שלושה מיקרונים כדי לבחון את התהלוכות של ה-GFP fan one stripe לאורך מישור המוקד המצולם.רק התא שהוכח למרכז התא מראה פס בודד של מאוורר GFP בכל מישורי Z. לפני ביצוע המיקום בלייזר, הכינו צלחות תרבית תאים עם תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר עבור גידול התאים. בעזרת טוש סימון, סמנו סימן אנכי בצדה של כל צלחת.השתמשו בעט יהלום כדי לחרוץ סימן בצורת צלב במרכז הזכוכית על פני השטח של התרבית, כך שהפס השחור בצד של הצלחת יהיה בחלקו העליון של אחד מזרועות הצלב. הצלב מסומן על פני השטח של הצמיחה של הזכוכית, כך שהוא והתאים יהיו באותו מישור מוקד. זרעו תאים לתוך צלחוני תרבית סטריליים המסומנים בצלב, והדגירו למשך 24 שעות ב-1 µM של five chloro deoxyuridine כדי לסמן את ה-DNA באופן אחיד.ביום הניסוי, הוסיפו TMP מקושר ל-digoxigenin או dig TMP ב-50% ethanol למצע גידול התאים עד לריכוז סופי של 20 micromolar. חממו את המצע ל-37 degrees Celsius. החליפו את המצע בצלחות התרבית במצע המכיל dig TMP והדגרירו ב-37 degrees Celsius ו-5%CO2 למשך 30 דקות כדי לאפשר ל-dig TMP להגיע לשיווי משקל.בזמן שהתאים נמצאים באינקובציה, בצעו כיול של שקף המראה (mirror slide) וניפוח של 12% של תא, כפי שהודגם קודם לכן. הניחו את הפלטה בתא הסביבתי בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם CO2 ולחות מבוקרים על במה המיקרוסקופ. התמקדו באמצעות עדשת שמן 60X בנקודת ההצטלבות של הצלב.בחר את השדה הראשון למיתוג והשתמש בכלי הצורה כדי להגדיר את ה-ROIs בתאים בודדים הממוקמים בסמיכות מיידית להצטלבות הצלב. בחר אזורים נוקלאופלזמיים מחוץ לגרינולאות. כוון את מישור המוקד Z כדי למקד את הלייזר במרכז הגרעינים.בשלב הבא, הגדירו את עוצמת ההספק למינימום הנדרש כדי להפעיל את הפסורלן בתגובת הנזק ל-DNA המושרה על ידי קשרי צלב בין-גדיליים. כאן נעשה שימוש ב-1.2%. הפעילו את הלייזר.לאחר שכל התאים בשדה הראייה סומנו, העבירו את הפלטה לשדה חדש, תוך שמירה על קרבה להצטלבות של הצלב. חזרו על הפרוצדורה שהודגמה כעת ב-12 עד 18 שדות כדי לסמן סך כולל של 80 עד 100 תאים. כדי לקצור את התאים, הסירו את צלחת התרבית מהבמה.הסיר את המצע ושטוף את התאים עם תמיסת PBS. הסר את ה-PBS והנח טיפה של 10 µL של תמיסת trypsin EDTA מסחרית על נקודת המפגש של הצלב במרכז משטח הזכוכית. הדגר למשך שלוש עד ארבע דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שאב את תמיסת ה-trypsin עם התאים שהסתרו לתוך טיפ של פיפטה.מקמו את טיפת ה-trypsin EDTA עם התאים בקצה אחד של סלייד זכוכית למיקרוסקופ שעבר סילניזציה. כדי ללוות את התאים ולשחרר את ה-DNA, הוסיפו 10 µL של תמיסת 5% SDS והדרימו למשך שלוש עד ארבע דקות בטמפרטורת החדר, תוך ערבוב עדין עם קצה הפ pipette, ואפשרו לשולי השלולית להתייבש. הטו את הסלייד ב-20 מעלות ואפשרו לנוזל לזרום מטה אל הקצה.הכוחות ההידרודינמיים של הנוזל הזורם יאריכו וימתחו את סיבי ה-DNA. השאר את השקופית לייבוש באוויר למשך 10 דקות. טבול את השקופית בתמיסה של מתנול וחומצה אצטית ביחס של שלושה לאחד, וקבע למשך 10 דקות.לאחר מכן, הוציאו את השקופית מתמיסס הקיבוע והניחו לה להתייבש שוב באוויר. בשלב זה ניתן לאחסן את השקופית למשך זמן בלתי מוגבל ב-70% ethanol בטמפרטורה של 20 degrees Celsius. כדי לעבד את השקופית לזיהוי אותות dig על סיבי DNA באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, הוציאו את השקופית עם ה-DNA המתוח מתמיס ה-70% ethanol והניחו לה להתייבש באוויר.בשלב הבא, דנטורו את סיבי ה-DNA בחומצה כלורית ולאחר מכן העבירו אותם למכל עם tris hydrochloridic ב-pH 8 לצורך ניטרול. לאחר מכן, שטפו את הדגימות ב-PBS. ולבסוף, צבעו אותן עם הנוגדנים המתאימים בהתאם לפרוטוקול שפורסם בעבר.מוצג המבנה של trimethylpsoralen עם תג dioxigenin. ניתן להציג קשרי הצלבה בין-גדיליים ב-DNA, או ICLs, באמצעות אימונופלורסנציה נגד dig TMP. דוגמה זו מראה תאים עם הצטברות של סמן ידוע לתגובת נזקי ה-DNA, gamma H2AX, המודגש בירוק, בתוך ROIs המכילים ICLs מקומיים שנוצרו בלייזר והמודגשים באדום.הגרעין שצבעו DAPI מופיע בכחול. השדה המואר מראה תא הנמצא חלקית על הסימון שבוצע בעט יהלום. שימו לב שמרחבי העניין (ROIs) ממוקמים מחוץ לגופי הגרעין (nucleoli).כדי לקבוע את התדירות והמרווחים בין האדוקטים, תאי התאים הוגדלו בנוכחות 5-chloro-deoxyuridine למשך 24 שעות לפני החדרת ה-ICLs. לאחר קצירת התאים ופריסת סיבי ה-DNA, אותי ה-dig זוהו באמצעות amino quantum dot שנראה בצבע אדום, וה-5-chloro-deoxyuridine זוהה באמצעות amino fluorescence שנראה בצבע ירוק. ניתוח של אותי ה-dig על הסיבים גילה כי המרחקים בין ה-ICL נעים מפחות מ-10 KB ועד יותר מ-160 KB. לא נמצאו ראיות לאדוקטים מקובצים.בעקביות להנחיות אלו, ניתן יהיה להרחיב גישה זו לאדוקטים אחרים של DNA, כגון נגעים חמצוניים שניתן לאתר באמצעות לייזרים באורך גל מתאים.

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

סרטון זה מדגים הדמיית תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח כדי לזהות הפרשות חלבונים מתא יחיד. באמצעות מערך מיקרופלואידי ושבב ננו-מבנה פלסמוני הקשור לפפטידים, שינויים בעוצמת האור המוחזר בזווית התהודה חושפים אינטראקציות עם חלבונים המופרשים מתא יחיד.

הדמיית תהודה פלסמונית מקומית על פני השטח לאיתור הפרשות חלבונים מתא בודד

אנו מדווחים על תהליך של שינוי באתרו של HF טופל סי פני (001) למצב הידרופילי או הידרופובי על ידי הקרנת דגימות בתאי microfluidic המלא H 2 O 2 פתרונות מתנול 2 O פתרון (0.01% -0.5%) או / H באמצעות לייזר UV פעמו של שטף דופק נמוך יחסית.

פינת שינוי סלקטיבית של יכולת רטיבות משטח סיליקון על ידי פעמו UV לייזר הקרנה בסביבה נוזלית

הדמיה ספקטרוסקופית אלקטרונית יכולה לדמות ולהבחין בין חומצת גרעין לחלבון ברזולוציה ננומטרית. ניתן לשלב אותו עם מערכת miniSOG, המסוגלת לתייג באופן ספציפי חלבונים מתויגים בדגימות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. אנו מדגימים את השימוש בטכנולוגיות אלה באמצעות מוקדי תיקון שברים כפולים כדוגמה.

הדמיה של חלבונים תיקון ה- DNA miniSOG תייג בשילוב עם אלקטרונים Spectroscopic הדמיה (ESI)

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

קרינה פלואורסצנטית קונאפוקלית מיקרוסקופ לייזר מיקרו-הקרנה הצעה וכלים גרימת נזק לדנ א וניטור התגובה של חלבונים תיקון ה-DNA באזורים נבחרים גרעיני תת. טכניקה זו התקדמה באופן משמעותי את הידע שלנו של גילוי הנזק, איתות, גיוס. כתב יד זה מדגים הטכנולוגיות הללו לבחון סטרנד ליחיד מעבר לתיקון.

היישום של לייזר מיקרו-הקרנה בחינת יחיד ותיקון כפול Strand Break בתאים בתרבית

לומד DNA נזק תיקון קינטיקה דורש מערכת לזירוז נגעים ב גרעיני תת אזורים מוגדרים. אנו מתארים שיטה ליצור מעברי גדילי זוגיות המותאמות לשפות אחרות באמצעות סריקה בלייזר מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד 405 ננומטר לייזר ולספק שגרות אוטומטיות כדי לכמת את הדינמיקה של הגורמים תיקון הפצעים כאלה.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון במדגם חלבונים מורכבים ברמת מולקולה בודדת.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

אנו מתארים כאן שיטות לקוונפיקציה רגיש ומדויק של נגעים 8-אוקסו-7, 8-dihydro ידרו-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-דאדו) ו-1,N2- etheno-2'-deoxyguanosine (1,N2-dguo) ב-DNA. השיטות הוחלו על הערכת ההשפעות של חומר מקיף חלקיקי הסביבה (PM2.5) ברקמות (ריאות, כבד וכליות) של עכברים חשופים A/J.

קוונפיקציה של שלוש נגעים DNA ידי ספקטרומטר המוני והערכה של רמות שלהם ברקמות של עכברים חשופים החומר מקיף חלקיקים עדינים

פרוטוקול זה מציג שיטה לשימוש בדוסימטריה רדיקלית מוטבעת ומקור אור פלזמה לביצוע טביעת רגל של חלבון חמצון פלאש. שיטה זו מחליפה את לייזר UV מסוכן כדי לפשט ולשפר את הרבייה של חמצון פוטוכימי מהיר של מחקרי חלבון.

טביעת רגל של חלבון הידרוקסיל רדיקלי ללא לייזר לביצוע ניתוח מבני מסדר גבוה יותר של חלבונים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לא פולשנית לזיהוי יעיל של תאי S-phase למחקרי מיקרוסקופיה במורד הזרם, כגון מדידת גיוס חלבונים לתיקון דנ"א באמצעות הקרנת מיקרו-קרינה בלייזר.

הקרנת מיקרו לייזר לחקר גיוס DNA במהלך שלב S

פרוטוקול חזק מוצג כאן לבידוד גרגירי נוירומלנין מרקמות אנושיות שלאחר המוות nigra pars compacta באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר. פרוטוקול מתוקן וממוטב זה ממזער באופן מסיבי את הזמן הנדרש לאיסוף הדגימה, מפחית את כמות הדגימה הנדרשת ומשפר את הזיהוי והכימות של חלבונים על ידי ניתוח LC-MS/MS.

פרוטוקול מבוסס מיקרודיסקציה בלייזר לניתוח LC-MS/MS של הפרופיל הפרוטאומי של גרגירי נוירומלנין

למד ניתוח מולקולה בודדת של חיבורים בין-שרשרתיים ב-DNA באמצעות לייזר ממוקד לחקר תגובות תאיות לנזקי DNA. שיטה זו מאפשרת הדמיה ישירה של פגיעות גנומיות ומסייעת להבנת מנגנוני תיקון DNA בחקר מולקולרי מתקדם.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

גלה סרטונים נוספים