Name: RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: למד שיטת electroporation מתקדמת לטרנספקציה של תאי TH17 אנושיים ראשוניים עם RNA קטן. טכניקה זו מאפשרת חקר ביולוגיה של תאי T, רגולציה של גנים ותפקוד חיסוני ביעילות גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות בארה"ב (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), פרס חוקר של האגודה ללוקמיה ולימפומה (K.M.A.), והתוכנית להכשרת מדענים רפואיים של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית (NIGMS) (מענק #T32GM007618) (M.M).

פרוטוקול זה פועל לפי ההנחיות של UCSF לאתיקת מחקר אנושי. 1. הכנת תרבית תאי T, הבידוד של תאים מסוג CD4 + T, ואת קיטוב TH17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 0, צלחות תרבות מעיל רקמה 6-היטב עם 1.5 מ&quot;ל לכל טוב של CD3 אנטי אנושי (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התאים mononuclear דם טבורי (CBMCs) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות לפי הוראות היצרן. זהירות: עבוד בזהירות ולוודא ציוד מגן אישי מתאים (PPE) הוא משוחק בעת טיפול דם אנושי כדי למנוע כל סיכון של חשיפה לפתוגנים שמקורן בדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאי mononuclear בודדו ורחץ, לבצע בידוד תא אנושי CD4 + T על ידי Sele גודל שליליction באמצעות ערכת תא מסחרית האנוש CD4 + T. הערה: אם יש זיהום תא דם אדום לאחר בידוד תא mononuclear, הגידול ימס כדוריות דם אדום אופציונאלי עשויות להתבצע לפני צעדי בידוד תא CD4 + T. Resuspend התאים mononuclear ב 1 מ&quot;ל של חיץ בידוד (2% FBS ב PBS). מוסיפים 5 מ&quot;ל של תמיסת lysing 1x. דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז להוסיף 5 מ&quot;ל של חיץ צנטריפוגות בידוד XG 300 5 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים mononuclear בצפיפות של 50 x 10 6 לכל 500 μL במאגר הבידוד בצינור 5 מ&quot;ל חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL של FBS ו 100 μL של מיקס נוגדן לכל צינור דגירה אז כל צינור בבית 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות על שייקר מסלולית לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, להוסיף 3-4 מ&quot;ל של חיץ בידוד לשטוף את התאים. צנטריפוגה התאים XG 300 8 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. בזהירות לשאוב Supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ספין זו, טרום לשטוף את החרוזים המגנטיים. מעביר את הכמות הרצויה של חרוזים מגנטיים לתוך צינור חדש (בשימוש ב- 1: 1 עם התאים) ולהוסיף נפח שווה של חיץ בידוד כדי לשטוף את החרוזים. מערבבים היטב באמצעות micropipette מ&quot;ל 1 ולאחר מכן למקם את הצינורית שואבת דק 1 לפחות. בזהירות לשאוב supernatant. Resuspend החרוזים המגנטיים בהיקף הזהה הועבר בתחילה לפני הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים בצינור אחד עם 500 μL של חיץ בידוד ולהוסיף 500 μL של חרוזים מגנטיים מראש שטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם חרוזים מגנטיים עבור 15 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר (18 ° C עד 25 ° C) לערבב היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, ביסודיות pipet התאים באמצעות micropipette 1 מ&quot;ל לפחות 10 פעמים. ואז להוסיף 3-4 מיליליטר של חיץ בידוד ומקום כל צינורית השואבת 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את התאים באופן שלילי שנבחרו CD4 + T הנמצאיםאת supernatant לצינור חדש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר CD4 + T בידוד תא יושלם, לספור את התאים עם hemocytometer ולשמור תאים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 1.5 מ&quot;ל של 2x תערובת של TH17-מקטב התקשורת היטב כל: אנטי-אנושי IFNγ (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל), אנטי אנושי IL-4 (20 מיקרוגרם / מ&quot;ל), TGFβ אדם (10 ng / mL), אדם IL-1β (40 ng / mL), אדם IL-23 (40 ng / mL), IL-6 אדם (50 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 U / פניצילין מ&quot;ל, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל, 10 HEPES מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol). הערה: Transfection והפרעה RNA עושה עבודה בתקשורת סרום המכיל. מטרת השימוש בסרום ללא מדיה עם פרוטוקול זה היא להשיג ייצור IL-17A טוב יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאי CD4 + T האנושיים XG ב 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת תאים. בזהירות לשאוב supernatנְמָלָה. ואז resuspend התאים בתקשורת בסיס סרום ללא צלחת התאים בצפיפות של 3 x 10 6 ב 1.5 מ&quot;ל לכל היטב כך נפח הסופי הוא 3 מ&quot;ל לכל טוב וציטוקינים מקטב כיום בריכוז סופי 1x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחות ב 5% 2 CO, 37 ° C חממה במשך יומיים. </li></ol></li></ol> 2. Electroporation של במבחנת תאי TH17 אנוש Polarized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2, צלחות תרבות 48-היטב רקמות מעיל עם 250 μL לכל טוב של אנטי אנושי CD3 (2 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ו CD28 אנטי-אנושיים (4 מיקרוגרם / מ&quot;ל) ב PBS עם סידן ומגנזיום לפחות 2 שעות ב 37 ° C. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, מעיל הצלחות לילה בשעה 4 ° C. גלישת צלחות ב parafilm. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן RNA הקטן עבור transfection. במשך כל transfection, aliquot 1 μL של פתרון המניות 5 מיקרומטר של siRNA לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. כלול contr RNA קטן כימית בהתאמה המתאימהol. שמור את כל הצינורות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמים שתי צלחות מצופים נוגדן עם PBS. ואז להוסיף 500 μL של 1X TH17-מקטב התקשורת היטב כל: IFNγ האנטי-אנושית (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל), אנטי אנושי IL-4 (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל), אדם TGFβ (5 ng / mL), אדם אִי- 1β (20 ng / mL), אדם IL-23 (20 ng / mL), IL-6 אדם (25 ng / mL) כל מדולל תקשורת בסיס סרום ללא (בתוספת 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 100 U / מ&quot;ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מ&quot;ל, 10 HEPES מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ פירובט נתרן ו 100 מיקרומטר 2-mercaptoethanol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הצלחות תרבות ריאגנטים transfection מוכנים, להשעות את התאים עם pipetting 1 מ&quot;ל micropipette, בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. פינת התאים לתוך צינור צנטריפוגות חרוטים ב XG 500 עבור 5 דקות ב 4 °. הערה: עבור תקופות תרבות יותר מאשר פרוטוקול ארבעה ימים המוצגת כאן, התאים צריכים להיות טרנספקציה בערך כל 3 ימים באמצעות בפרוטוקול הזה. שלב 20.4 מן ראוי לשנות זאת מאז התאים שטופלו RNA הקטן שונה לא צריכים להיות ונקווה. כל התנאים הנבדקים יש לאסוף, נספר בנפרד טרנספקציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים לפחות 1 מ&quot;ל של PBS לשטוף. ספירת תאי TH17 החיים (למשל עם hemocytometer באמצעות הרחקה הכחולה Trypan להעריך כדאיות) ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, ולאחר מכן מחדש להשעות את התאים באמצעות חיץ resuspension סיפק מן ערכת מערכת transfection 10 μL בצפיפות של 2.5-4 x 10 7 תאים לכל מ&quot;ל. שמור תאים בטמפרטורת החדר. הערה: ככלל מנחה, ולנסות להכין רק כמו תאים רבים ככל שניתן טרנספקציה בתוך 30 דקות. ניתן להשוות קבוצות מרובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 9 μL של תאים 1 μL של RNA קטנים בכל microcצינור entrifuge. Pipet פעם לערבב את התאים RNA קטנים עבור transfection מכן לטעון לתוך קצה האלקטרודה פיפטה המסופקים. הערה: בדרך כלל, להוסיף 9.5 μL של ההשעיה התא כדי להבטיח שיש מספיק מהתערובת על מנת למנוע יצירת בועות קצה האלקטרודה pipet לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו קובט מסופק עם 3 מ&quot;ל של E. חוצץ אלקטרוליטי בטמפרטורת החדר מקום קובט בתוך תחנת פיפטה ואז למקם את פיפטה לתוך העמדה בתוך קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד electroporate כל תמהיל 10 μL של תאים ו- RNA הקטן באמצעות הפרמטרים הבאים: מתח דופק 1,500-1,550 V, רוחב דופק 10 ms, ו 3 פולסים הכוללים במכשיר transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר electroporation יושלם, ישירות מוסיף את תערובת תא 500 μL של 1X TH17-מקטב תקשורת בארות מוכנות של צלחת תרבות. צלחות מקום בתוך CO 5% 2, 37 ° C חממה במשך יומיים נוספים. הערה: לשטוף את קצה האלקטרודה פיפטה ידי pipettingמעלה ומטה PBS בין כל transfection. </li></ol> 3. תאי קציר האנוש TH17 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים התקשורת והתרבות עם micropipette, pipetting בעדינות אך להבטיח כי כל התאים מנותקים מהחלק התחתון של בארות. הכן את התאים עבור מבחני ביטוי תפקודיים ו / או גן. הערה: שגרה, מספיק תאי ניב מבאר אחת של תאי TH17 טרנספקציה לשמש לניתוח הזרימה cytometric של סמן משטח גורם ציטוקינים ותמלול תאיים מכתים או להכנה של RNA עבור ניתוח ביטוי גנים. </li></ol>

<ol><li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Effector+CD4+T+Cell+Populations%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*.</a> Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+immune+axis%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.</a> Nature. 14 (9), 585-600 (2014).</li>
<li>Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+origin+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Properties and origin of human Th17 cells.</a> Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).</li>
<li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).</li>
<li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-326+regulates+TH-17+differentiation+and+is+associated+with+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).</li>
<li>Escobar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-155+Activates+Cytokine+Gene+Expression+in+Th17+Cells+by+Regulating+the+DNA-Binding+Protein+Jarid2+to+Relieve+Polycomb-Mediated+Repression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression.</a> Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+Hif1a+expression+and+TH17+differentiation+by+the+hypoxia-regulated+microRNA+miR-210%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210.</a> Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+bioanal+chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Steiner, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%26gamma%3B+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&gamma; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).</li>
<li>Simpson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li>
<li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Na%C3%AFve+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מספק שיטה משופרת עבור המשלוח של RNA הקטן לתוך תאי TH17 אנושיים. למרות תאים אנושיים TH17 שימשו כאן, שיטה זו של electroporation עם RNA קטנים יכולים לשמש עם תת T מסייעים האנושי העיקרי אחרים, כגון Th1, Th2, ו Tregs. זה לא עבד היטב עבור תאים נאיביים CD4 + T כך התאים חייב להיות מופעל בתרבות לפני transfection. עבור פרוטוקול זה, אנחנו ראשונים מותאמים למערכת התרבות חוץ גופייה לייצור IL-17A טוב יותר. הגורם הגדול ביותר היה בסיס מדיה. מצאנו כי סרום ללא מדיה היי...

תאי CD4 + T הם Orchestrators חיוני של התגובה החיסונית אדפטיבית. תאים נאיבי CD4 + T המסוגלים להתפתח לתאי T מפעיל שונים (למשל Th1, Th2, TH17, וכו &#39;), כל אחד עם סט משלו של ציטוקינים מאפיין גורמי שעתוק, תלוי במיקרו-סביבה מקומיים 1. החלטות השושלת תאי T להפוך הן קריטיות עבור שני החסינויות וסובלנות עצמיות. תאי TH17 הם תת-קבוצה אחת של תאי T הידועים להילחם חיידקים ופטריות תאיים, אבל התגובות הפסולות שלהם הן מעורבות גם בפתוגנזה של מחלות מרובות אוטואימוניות ודלקתיות כגון טרשת נפוצה ופסוריאזיס 2, 3. ניתן להפיק תאי TH17 אדם מתאי נאיבית CD4 + T במבחנה על ידי מתן אותם עם סביבת מקטב מתאימה 4. Vario<html> לנו שילובים של ציטוקינים IL-1β, IL-23, TGFβ, ו- IL-6 שימשו לפיתוח תאי TH17 האנושי. תאי האדם TH17 להביע CCR6, קולטן chemokine כי הוא נפוץ לזהות אוכלוסיית התא הזה ומוגדרים על ידי הביטוי של גורם השעתוק העיקרי שלהם, RORγt (המקודדים על ידי RORC) 5, 6. יש TH17 התאים את היכולת להביע ציטוקינים מרובים, אך IL-17A הוא ציטוקין מפעיל-המגדיר בשושלת מיוצר על ידי תאים אלה. בחנו את הביטוי של כל שלושת הסמנים הקשורים TH17 (CCR6, RORγt, IL-17A) כדי להעריך את החוסן של assay בידול במבחנה ב TH17 האנושי שלנו. בנוסף, אנו בתרבית תאים מסוג CD4 + T אנושיים בתנאים בלתי-מקטב, שבו אין ציטוקינים או נוגדנים חוסמים נוספו התקשורת והתרבות להשתמש כביקורת שלילית מאז הביטוי של סמנים TH17 אלה צריכים להיות מאוד נמוך או נעדר. ve_content &quot;&gt; דרך אחת ללמוד פיתוח T תא אנושי נורמלי ביולוגיה היא לתפעל ביטוי גנים במהלך ההתפתחות שלהם. קצר מפריעים RNA (siRNA) הם מולקולות רנ&quot;א קטנות כי למקד תעתיקי המקודדים חלבונים והוא יכול להיות מנוצל כדי להפחית ביטוי גנים ספציפיים . מיקרו RNA (miRNAs) הוא אנדוגניים ללא קידוד RNA הקטן הידוע לווסת ביטוי גנים לאחר תעתיק. miRNAs הוכח לשחק תפקיד חשוב הן בעכברי ביולוגיה של תא T אנושי, לרבות TH17 תא 7, 8, 9. זה חשוב לי שיטות אמינות של מניפולצית פעילות RNA קטנה תא T אנושי ללמוד והשפיע על ביטוי גנים, ובסופו של דבר על הביולוגיה של תאי T אנושי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול קל לשימוש, עקבי ואמין שפתחנו עבור החדרה RNAs סינטטי קטן וחומצות גרעין נעול (LNAs, שינוי כימי חומצות גרעין עם יציבות מוגברת)לתוך תאי מערכת חיסון, ובאופן ספציפי לתאי TH17 אנושיים. ישנן מספר שיטות חלופיות של החדרת RNA הקטן לתוך תאי יונקים, אשר בדרך כלל מתחלקים לקטגוריות כימיות, ביולוגיות, או פיסיות 10. בשימוש נפוץ שיטות כימיות, כולל transfections שומנים מבוססי transfections וסידן-פוספט, להסתמך על יצירת מתחמים הכימי-DNA, כי הם יותר נלקחים ביעילות על ידי תאים. באופן כללי, שיטות כימיות אינן יעילות כמו עבור transfection של תאי T העיקריים. השיטה הביולוגית הנפוצה ביותר היא להשתמש וקטור ויראלי (רטרו-וירוס למשל או lentivirus), אשר מוסיף RNA זרות ישירות לתוך שורה כחלק מחזור השכפול הטבעי שלה. תמרת ויראלי בדרך כלל לוקחת יותר זמן כדי להשלים, במיוחד כאשר אחד גורמים בזמן שיבוט מולקולרי של פלסמידים proviral. בנוסף, וקטורי תמרת ויראלי יכולים להיות מזיקים חוקרים אנושי. Electroporation הוא מ פיזיתethod של גרימת הקרום permeabilization ידי העמדה לתאים פולסי מתח גבוה, המאפשרת חומצות גרעין להיכנס לתוך התא זמני שבו הם יכולים לפעול על היעד שלהם. מכשירי electroporation מסורתיים היו לא יעילים עבור transfecting לימפוציטים העיקרי. עם זאת, electroporation הדור הבא אופטימיזציה הוכיח להיות מסוגל transfecting תאי T ביעילות גבוהה מאוד, במיוחד כאשר החומר להיות transfected הוא RNA הקטן. הדור הבא המונח משמש באופן רופף להבדיל שני הפלטפורמות החדשות יותר (למשל, הניאון, Amaxa) ממכונות electroporation מסורתיות. בנוסף, שיטה זו היא להרחבה בקלות עבור מסכי תפוקה מתונים עם עד כ 120 RNA הקטנים בניסוי אחד, לעתים קרובות באמצעות ריאגנטים סינטטיים תוקף. חשוב לציין, ניתן להשיג transfections מוצלח קטן כמו 16 שעות לאחר הפעלת תא T. החסרון של שיטה זו, לעומת זאת, הוא שזה לא לגרום incorporati גנומי יציבעל, ולכן הוא חולף. לפיכך, זה שווה את המאמץ הנוסף כדי ליצור מבנה ביטוי יציב שיכול להיות ארוז לתוך וקטור ויראלי והביע בהצלחה בתאי T במקרים בם ביטוי לטווח הארוך של RNA קטנה נדרש. השתמשנו transfection הדור הבא (למשל, ניאון) כדי לספק כלי RNA או LNA oligonucleotide יחידים או פעמים התקועות סינטטיים מגוונים למטרות שונות 11, 12, 13. התערבות RNA יעילה יכולה להיגרם עכבר עיקרי ותא T אנושי באמצעות RNA דו-גדילים קצרי מפריעים (siRNA). פרוטוקול זה מתאר מצבים מותאמים לשימוש בטכניקה זו בתאי TH17 אנושיים. בנוסף siRNAs, מחק מירנה סינטתית זמינה מסחרי מעכבים יכולים לשמש כדי ללמוד רווח מירנה ואובדן התפקוד. מחקה מירנה הן מולקולות RNA דו-גדילים דומות מאוד siRNAs, אבל designeד עם רצף של miRNAs בוגרת אנדוגניים. מעכבי מירנה הם כימית-modified RNA ו / או LNA מבוסס oligonucleotides תקועים אחד אשר נקלטות על ידי miRNAs יליד להרגיז את תפקידם. מצאנו כי כל הכלים האלה יכולים לשמש ביעילות לימפוציטים מסוג T העיקרי מתורבתים, לרבות אך לא רק תאי TH17 אנושיים.

<table><tbody><tr><td>אנטי-אנושי IL-17A PE</td><td>ebioscience</td><td>12-7179-42&nbsp;</td><td>שיבוט: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>אנטי אנושי IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>שיבוט: 4S. B3</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>שיבוט: SK3</td></tr><tr><td>עכבר אנטי אנושי CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>שיבוט: 11A9</td></tr><tr><td>אנטי אנושי RORgt AF647</td><td>BD biosciences</td><td>563620</td><td>שיבוט: Q21-559</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>שיבוט: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/צביעת גורם שעתוק סט חיץ</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>עבור גורם שעתוק תוך-תאי זרימה ציטומטריה צביעת</td></tr><tr><td>Hu FcR מעכב מחייב ebioscience מטוהר</td><td></td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF T הרחבת תאי</td><td>גזע בינוניים טכנולוגיות תאי גזע</td><td>10981</td> <td>"מדיה בסיס ללא סרום"MACS</td></tr> <tr><td>CD28 כיתה פונקציונלית טהורה,</td><td>שיבוט Miltenyi Biotec</td><td>אנושי 130-093-375</td><td>: 15E8</td></tr><tr><td>אנטי אנושי CD3 מטוהר</td><td>UCSF ליבת נוגדן חד שבטי</td><td>N / A</td><td>שיבוט: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF מטוהר אנטי אנושי IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>שיבוט: MP4-25D2</td></tr><tr><td>אנטי אנושי IFNg, מדע ביולוגי מטוהר בדרגה פונקציונלית</td><td></td><td>16-7318-85</td><td>שיבוט: NIB42</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-23</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 ובטא אנושיים רקומביננטיים;</td><td>פפרוטק&nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>TGF ובטא אנושיים רקומביננטיים; 1</td><td>פפרוטק&nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 פפרוטק אנושי רקומביננטי</td><td>&nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME Control Pool, לא ממוקד #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human RORC</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool Human PTPRC</td><td>Dharmacon</td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ערכת תאי CD4 T אנושיים שלא נגעו</td> בהם <td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>CD4+ תא T אנושי ערכת בידוד</td></tr><tr><td>מערכת העברה ניאון</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>מכשיר אלקטרופורציה מהדור הבא</td></tr><tr><td>מערכת העברה ניאון 10 &mu; L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>מאגר השעיה T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>מסופק בערכה (MPK1096)</td><td>"מאגר השעיה מחדש של טרנספקציה"</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>שיפוע צפיפות</td></tr><tr><td>בינוני קוסטאר 6 בארות צלחות מטופלות בתרבית רקמות</td><td>קורנינג</td><td>3516</td><td>צלחות תחתונות שטוחות</td></tr><tr><td>costar 48 בארות צלחות מטופלות בתרבית רקמות</td><td>קורנינג</td><td>3548</td><td>צלחות תחתונות שטוחות</td></tr><tr><td>מאגר ליזינג BD פארם ליז, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>חייב להכין תמיסה 1x עם מים מזוקקים לפני השימוש</td></tr></tbody></table>

rna הקטן transfection ב ראשוני האדם th17 תאים על ידי הדור הבא electroporation

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

תאי CD4+ T יכולים להתמיין למספר תת-קבוצות של תאי T מסייעים אפקטורים בהתאם לסביבת הציטוקינים שמסביב. תאי Th17 יכולים להיווצר מתאי CD4+ T נאיביים במבחנה על ידי הפעלתם בנוכחות הציטוקינים המקטבים IL-1β, IL-6, IL-23 ו-TGFβ. תאי Th17 מתזמרים חסינות נגד חיידקים ופטריות חוץ-תאיים, אך פעילותם החריגה נקשרה גם למספר מחלות אוטואימוניות ודלקתיות. תאי Th17 מזוהים על ידי קולטן הכימוקין CCR6 ומוגדרים על ידי גורם השעתוק הראשי שלהם, RORγt, וציטוקין אפקטור אופייני, IL-17A. תנאי תרבית אופטימליים להתמיינות תאי Th17 מאפשרים מחקרים מכניסטיים של ביולוגיה של תאי T אנושיים בסביבה מבוקרת. הם גם מספקים מסגרת לחקר החשיבות של גנים ספציפיים ותוכניות ביטוי גנים באמצעות הפרעות RNA או הכנסת חיקויים או מעכבי מיקרו-RNA (miRNA). פרוטוקול זה מספק שיטה קלה לשימוש, ניתנת לשחזור ויעילה ביותר לטרנספקציה חולפת של התמיינות תאי Th17 אנושיים ראשוניים עם RNA קטן באמצעות מכשיר אלקטרופורציה מהדור הבא.

הצעד הראשון כדי לפתח מערכת אמינה של electroporating בהצלחת תאים אנושיים TH17 היה לייצר חזק בתרביות תאי TH17 אנושיות המובחן במבחנה. תאי T בתרבית בתנאים-מקטב TH17 הביע את הקולטן chemokine CCR6 ואת גורם שעתוק RORγt (איור 1A, שמאל). סמנים אלה לא באו לידי ביטוי כאשר תאי T היו בתרבית בתנאים הלא-מקטב (thn) (איור 1A, מימין). תאי T בתרבית בתנאים-מקטב TH17 מיוצר גם IL-17A על restimulation (איור 1B,<...

אלקטרופורציה מהדור הבא היא שיטה יעילה להעברת תאי Th17 אנושיים עם RNA קטן כדי לשנות את ביטוי הגנים והתנהגות התאים.

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ביצוע טרנספקציה יעילה של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות רכיבי RNA קטנים תוך שימוש באלקטרופורציה מהדור הבא. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של תאי T, כגון האופן שבו תוצרי גנים ספציפיים מווסתים את התמיינות תאי T ואת התפקוד החיסוני. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מהווה שיטה יעילה ואמינה ביותר לטרנספקציה של תאי T אנושיים ראשוניים ב-sRNAs וברכיבי RNA סינתטיים קטנים אחרים.שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הביולוגיה של תאי Th17 אנושיים, אך ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות, כגון לימפוציטים אחרים מבני אדם או מעכברים. ביום אפס, צפו פלטות תרבית רקמה בעלות שישה בארות ב-1.5 milliliters לכל בארה של antihuman CD3 ו-antihuman CD28 ב-PBS עם סידן ומגנזיום למשך שעתיים לפחות ב-37 degrees Celsius. לאחר בידוד ושטיפה של תאים חד גרעיים מדם טבילי, או CBMCs, בצעו בידוד של תאי T חיוביים ל-CD4 באמצעות ברירה שלילית תוך שימוש בערכה מסחרית לבידוד תאי T חיוביים ל-CD4 אנושיים.הוסיפו באפר בידוד ותלה את התאים החד גרעיניים (mononuclear cells). העבירו את התאים לשפחור חדש של 5 ml, ולאחר מכן הוסיפו 100 µL של סרום עגל עוברי (fetal bovine serum, או FBS) ו-100 µL של תערובת הנוגדנים לכל שפחור, ואז הדגירו כל שפחור בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות על שייקר אורביטלי לערבוב יסודי. לאחר ההדגרה, הוסיפו 3 עד 4 ml של באפר בידוד כדי לשטוף את התאים.סבבו את התאים בצנטריפוגה ב-300 ×g למשך שמונה דקות בטמפרטורה של 4 °C כדי לשקיע את התאים. שאבו בזהירות את העלייה. העבירו את החרו지를 המגנטיים למבחנה חדשה והוסיפו נפח שווה של בופר בידוד כדי לשטוף את החרוזים.השתמשו במיקרופיפט של מיליליטר אחד כדי לערבב היטב את החרו지를, ולאחר מכן הניחו את המבחנה במגנט למשך דקה אחת לפחות. שאבו בזהירות את העלייה (supernatant) והשביו שוב את החרוזים המגנטיים בנפח זהה לנפח שהועבר בתחילה לפני השטיפה. הוסיפו 500 microliters של בופר בידוד לכל מבחנה והשביו שוב את התאים, ולאחר מכן הוסיפו 500 microliters של חרוזים מגנטיים שנשטפו מראש.דגרו את התאים עם החרוזיים המגנטיים במשך 15 דקות על שייקר אורביטלי בטמפרטורת החדר כדי להבטיח ערבוב טוב. לאחר הדגירה, באמצעות מיקרופיפט של מיליליטר אחד, בצעו פיפוט יסודי של התאים לפחות 10 פעמים, לאחר מכן הוסיפו שלושה עד ארבעה מיליליטרים של באפר בידוד והניחו כל מבחנה במגנט למשך שתי דקות. העבירו בזהירות את תאי ה-T החיוביים ל-CD4 שנבחרו בברירה שלילית ואשרים נמצאים בתוף למבחנה חדשה.לאחר השלמת בידוד תאי T חיוביים ל-CD4, יש לשמור את התאים על קרח ולספור אותם באמצעות המוציטומיטר. שטפו את הפלטות המצופות בנוגדנים פעמיים עם PBS, ולאחר מכן הוסיפו לכל באר 1.5 milliliters של תערובת כפולה (two X) של מצע להפניית Th17.שאבו בזהירות את הנוזל העליון (supernatant) והשליכו אותו, לאחר מכן השהו מחדש את התאים במצע בסיס נטול סרום (serum free base media) ופזרו את התאים כך שהנפח הסופי יהיה 3 mL לבאר וריכוזם הסופי של הציטוקינים המקטבים יהיה 1X, ואז הכניסו את הצלחות לתוך אינקובטור ב-37 °C וב-5% carbon dioxide למשך יומיים. ביום השני, צפו צלחות תרבית רקמה של 48 בארות ב-250 µL לבאר של antihuman CD3 ו-antihuman CD28 ב-PBS עם סידן ומגנזיום למשך שעתיים לפחות ב-37 °C. להכנת small RNAs לטרנספקציה, העבירו מנה (aliquot) של 1 µL של תמיסת סטוק בריכוז 5 µM של siRNA לשפרוret של מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 mL עבור כל טרנספקציה.יש לשמור את כל המבחנות על קרח. לאחר מכן, יש לשטוף את הפלטות המצופות בנוגדנים פעמיים ב-PBS, ואז להוסיף לכל באר 500 microliters של מצע polarizing Th17 בריכוז one X. לאחר הכנת פלטות התרבית וסוכני הטרנספקציה, יש לתלה את התאים מחדש באמצעות מיקרופיפט של one milliliter, תוך ביצוע פיפטאג עדין אך תוך הבטחה שכל התאים ניתקו מהתחתית של הבארות.רכז את התאים לשפופרת קונית וסבב את השפופרות בצנטריפוגה ב-500 $\times$g למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4°C. שאב בזהירות את העלייה (supernatant) ולאחר מכן השהה מחדש את התאים בלפחות 1 mL של PBS לצורך שטיפה. ספור את תאי ה-Th17 החיים באמצעות המוציטומטר, תוך שימוש בשיטת החרגת trypan blue להערכת החיות, ולאחר מכן השק את התאים בשפופרת מיקרוצנטריפוגה.שאבו בזהירות את העלייה (supernatant) ותלו את התאים מחדש באמצעות בופר התליה (re-suspension buffer) המסופק בערכה. שמרו את התאים בטמפרטורת החדר. הוסיפו 9 µL של תאים ל-1 µL של small RNA בכל מבחנה של מיקרוצנטריפוגה.בצעו פיפטור פעם אחת כדי לערבב את התאים ואת ה-small RNAs לצורך טרנספקציה, ולאחר מכן העבירו את התאים לקצה אלקטרודת הפיפט המסופק. כדי להבטיח טרנספקציה אופטימלית, הימנעו מהחדרת בועות אוויר לקצה אלקטרודת הפיפט לפני הטרנספקציה. אנו מוסיפים 9.5 µL של תרחיף תאים כדי להבטיח שיש מספיק תערובת למניעת היווצרות בועות בפיפט האלקטרופורציה.מלאו את הקובטה המסופקת בשלושה מיליליטר של בופר אלקטרוליטי בטמפרטורת החדר. הניחו את הקובטה בתוך תחנת הפיפט של ה-neon ולאחר מכן מקמו את הפיפט במיקומו בתוך הקובטה. בצעו באופן מיידי אלקטרופורציה לכל תערובת של 10 µL של תאים ו-small RNA.לאחר השלמת האלקטרופורציה, העבירו ישירות את תערובת התאים ל-500 µL של מצע פולריזציה של Th17 בריכוז 1X בבארות מוכנות של פלטת תרבית. לבסוף, הניחו את הפלטות באינקובטור ב-37 °C ו-5% carbon dioxide למשך יומיים נוספים. עבדו בזהירות אך במהירות כדי למנוע מוות של תאים.אם ישנם דגימות רבות להעברה באמצעות אלקטרופורציה, ניתן לאסוף את התאים ולהעביר להם את החומר (טרנספקציה) בקבוצות. תרשים קונטור זה מראה שתאי T שגודלו בתנאי קיטוב של Th17 ביטאו את קולטן הכימוקין, CCR6, ואת גורם השעתוק, ROR gamma T, אשר לא בוטאו כאשר תאי T גודלו בתנאים שאינם מקטבים. תאי T שגודלו בתנאי קיטוב של Th17 ייצרו גם IL-17A עם גירוי חוזר, אך לא תחת תנאי ThN.דיפרנציאציה של תאי Th17 עדיין מתרחשת לאחר טרנספקציה עם small RNAs, אך בניסויים מסוימים נצפתה ירידה בתדירות הייצור של IL-17A. הדבר ממחיש את החשיבות של שימוש בביקרת small RNA בעלת כימיה תואמת לצורך השוואה בתוך כל ניסוי. החיוניות נשמרת לאחר טרנספקציה עם small RNAs ובדרך כלל היא גבוהה מ-70%. טרנספקציה של תאי Th17 אנושיים ביום השני עם מאגר siRNA המכוון לגן PTPRC, המקודד ל-CD45, הפחיתה באופן משמעותי את הביטוי של CD45 בהשוואה ל-siRNA ביקורת בעל כימיה תואמת.ההסטה החד-מודאלית של האוכלוסייה בביטוי CD45, הנראית כאן, מעידה על יעילות טרנספקציה של כמעט 100%. להפחתת ביטוי ROR gamma T באמצעות RNAi הייתה השפעה תפקודית, שכן תאים אלו הראו ייצור מופחת של IL-17A בהשוואה לתאים שעברו טרנספקציה עם siRNA בקרה. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מבצעים טרנספקציה של תאי Th17 אנושיים שפולריזו in vitro עם RNA קצר באמצעות אלקטרופורציה מהדור הבא.

small-rna-transfection-primary-human-th17-cells-next-generation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

הליך זה מתאר כיצד להקים ראשוני בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine ואחריו transfection באמצעות Pulser ג'ין מערכת MXCell electroporation.

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

אנו מציגים תפוקה גבוהה פרוטוקול אופטימיזציה שלנו nucleofection כדרך יעילה של transfecting העיקרי האדם מונוציטים הנגזרות תאים דנדריטים עם ה-DNA או פלסמיד siRNA או ללא גרימת התבגרות התא. בנוסף, אנו מספקים ראיות השתקת siRNA מוצלח של הגן ממוקד חבל, אני ב-mRNA והן רמות החלבון.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה ואמינה לtransfect מקרופאגים THP-1 אנושיים עם siRNA או DNA פלסמיד על ידי electroporation עם יעילות transfection גבוהה תוך שמירה על חיוניות תא גבוהה ויכולת מקרופאג מלאה לבידול וקיטוב.

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

ניצול של Cas9 preassembled ribonucleoprotein מורכבים (RNP) היא שיטה חזקה לעריכת הגנום מדויק, יעיל. כאן, אנחנו להדגיש השירות שלה על פני מגוון רחב של תאים, אורגניזמים, כולל תאים אנושיים ראשי שני קלאסי והעתידיים דגם אורגניזמים.

הגנום משופרת עריכה עם Cas9 Ribonucleoprotein שונים תאים ואורגניזמים

פיתחנו פרוטוקול לטרנספקציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים על ידי אלקטרופורציה עם הגן המקודד גורם שמקורו באפיתל פיגמנטי (PEDF) באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת (SB). העברה מוצלחת הודגמה על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR), אימונובלוטינג ובדיקת אימונוסורבנט הקשורה לאנזים (ELISA).

שינוי גנטי מבוסס אלקטרופורציה של תאי אפיתל פיגמנט אנושיים ראשוניים באמצעות מערכת הטרנספוזון של היפהפייה הנרדמת

אנו מציגים שיטה לתרבית ועריכה גנטית של תאי מקוק B רזוס ראשוניים באמצעות CRISPR/Cas9 וסרוטיפ 6 הקשור לנגיף אדנו רקומביננטי לחקר טיפולים בתאי B.

עריכה גנטית של תאי Rhesus Macaque B ראשוניים

אנו מציגים פרוטוקול להתמרה רטרו-ויראלית של RNA מנחה לתאי T ראשוניים מעכברים טרנסגניים Cas9, המספקים חלופה יעילה לעריכת גנים בחקר התמיינות Th17.

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה ליצירה ובדיקה של תאי T רגולטוריים של קולטני אנטיגן כימריים אנושיים (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

פרוטוקול מפורט מסופק לשימוש בטכנולוגיית CRISPR/Cas9 כדי להשיג דפיקה ממוקדת יעילה ביותר של מבנים גדולים ומולטי-ציסטרוניים בתאי T אנושיים ראשוניים באמצעות מסלול תיקון ה-DNA בתיווך הומולוגיה (HMEJ). תאי T המהונדסים עם פרוטוקול זה הניתן להתאמה ל-cGMP שומרים על התרחבות תאים מצוינת, ציטוטוקסיות וייצור ציטוקינים.

הנדסה לא ויראלית של תאי T אנושיים ראשוניים באמצעות אינטגרציה ממוקדת בתיווך הומולוגיה של תבניות DNA גדולות

העברת עורכי גנום כ-RNA היא אמצעי עוצמתי במיוחד לשינוי הגנומים של תאי יונקים ראשוניים וקווי תאים. מטרת הפרוטוקול היא להעביר עורכי גנום כ-mRNA לתאים ראשוניים ולקווי תאים ביונקים, ולאחר מכן ריצוף וניתוח ממוקדים של Illumina כדי לכמת את תוצאות העריכה.

עריכת גנום בתאי יונקים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה של RNA עורך

למד שיטת electroporation מתקדמת לטרנספקציה של תאי TH17 אנושיים ראשוניים עם RNA קטן. טכניקה זו מאפשרת חקר ביולוגיה של תאי T, רגולציה של גנים ותפקוד חיסוני ביעילות גבוהה.

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

גלה סרטונים נוספים