Name: הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 10 s
Description: למדו את שיטת הביטוי והטיהור של S100A12 בצורתו הפעילה כדי למדוד פעילות אנטי מיקרוביאלית כנגד H. pylori. פרוטוקול זה מספק תפוקות גבוהות של דימר S100A12 טהור ויציב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי המחלקה לענייני יוצאי צבא קריירה פרס פיתוח 1IK2BX001701, CTSA פרס UL1TR000445 מהמרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום, הקרן הלאומית למדע פרסים 1547757 ו 1400969, ומענק NIH GM05551. התוכן שלה הם באחריותם הבלעדית של המחברים ואינם מייצגים בהכרח דעות רשמיות של המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום או המכונים הלאומיים לבריאות.

1. ביטוי של S100A12 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרה המוסמכת BL21 DE3 תאים עם pGEMEX-S100a12 פלסמיד באמצעות תקן סטנדרטי חום ההלם 18 . הוסף 1 עד 5 μL של פלסמיד ל 50 μL של חיידקים בצינור microcentrifuge על הקרח. דגירה במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלם חום התאים ב 42 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים על הקרח במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μL של מדיה SOC לתאים. דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רעד בסל&quot;ד 250 על שייקר מסלולית עבור 1 ח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 150 μL של התגובה טרנספורמציה על בינוני LB- אגר (בתוספת 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​אמפיצילין). לדגור על 12-16 שעות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מושבה אחת. לחסן 2 מ&quot;ל של LB (בתוספת 100 מיקרוגרם / mL ampicillin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עבור 4-6 שעות על 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולית (300 סל&quot;ד). OD 600 צריך לקרוא בין 1-3 ספיגת יחידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μL של תרבות Starter ל 50 מ&quot;ל של ZYM-5052 autoinduהתקשורת ction 26 בתוספת 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של אמפיצילין. עבור אוורור הטוב ביותר ביטוי מקסימלי, להשתמש 250 מ&quot;ל מבולבל בקבוק ארלנמאייר. לנער (300 סל&quot;ד) עבור 24 שעות, על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ההשעיה חיידקי לצינור צנטריפוגות. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה (4 XG, 10 דקות) ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את המדיה, מדגם יומן, ואת הדבק לאחסן חנות ב -80 מעלות צלזיוס. המדגם יציב במשך שנים. </li></ol> 2. טיהור של S100A12 באמצעות כרומטוגרפיה בלחץ נמוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 30 מ&quot;ל של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sonicate ההשעיה על קרח לתאי lyse. השתמש ~ 20 W פלט, 5 על 5 ו 5 את מחזור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון צינורות צנטריפוגה במהירות גבוהה. להבהיר את lysate התא על ידי צנטריפוגה, 20,000 xg במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את supernatant ולהעביר כוס נקי 100 מ&quot;ל פוליפרופילן. מגניב את הפתרון על ידי הנחת כוס על הקרח. מוסיפים מערבביםR ולאט לאט להוסיף 11.20 גרם של אמוניום סולפט. אפשר פתרון לערבב על קרח במשך 1 שעות נוספות. זה תיצור פתרון 60% של אמוניום גופרתי ו להאיץ את רוב E. חלבונים אנדוגניים. S100A12 יישאר מסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון ב 4 ° C, 20,000 xg במשך 20 דקות כדי גלולה החלבון זירז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את supernatant ולהעביר צינורות דיאליזה (MWCO 3,500 kDa). Dialyze נגד 1 L של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0 ב 4 ° C. לשנות את המאגר דיאליזה פעמיים. אפשר 4 שעות בין השינויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אניון חילופי כרומטוגרפיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כרומטוגרפיה על מערכת לחץ נמוך. קצב זרימה אופייני הוא 1 מ&quot;ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן עמודה 5 מ&quot;ל Sepharose עם 10 מ&quot;ל של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ~ 40 מ&quot;ל של פתרון S100A12 באמצעות משאבת מדגם (לאסוף את הזרימה דרך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הטור עם 10 מ&quot;ל של 20 מ&quot;מ טריס, pH 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את העמודה עם שיפוע 0-30% (BuFfer B הוא 20 מ&quot;מ טריס, pH 8.0, 1 M NaCl) על 19 כרכים טור (קורות חיים, 95 מ&quot;ל). איסוף 5 מ&quot;ל שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot 10 μL של כל חלק ולנתח באמצעות MES SDS PAGE עם מכתים Coomassie. הפעל ג&#39;ל באמצעות מתח קבוע (20 V / cm) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים המכילים S100A12. S100A12 פועל ב ~ 10 חלבון kDa על ג&#39;ל denaturing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרוכזים שברים ל 5 מ&quot;ל באמצעות מכשיר ultrafiltration (MWCO 10 kDa). צנטריפוגה ב XG 3000 במשך 8 דקות ~. קח את החלק העליון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כרומטוגרפיה הדרת גודל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את העמודה S75 עם 1 קורות חיים (120 מ&quot;ל) של 20 מ&quot;מ טריס pH 8, 100 mM NaCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק &lt;5 מ&quot;ל של שברים מרוכזים S100A12 (מתוך חילופי יונים כרומטוגרפיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את הטור בקצב זרימה של 1 מ&quot;ל / מ מעל 120 מ&quot;ל. איסוף 5 מ&quot;ל שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot 10 μL של כל חלק ולנתח באמצעות SDS PAGE עם מכתים Coomassie. אימות זהות חלבון באמצעותכתם המערבי או ספקטרומטריית מסה (מחושב המסה המולקולארית של יחידת משנה monomeric 10,575.0 דה, נמדד 10575.4 דה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת שברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את ספיגת החלבון 280 באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש במאגר ה- SEC כחסר. מקדם הכחדה מחושב עבור S100A12 homodimer הוא 5960 M -1 ס&quot;מ -1 . הערה: תשואות אופייניות הם 35-45 מ&quot;ג של S100A12 לכל 50 מ&quot;ל של התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot S100A12 לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל (1 מ&quot;ג / צינור), הקפאה פלאש בחנקן נוזלי לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 3. פעילות אנטי מיקרוביאלית Assays <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פס H. pylori זן G27 על לוחות אגר טריפטי אגר בתוספת 5% כבשים דם (צלחות אגר דם). לגדול 2-3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן H. pylori לתוך מרק ברוסלה בתוספת 1x כולסטרול. תרבות מעללילה רועד (250 סל&quot;ד) ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל H. pylori 1:10 לתוך 50% מרק ברוסלה, 50% חיץ calprotectin בתוספת 1x כולסטרול ותרבות בינונית או בתוספת של 100 מיקרומטר אבץ כלוריד פלוס 0, 100 או 1000 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של S100A12 מטוהרים. תרבות לילה רועד (250 סל&quot;ד) ב 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לבצע דילולים סדרתי צלחת על צלחות אגר דם. אפשר מושבות חיידקים לגדול במשך 2-3 ימים על 37 מעלות צלזיוס באוויר בחדר בתוספת 5% פחמן דו חמצני. למנות את המושבה להרכיב יחידות לחשב את הגידול החיידקי בנוכחות או היעדר של S100A12 ו / או אקסוגני אקס. </li></ol>

<ol><li>Schiopu, A., Cotoi, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A8+and+S100A9%3A+DAMPs+at+the+crossroads+between+innate+immunity%2C+traditional+risk+factors%2C+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease.</a> Mediators Inflamm. 2013, 828354(2013).</li>
<li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A9+induced+inflammatory+responses+are+mediated+by+distinct+damage+associated+molecular+patterns+%28DAMP%29+receptors+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo.</a> PLoS One. 10 (2), e0115828(2015).</li>
<li>Chernov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium-binding+proteins+S100A8+and+S100A9+initiate+the+early+inflammatory+program+in+injured+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).</li>
<li>Fanjul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+MRP8+and+MRP14+in+pancreatic+cell+lines%3A+differential+expression+and+localization+in+CFPAC-1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells.</a> Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).</li>
<li>Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-inflammatory+S100A8+and+S100A9+proteins%3A+self-assembly+into+multifunctional+native+and+amyloid+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes.</a> Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).</li>
<li>Smith, S. P., Shaw, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change-in-hand+mechanism+for+S100+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A change-in-hand mechanism for S100 signalling.</a> Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).</li>
<li>Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nrc/journal/v15/n2/full/nrc3893.html">S100 proteins in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).</li>
<li>Leclerc, E., Heizmann, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B%2FZn2%2B+signaling+S100+proteins+and+RAGE+in+translational+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Schol+Ed%29%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine.</a> Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).</li>
<li>Goyette, J., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation-associated+S100+proteins%3A+new+mechanisms+that+regulate+function%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function.</a> Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+immunity+beyond+iron%3A+a+role+for+manganese+and+zinc%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc.</a> Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).</li>
<li>Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+Immunity%3A+S100+Proteins+at+the+Host-Pathogen+Interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface.</a> J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).</li>
<li>Realegeno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100A12+Is+Part+of+the+Antimicrobial+Network+against+Mycobacterium+leprae+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages.</a> PLoS Pathog. 12 (6), e1005705(2016).</li>
<li>Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+Calgranulins+in+inflammatory+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">S100 Calgranulins in inflammatory arthritis.</a> Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).</li>
<li>Moroz, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+S100A12-copper+complex%3A+implications+for+host-parasite+defence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).</li>
<li>Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structures+of+human+S100A12+in+apo+form+and+in+complex+with+zinc%3A+new+insights+into+S100A12+oligomerisation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation.</a> J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).</li>
<li>Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+structural+states+of+S100A12%3A+A+key+to+its+functional+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity.</a> Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).</li>
<li>Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ions+Tune+the+Zinc-Sequestering+Properties+and+Antimicrobial+Activity+of+Human+S100A12%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12.</a> Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).</li>
<li>Haley, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Antimicrobial+Protein+Calgranulin+C+Participates+in+Control+of+Helicobacter+pylori+Growth+and+Regulation+of+Virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence.</a> Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).</li>
<li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).</li>
<li>Tham, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+genotypes%2C+host+factors%2C+and+gastric+mucosal+histopathology+in+peptic+ulcer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease.</a> Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).</li>
<li>Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori-associated+gastritis+and+primary+B-cell+gastric+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma.</a> Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).</li>
<li>Correa, P., Piazuelo, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastric+precancerous+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dig+Dis%22%5BJournal%5D)">The gastric precancerous cascade.</a> J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).</li>
<li>de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer%3A+epidemiology+and+risk+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer: epidemiology and risk factors.</a> Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).</li>
<li>Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+Helicobacter+pylori+infection+before+initiation+of+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunol+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+protein+calprotectin+modulates+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system+via+zinc+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration.</a> PLoS Pathog. 10 (10), e1004450(2014).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+clones+and+auto-induction+for+protein+production+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli.</a> Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).</li>
<li>Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+transition+metals+to+S100+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of transition metals to S100 proteins.</a> Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).</li>
<li>Corbin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+chelation+and+inhibition+of+bacterial+growth+in+tissue+abscesses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses.</a> Science. 319 (5865), 962-965 (2008).</li>
<li>Kehl-Fie, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient+metal+sequestration+by+calprotectin+inhibits+bacterial+superoxide+defense%2C+enhancing+neutrophil+killing+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus.</a> Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).</li>
<li>Liu, J. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+sequestration+by+the+neutrophil+protein+calprotectin+enhances+Salmonella+growth+in+the+inflamed+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut.</a> Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).</li>
<li>Damo, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+manganese+sequestration+by+calprotectin+and+roles+in+the+innate+immune+response+to+invading+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).</li>
<li>Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+calprotectin+is+an+iron-sequestering+host-defense+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein.</a> Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).</li>
<li>Gaddy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+Resists+the+Antimicrobial+Activity+of+Calprotectin+via+Lipid+A+Modification+and+Associated+Biofilm+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation.</a> MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).</li>
<li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media.</a> J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li>
<li>Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+calgranulin+proteins+S100A8%2C+S100A9+and+S100A12+are+expressed+in+the+inflamed+gastric+mucosa+of+Helicobacter+pylori-infected+children%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children.</a> Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).</li>
<li>Wilkie-Grantham, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקול יעיל הן ביטוי וטיהור האדם S100A12 מוצג. מערכת ביטוי קולי קולי הוא הכלי הנפוץ ביותר המשמש לייצור חלבונים רקומביננטי, במיוחד כאשר כמויות מ&quot;ג נדרשים מחקרים ביוכימיים וביופיסיקליים. שיפור המפתח של הנוהל המתואר כאן הוא השימוש של אוטומטי אינדוקציה מדיה 26 אשר מגדילה את התשואה של חלבון מטוהרים על ידי גורם של כמעט שלושים לעומת ביטוי עם תקן Luria-Media מדיה 18 . בנוסף, אוטומטי אינדוקציה התקשורת מאוד מפשט את העבודה ביטוי...

S100 חלבונים הם מחלקה של EF יד המשפחה של סידן מחייב חלבונים עם מגוון רחב של פונקציות 1 . הם באים לידי ביטוי באופן רקמות תא ספציפי, לווסת מגוון רחב של פונקציות הסלולר 2 , 3 . ייחודי חלבונים סידן מחייב, חלבונים S100 התערוכה הן פונקציות תאיים תאיים 4 , 5 . בתוך התא, Ca 2 + מחייב גורם לשינוי קונפורמציה החושפת משטח הידרופובי כי מטרות ספציפיות חלבון מחייב שותפים 6 . מנגנון תאיים זה מסדיר תהליכים חשובים כגון התפשטות תאים, התמיינות ואנרגיה מטבוליזם. בסביבה תאית, S100 חלבונים התערוכה שתי פונקציות 7 . באחד מהם, הם פועלים כנזק הנלווה לחלבון המולקולרי (DAMP) ויוצרים פרו-דלקתהתגובה החיסונית אטורי באמצעות אינטראקציה עם קולטנים הכרה דפוס 8 , 9 . בנוסף, כמה חברים של מחלקה S100 חלבון sequester המעבר מתכות, פונקציה המשמשת להרעב פתוגנים חיידקים בתהליך המכונה החסינות התזונתיים 10 , 11 . S100A12 (הידוע גם בשם calgranulin C ו- EN-RAGE) מתבטאת מאוד מקרופאגים ונויטרופילים ו זוהו כסימן ביולוגי פוטנציאלי למחלות דלקתיות 12 , 13 . בנוסף סידן מחייב באתרי EF-Hand שלה, S100A12 יש שני זיקה גבוהה מתכת מחייב אתרים הממוקם בקצה השני של ממשק dimer 14 , 15 . כל אתר מחייב מורכב משלושה שאריות histidine ושאריות חומצה אחת aspartic והוא יכול chelate אבץ או נחושת &lt;Sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . לאחרונה, דיווחנו כי רעב אבץ תלוי S100A12 חשוב בויסות הצמיחה של הליקובקטר פילורי ופעילותם של גורמים ארסתיים דלקתיים 18 . H. pylori מדביק את הבטן של כמחצית מאוכלוסיית האדם בעולם; מה שהופך אותו ללא ספק לאחד הפתוגנים החיידקים המצליחים ביותר 19 . זיהום עם H. pylori יכול להוביל לתוצאות משמעותיות של מחלת קיבה, כולל גסטריטיס, כיב פפטי ותריסריון, רירית לימפומה לימפומה (MALT), וכן אדנוקרצינומה קיבה פולשנית (סרטן הקיבה). סרטן הקיבה הוא הגורם המוביל למוות שאינו קשור לסרטן בסרטן בעולם, וגורם הסיכון הגדול ביותר הקשור לסרטן הקיבה הוא זיהום ב- H. pylori . H. pylori נמשכת נישה קיבה למרות robuSt התגובה החיסונית הפתוגן, מדגיש את הצורך בהבנה טובה יותר של מנגנוני החיסון של שליטה זה זיהום חיידקי 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori - דלקת נלווה מאופיינת בחדירה עמוקה של תאים פולימורפונומיים, או נויטרופילים, המפקידים רפרטואר של חלבונים אנטי-מיקרוביאליים, כולל S100A12, באתר ההדבקה 18 , 24 , 25 . במאמץ להבין את הדיאלוג המורכב בין המארח לבין הפתוגן, ביקשנו לחדד את הטכניקה לטהר את S100A12 ולהשתמש בה כדי לחקור את המיקרוביאליות שמשפיעה על הפתוגן הרלוונטי מבחינה רפואית. פרוטוקול להלן מתאר טכניקה משופרת לטיהור S100A12 במצב פעיל ביולוגית שלה; המסוגל לחייב מתכות מזין עם אפיני גבוההTy ו chelating אותם מן הפולש מיקרואורגניזמים. יתר על כן, השיטות להלן מדגישות את התועלת של חלבון זה כמגיב קריטי כדי לחקור את המנגנון שבו מולקולות מולקולות מולדות להגביל את הצמיחה של פתוגנים חיידקיים. S100A- חלבונים משפחתיים זכו להערכה כקבוצה חשובה של מולקולות מערכת החיסון המולדת אשר משתתפים איתות החיסון וכן ההגנה המארח 27 . המחקר הטוב ביותר של אלה הוא calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin הוא נויטרופיל הקשורים חלבון אשר יוצר heterodimer של S100A8 ו S100A9 יחידות משנה אשר נקשר מתכות המעבר בממשק dimer 31 . Calprotectin הוכח להחזיק שני אתרי מחייב מתכת: אתר 1 יכול לקשור Zn 2 + , Mn 2 + , או Fe 2 + , ואת האתר 2 יכול<html> כץ Zn 2+ 31 , 32 . דיווחים רבים הוכיחו שלקאלפרוקטין יש פעילות אנטי-מיקרוביאלית נגד גורמים שונים כגון Staphylococcus aureus , קנדידה אלביקנס , Acinetobacter baumannii , דלקת ריאות של קלבסילה , Escherichia coli ו- H. pylori , וכי ההשפעות המעכבות נובעות מפעולת הקלציה המתכתית של calprotectin 25 , 28 , חשוב מחקרים קודמים הראו כי פעילות ה- Calprotectin מפעילה מספר רב של פעילויות על H. pylori, כולל שינוי השומנים מבנה בקרום החיצוני, הדחקה של מערכת הפרשת הטיפוס הרביעי (שהיא גורם ארסי פרו-דלקתני משמעותי בתוך H. pylori ), יצירת היווצרות ביופילם והדחקה H. pylori הצמיחה ואת הכדאיות באופן תלוי מינוןClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . יתר על כן, בדיקות גנטיות וביוכימיות חשפו את הפעילות האנטיבקטריאלית של קלפרוטקטין כנגד H. pylori נבעה ברובה מיכולתה לקשור אבץ מזין 25 . H. pylori דורש אבץ, כפי שנקבע על ידי מחקר קודם אשר ניצל בינוני מוגדר כימית כדי לוודא את הדרישות micronutrient עבור הפתוגן הזה לגדול ולהתרבות 34 . בנוסף, קלפרוקטין היה שופע מאוד בתוך רקמות נגועות ב H. pylori , והוא קשור לחדירים נויטרופילים, דבר המצביע על כך שהמארח עשוי להעסיק את ה- Calprotectin כאסטרטגיה אנטי-מיקרוביאלית במהלך ההדבקה ודלקת שלאחר מכן , 25 , 35 . עדויות חדשות מ טכניקות הקרנה proteomics unbiased עולה כי בתנאים בהם מינים חמצן תגובתי בשפע, calprotecפח עובר שינויים לאחר טרנסלוציאציה אשר משנים את האתר מחייב hexa histidine, ובכך מעכב את הפעילות מחייב מתכת של חלבון 36 . ככזה, שיערנו כי חלבונים אחרים של משפחת S100A בין הרפרטואר הרחב של המולקולות הללו עשויים לשמש ככלי עזר-מתכת עזר. בחרנו את S100A12 לצורך מחקר נוסף, משום שהוא לא זוהה במסך הנ&quot;ל לתמורות פוסט-טרנסלציוניות, יש לו את היכולת לקשור אבץ, והוא שופע מאוד ברקמות אנושיות הנגזרות מאנשים של H. pylori- infected. העבודה שלנו מצביעה על כך ש- S100A12 יכול לעכב את צמיחת ה- H. pylori ואת הכדאיות במינון תלוי במינון G27 של H. pylori , וכי פעילות מיקרוביאלית של חלבון זה יכולה להפוך על ידי תוספת של אבץ מזין עודף. עבודה זו משלימה את העבודה הקודמת שלנו המעידה על פעילות מיקרוביאלית של S100A12 נגד PMSS1 ו- 7.13 זנים של H. pylori , מדגים פעילות אנטיבקטריאלית רחבה נגד מבודדים קליניים רבים זנים מותאמים למעבדה של H. pylori 18 . יחד, תוצאות אלה מאשרות את החשיבות של S100A12 כמנגנון לבקרה על צמיחה וחיידקים בקטריאליים באמצעות חסינות תזונתיים. מחקרים עתידיים על אינטראקציה חשובה זו של חיידק מארח יכולים לכלול ניצול של הפעילות של S100A12 כדי להפחית את נטל החיידקים ברקמות המארחות, או לקבוע את תרומתו של חלבון זה לחיבור החיסון בהקשר של זיהום H. pylori .

<table><tbody><tr><td><חזק>S100A12 ביטוי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>תאי ביטוי</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL 21 (DE3) תאים מוכשרים</td><td>ניו אינגלנד ביולאבס</td><td>C25271</td><td></td></tr><tr><td>רכיבי</td><td></td><td></td><td></td>מדיום אינדוקציה אוטומטית</tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>Y20020-250.0</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Research Products International</td><td>S23020-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060-250.0</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2877</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td>Research <td>Products International</td><td>M65240-100.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</תת></td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>S23100-500.0</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td>Research <td>Products International</td><td>P41200-500.0</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Research Products International</td><td>A20424-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Research Products International</td><td>S25150-500.0</td><td></td></tr><tr><td>מוצרי מחקר</td><td>גליצרול</td> בינלאומי <td>G22020-1.0</td><td></td></tr><tr>מוצרי <td>מחקר</td><td>D-גלוקוז</td> בינלאומי <td>G32040-500.0</td><td></td></tr><tr><td>לקטוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>L2643</td><td></td></tr><tr><td><חזק>סוכן בחירה</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>מוצרי מחקר בינלאומיים</td><td>A40040-5.0<</td><td></td></tr><tr><td>חזק>S100A12 טיהור</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AKTA התחל מערכת כרומטוגרפיה</td><td>GE</td><td>29-220-94</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap Q זרימה מהירה</td><td>GE</td><td>17-5156-01</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td><td>GE</td><td>17-1166-01</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר Nanodrop lite</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>ND-LITE</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base Research</td><td>Products International</td><td>T60040-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>H. pylori Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blood agar plates</td><td>Lab Supply Company</td><td>BBL221261</td><td></td></tr><tr><td>מרק ברוצלה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>B3051</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול (250x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>אבץ כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>229997</td><td></td></tr></tbody></table>

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של s100a12

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

חלבונים Calgranulin הם מתווכים חשובים של חסינות מולדת הם חברי המעמד S100 של המשפחה EF יד של חלבונים מחייב סידן. כמה חלבונים S100 יש את היכולת לקשור מתכות המעבר עם זיקה גבוהה ביעילות לשלוף אותם מן הפתוג חיידקים פתוגנים בתהליך זה כינה &quot;חסינות תזונתיים&quot;. S100A12 (EN-RAGE) מחייב הן אבץ והן נחושת, והוא שופע בתאי חיסון מולדים כגון מקרופאגים ונויטרופילים. אנו מדווחים על שיטה מעודנת לביטוי, העשרה וטיהור של S100A12 בתצורה הפעילה והמתכתבת. ניצול של חלבון זה בצמיחה חיידקים וניתוחי חיוניות מגלה כי S100A12 יש פעילות מיקרוביאלית נגד הפתוגן חיידק , Helicobacter pylori . הפעילות המיקרוביאלית מבוססת על פעילות מחייב אבץ של S100A12, אשר chelates אבץ מזין, ובכך רעב H. pylori אשר דורש אבץ לצמיחה pרוליפרציה.

S100A12 ביטוי וטיהור טיהור שלושה שלבים המיוצר ~ 40 מ&quot;ג של רקומביננטי S100A12 מ 50 מ&quot;ל של תרבות חיידקים. הצעד הראשון היה משקעים סולפט אמוניום של חלבונים אנדוגניים E. coli . צעד זה היה ואחריו anion חילופי כרומטוגרפיה ( איור 1 א ). החלבון הוא במעקב על ידי SDS-PAGE מוכתם עם כחול מבריק Coomassie ( <stron...

כאן, אנו מציגים שיטה להביע ולטהר S100A12 (calgranulin C). אנו מתארים פרוטוקול למדידת פעילות אנטי מיקרוביאלית שלו נגד הפתוגן האנושי H. pylori .

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להקל על הבידוד והטיהור של S100A12 בצורתו הפעילה, על מנת שניתן יהיה להשתמש בו לבדיקות אנטי-מיקרוביאליות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון מהו תפקידו של S100A12, פפטיד אנטי-מיקרוביאלי המיוצר כמענה לזיהום על ידי חיידקים פתוגניים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהפרוטוקול המותאם שלנו מספק תנובה גבוהה של דימר S100A12 טהור ויציב, בעל יכולת לקשור ולשכוב מתכיות תזונתיות.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, כיוון ש-S100A12 יוצר אוליגומרים בגדלים שונים בתנאים מסוימים, ולאוליגומרים אלו יש פעילות אנטי-מיקרוביאלית מופחתת in vitro. הרעיון לשיטה זו עלה לנו לראשונה כאשר התחלנו לטהר ולחקור את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של חלבון קשור ממשפחת S100A הנקרא calprotectin. הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית לשלבי הניקוי הסופיים של הגודל והעמודה.ובדיקות האנטי-מיקרוביאליות הן חשובות להצלחתו של תהליך זה. כדי להתחיל בהליך זה, בצע טרנספורמציה לתאי BL21 DE3 קומפטנטיים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הוסף 1 עד 5 µL של פלסמיד ל-50 µL של בקטריות בתוך מבחנה למיקרו-צנטריפוגה על קרח.דגרו למשך 20 דקות. לאחר מכן, בצעו הלם חום לתאים בטמפרטורה של 42 °C למשך 30 שניות. דגרו על קרח למשך שתי דקות.לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של מצע SOC. דגרו בטמפרטורה של 37 °C במנער אורביטלי במהירות של 250 rpm למשך שעה אחת. לאחר מכן, פזרו 150 µL מתגובת הטרנספורמציה על מצע LB arga, המועשר ב-100 µg/mL של ampicillin.דגרו למשך 12 עד 16 שעות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר הדגירה, בחרו מושבה בודדת והחדירו אותה לשני מיליליטר של מצע LB המועשר ב-ampicillin. דגרו בטמפרטורה של 37 °C במנער אורביטלי, במהירות של 300 rpm, למשך ארבע עד שש שעות.לאחר מכן, הוסיפו 500 µL של תרבית התנעה ל-50 mL של מצע autoinduction מסוג ZYM 5052 המועשר ב-ampicillin. נערה ב-300 rpm למשך 24 שעות ב-37 °C. לאחר מכן, העבירו את תרחיף החיידקים לשפופרת צנטריפוגה.סבב במרכזפוגה במהירות של 4,000 ×g ובטמפרטורה של 4°C למשך 10 דקות. לאחר הסבב, שפך את המצע, רשום את הדגימה ואחסן את משחת התאים בטמפרטורה של 80°C- . כדי להתחיל, השהה מחדש את משחת התאים ב-30 milliliters של tris בריכוז 20 millimolar, ב-pH 8.0 . לאחר מכן, בצע סוניקציה לתסמין על קרח בהספק של 20 watts, במחזורים של חמש שניות פעולה וחמש שניות מנוחה למשך חמש דקות כדי ללוטץ את התאים.העבירו את התמיסה שעברה סוניקציה לאنبובות צנטריפוגה איכותיות. צנטריפוגו ב-20,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות כדי להבהיר את ליסאט התאים. לאחר מכן, העבירו את הנוזל העליון (supernatant) לכלי בקר מポリפרופילן נקי בנפח 100 ml.הנח את הכוס על קרח כדי לצנן את התמיסה. הוסף מגנט ערבוב והוסף לאט 11.20 grams של ammonium sulfate. ערבב את התמיסה על קרח למשך שעה אחת.לאחר מכן, העבירו את התמיסה למבחנות צנטריפוגה וסובבו בצנטריפוגה ב-20,000 ×g בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות כדי להשקיע את החלבון המשקע. שפכו את הנוזל העליון (supernatant) לתוך שקיקי דיאליזה. בצעו דיאליזה כנגד ליטר אחד של 20 mM Tris בטמפרטורה של 4 °C וב-pH 8.0. החליפו את בופר הדיאליזה פעמיים, עם מרווח של ארבע שעות בין ההחלפות.לאחר מכן, יש להביא לעדשוי (equilibrate) עמודת sepharose של 5 millilitres באמצעות 10 millilitres של 20 millimolar tris. בעזרת משאבת הדגימות, טען כ-40 millilitres של תמיסת S100A12. אסוף את השטף (flow through).לאחר מכן, שטפו את העמודה עם 20 millimolar tris. בצעו פיתוח של העמודה באמצעות גרדיאנט של 0% עד 30% לאורך 19 נפחי עמודה. אספו פרקציות של חמישה milliliter.השתמש ב-MES SDS page עם צביעת coomassie כדי לנתח מנה של 10 µL מכל פראקציה. לאחר מכן, בודד את הפראקציות המכילות S100A12. באמצעות מכשיר אולטרה-פילטרציה, רכז את הפראקציות לנפח של 5 mL.לאחר מכן, יש להאזן עמודת S75 באמצעות תמיסה של 120 milliliter הכוללת 20 millimolar tris ו-100 millimolar sodium chloride. מזריקים את דגימת חמשת ה-milliliter של הפראקציות המרוכזות. לאחר מכן, מפתחים את העמודה בקצב זרימה של 1 milliliter לדקה לאורך 120 milliliters.אספו פראקציות של חמישה מיליליטר. באמצעות SDS-PAGE עם צביעת coomassie, נתחו אליקוט של 20 microliter מכל דגימה. לאחר מכן, בצעו ולידציה לזהות החלבון ובודדו את הפראקציות כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.لتחילת התהליך, יש לזרות H. pylori לתוך ציר ברוסלה (brucella broth) מועשר ב-1X כולסטרול. יש לדגור למשך לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-250 סבב לדקה (rpm) באוויר מועשר ב-5% פחמן דו-חמצני. יש לדלל את ה-H. pylori ביחס של 1:10 לתוך תערובת של 50% ציר ברוסלה ו-50% באפר קלפרוטקטין (calprotectin buffer) בתוספת 1X כולסטרול.והוסיפו חלבון S100A12 ו/או מתכות חיצוניות לפי הצורך. בדיקות האנטי-מיקרוביאליות הן נקודה קריטית. חשוב להשתמש בבופר קלפרוטקטין (calprotectin buffer) כדי להבטיח את יציבות הדימרים של S100A12, ולספק מצע מינרלי דל במתכות עבור בדיקות הצמיחה הבקטריולוגית, כדי שהחלבון לא יוצף בעודף מיקרו-נוטריאנטים, הנמצאים בדרך כלל במצעים בקטריולוגיים עשירים ומורכבים.ביום למחרת, בצעו דילול סדרתי לדגימות. לאחר מכן, זרעו אותן על צלחות אגר דם. אפשרו למושבות החיידקים לגדול במשך יומיים עד שלושה ימים בטמפרטורה של 37 °C באוויר המועשר ב-5% carbon dioxide.לאחר מכן, חשבו את הצמיחה הבקטריאלית כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. במחקר זה, מוצגת שיטה משופרת לביטוי וניקוי של S100A12 בתצורת קישור המתכת הפעילה שלו. תהליך הניקוי בן שלושת השלבים מתחיל בהסמכה של חלבוני E.coli אנדוגניים באמצעות אמוןיום סולפט, ולאחריה כרומטוגרפיית חלפון אניונית.לאחר מעקב אחר החלבון באמצעות SDS-PAGE עם צבע Coomassie Brilliant Blue, נשלפות הפראקציות המכילות S100A12 לצורך כרומטוגרפיית סמיכה (size exclusion chromatography). S100A12 הוא הומודימר עם 92 חומצות אמינו לכל תת-יחידה, ובעל משקל מולקולרי כולל של כ-21 kilodaltons.לאחר מכן נבדקה הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של S100A12 באמצעות טכניקות כמותיות של תרבית מיקרוביולוגית. ספירת תאי חיידקים העלתה כי חשיפה ל-100 µg/mL של S100A12, בנוכחות או בהיעדר מקור תזונתי חיצוני של אבץ, לא עיכבה באופן משמעותי את חיוניות החיידקים. עם זאת, חשיפה ל-1,000 µg/mL של S100A12 במצע לבדו הובילה לירידה של פי 69 בחיוניות החיידקים.הוספה של מקור חיצוני של אבץ כתחומת תזונה הופכת תוצאה זו, דבר המדגים כי הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של S100A12 תלויה בפעילותו של החלבון בספיחת אבץ. ברגע שהתהליך נלמד, ניתן לבצע את ביטוי החלבון והטהרתו תוך שלושה עד ארבעה ימים, אם הדבר נעשה כראוי. לאחר ביצוע פרוטוקול זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון ספקטרומטריית מסה עם צימוד השראתי, כדי לענות על שאלות נוספות.כיצד בדיוק סקווסטרציה של מתכות מגבילה את הצמיחה המיקרוביאלית? לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום המיקרוביולוגיה לחקור את החסינות התזונתית של H.pylori. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הביטוי, הניקוי וכמות הפעילות של החלבון האנטי-מיקרוביאלי S100A12.אין לשכוח כי עבודה עם H.pylori עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון עבודה במרחב מאושר ברמת בטיחות BS2, בעת ביצוע הליך זה. להשלכות של טכניקה זו יש השפעה על מחלות קיבה, כולל כיבובים, גסטריטיס וקרצינומה נספחית פולשנית.על ידי הבנת תהליכים אלו, נהיה מצוידים טוב יותר לבניית מולקולות אנטימיקרוביאליות חדשניות המכוונות לתהליכים אלו. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הביוכימיה של חלבוני משפחת S100A, ניתן להחיל אותה גם על חקר תפקידם באיתות חיסוני ובמספר תהליכי מחלה, כגון סרטן, דלקת מפרקים ומחלות זיהומיות.

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בסרטון זה, אנו מדגימים טכניקת כרומטוגרפיה של חילופי אניונים לטיהור S100A12 חלבון קושר סידן אנושי בהתבסס על מטען פני השטח נטו של החלבון מתרבית Escherichia coli.

טיהור חלבונים מבוסס כרומטוגרפיה של Anion-Exchange: טכניקת הפרדה לבידוד חלבון מעניין מליזט חיידקי על בסיס מטען נטו

סרטון זה מדגים בדיקה לחקר ציטוטוקסיות של חלבונים המיוצרים על ידי Staphylococcus aureus, חיידק פתוגני, על לויקוציטים פולימורפוגרעיניים אנושיים מבודדים (PMNs). החלבונים ציטוטוקסיים המופרשים יוצרים נקבוביות על קרום התא PMN, וגורמים למוות תאי. לאחר צביעת התאים המתים באמצעות פרופידיום יודיד, מבוצעת ציטומטריית זרימה כדי לכמת את התאים המתים ולהעריך את ציטוטוקסיות החיידקים.

בדיקה עבור ציטוטוקסיות חיידקית חוץ-תאית בתיווך חלבון על PMN

הכנת תמציות תא שמרים איכותיות היא צעד ראשון הכרחי בניתוח של חלבונים בודדים או proteomes שלם. כאן אנו מתארים פרוטוקול homogenization מהיר, יעיל, ואמין לתאי שמרי ניצנים שעבר אופטימיזציה כדי לשמר פונקציות חלבון, אינטראקציות, ולאחר translational שינויים.

הפקת ניצני שמרים וטיהור חלבון לחקר תפקוד, האינטראקציות, ולאחר translational השינויים

כאן, שיטה באמצעות מערכת זיהום קרום חדירה מבוסס כנס כדי לחקור את ההשפעות של Streptolysin S, רעלן מופרש המיוצר על ידי הקבוצה סטרפטוקוקוס, על קרטינוציטים מתוארת. מערכת זו יכולה בקלות להיות מיושמת בחקר חלבונים חיידקיים מופרשים אחרים על סוגי תא מארח שונים במהלך הדבקה.

יישום של קרום חדיר מערכת זיהום כנס מבוססת כדי לחקור את ההשפעות של מופרש בקטריאלי רעלים בתא פונדקאי יונק

הפרוטוקול מציג את Escherichia coli-המבוסס על הלחץ הסלקטיבי השתלבות של חומצות אמינו קאנונית (ncAAs) nisin פפטיד מיקרוביאלית lactococcal. ניתן לשנות את מאפייניו במהלך רקומביננטי ביטוי באמצעות החלפת עם ncAAs הרצוי בתקשורת צמיחה מוגדרים. השינויים הנובעים מכך באתריים ממופים על ידי הצמיחה עיכוב מבחני פלורסצנטיות מיקרוסקופ.

פפטידים מיקרוביאלית המיוצר על ידי ההתאגדות הלחץ הסלקטיבי של חומצות אמינו קאנונית

MALT1 מסדיר מולדת חסינות אך איך זה מתרחש נשאר מעורפל. השתמשנו החומר המדכא paracaspase סלקטיבית MALT1 הטכנולוגי-827 לפענח את התרומה של MALT1 איתות מולדת במורד הזרם של קולטני לקטין דמוי כמו אגרה או C-type, הוכחת MALT1 מסדיר את הייצור של תאים מיאלואידים ציטוקינים, ויוצאת של קולטני לקטין דמוי C-type, באופן סלקטיבי.

תאים מיאלואידים מולדת איתות לשביל רגולציה על-ידי פעילות Paracaspase MALT1

פרוטוקול זה מתאר שיטת טיהור ל-רקומביננטי הסידן מחייב חלבון בחינם S100A12 והוא המושרה היונים שלה עבור גירוי מונוציט אנושי.

טיהור של האדם S100A12 ואת היונים שלה הנגרמת Oligomers עבור גירוי תא החיסון

טיהור התג שלו, דיאליזה, והפעלה מועסקים כדי להגדיל את התשואות של מסיס, מטריצה פעילה metalloproteinase-3 ביטוי חלבון תחום קטליטי בחיידקים. שברי חלבון מנותחים באמצעות ג'ל SDS-PAGE.

ביטוי חיידקי וטיהור של מטריקס אנושי Metalloproteinase-3 באמצעות כרומטוגרפיה זיקה

כתב יד זה מתאר כיצד למסך מוטציות thermostabilizing, לטהר את טרנספורטר הסרוטונין האדם, ליצור נוגדנים זיקה גבוהה, ולגבש במתחם טרנספורטר-נוגדן סרוטונין מאוגד -citalopram S תרופה נגד דיכאון. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם המחקר של מובילי קרום מאתגר אחרים, קולטנים, ותעלות.

Thermostabilization, ביטוי, טיהור, התגבשות של Transporter סרוטונין האדם Bound כדי<em&gt; S</em&gt; -citalopram

מאמר זה מתאר שיטות ספציפיות כדי לקבל כמויות הביוכימי של solubilized-חומרי ניקוי TRPV1 לניתוח spectroscopic. הפרוטוקולים המשולב לספק כלים הביוכימי biophysical זה ניתן להתאים להקל פונקציונלי מבניים ללימודי תעלות היונים בתרבית של סביבה מבוקרת ממברנה.

טיהור, בנייתו מחדש של TRPV1 לניתוח Spectroscopic

למדו את שיטת הביטוי והטיהור של S100A12 בצורתו הפעילה כדי למדוד פעילות אנטי מיקרוביאלית כנגד H. pylori. פרוטוקול זה מספק תפוקות גבוהות של דימר S100A12 טהור ויציב.

הביטוי, טיהור, פעילות אנטי מיקרוביאלית של S100A12

גלה סרטונים נוספים