Name: An במבחנה Assay מחייב Assay כי חוזה חדירה לסמים בשחפת נגעים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: למד את שיטת הדיאליזה המהירה (RED) לחיזוי קישור תרופות לקזאום בנגעי שחפת. הפרוטוקול משתמש במטריצה ממקרופאגים קצפניים כתחליף לקזאום ומאפשר הערכת חדירת אנטימיקרוביאלים ללא מודלים בעלי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים ל- Johnson &amp; Johnson, ל- TB Alliance, ל- Astra Zeneca, ל- Rib-X ול- Trius Therapeutics על אספקת bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid ו- tedized, בהתאמה. ברנדן פרידו, מתיו צימרמן, סטיבן ג&#39;וזווין, אמה ריי-ג&#39;וראדו, ננסי רואל, ליאן לי ודניאלה ויינר סיפקו תמיכה בניתוח MALDI, בשיטות ביואנליטיות, בהכנת תחליף המקרה, בסינתזה כימית ובבידוד של ארנבת ארנבת. עבודה זו התקיימה במימון של קרן ביל ומלינדה גייטס, פרס # OPP1044966 ו OPP1024050 ל V. Dartois, NIH משותפת Instrumentation גרנט S10OD018072, כמו גם מימון משותף של קרן ביל ומלינדה גייטס וולקום Trust עבור מרכז מצוינות עבור אופטימיזציה של עופרת למחלות העולם המתפתח ל P. Wyatt.

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות באישור ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השימוש NIAID (NIH), Bethesda, MD. כל המחקרים היו מעורבים מ שחפת בוצעו במעבדה עם בלימת בטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL-3). 1. ארנב דגם זיהום Caseum אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק ניו זילנד ארנבים לבנים עם שחפת באמצעות מערכת חשיפת תרסיס אף בלבד כפי שתואר לעיל. 12, 13 אפשר זיהום להתקדם במשך 12-16 שבועות. שלווים ארנבים עם 35 מ&quot;ג / ק&quot;ג קטמין 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג xylazine לשריר, להרדים את הארנבים עם 0.22 מ&quot;ל / ק&quot;ג נתרן ו פניטואין נתרן pentobarbital לווריד ולהמשיך עם necropsies. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה אזמל, להסיר ריאות מן ca החזה. מכל אונה ריאה, לנתח את חללים בודדים גרנולומה נמקית גדולה באמצעות איזמל. בזהירות לגרד את caseum מן החלל ואת הקירות גרנולומה. לשקול, להקליט דגימות החנות ב 2 מ&quot;ל בורג כתרים צינורות ב -20 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Gamma- להקרין את דגימות caseum זיהומיות ב 3 MegaRad על קרח יבש כדי להפוך אותם חסרי ובטוח לשימוש במעבדה BSL-2. </li></ol> 2. בשנת הדור גזרתי של Caseum פונדקאי THP-1 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול THP-1 מונוציטים ב RPMI 1640 בינוני (2 מ&quot;מ L- גלוטמין 10% בסרום עוברי בסרום) ב T175 צלוחיות תרבות התא (80 מ&quot;ל / בקבוק). דגירה את צלוחיות באווירה 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התרבות מבקבוק T175 בשני צינורות 50 מ&quot;ל חרוטי ב 150 xg במשך 5 דקות. מחק supernatant ו להשעות את גלולה 10 מ&quot;ל של התקשורת 1640 RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 5 μL של תרבות זו לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל המכיל 45 μL של tכחול. מערבבים היטב לפי pipetting. העברה 10 μL כדי hemocytometer ולספור את מספר monocytes THP-1 קיימא (ללא כתם) באמצעות מיקרוסקופ אור (הגדלה 10X). חישוב מספר תאים קיימא לכל מ&quot;ל של התרבות. לדלל אותו עם התקשורת RPMI לצפיפות הסופית של 1.25 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 40 מ&quot;ל של התרבות על צלחת תרבות גדולה התא (50 x 10 6 תאים / צלחת). הוסף 40 μL של 100 מיקרומטר PMA (פורבול 12-myristate13 אצטט מוכן באתנול) ולאפשר לתאים לדבוק לילה בחממה. הערה: הריכוז הסופי של PMA הוא 100 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל חומצה אולאית טהורה (OA) (0.89 גרם / מ&quot;ל) באתנול לריכוז של 0.1 M ( כלומר 31.7 OA μL ב 968.3 אתנול μL). לדלל את הפתרון הזה טריים מראש חימם מדיה RMPI לריכוז של 10 מ&quot;מ. לדלל את ההשעיה OA ל 0.4 מ&quot;מ (ריכוז עובד הסופי) בינוני RPMI מראש חימם ל 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה הקיימת ולא אתתאים -adhered מן צלחות תרבית תאים ולהוסיף בעדינות 40 מ&quot;ל של 0.4 מ&quot;מ OA אל מקרופאגים THP-1 (THP-M). לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ אור בהגדלה 40x חזותי לאשר הנוכחות של תכלילים גוף שומנים רבים בכל THP-M. הסר את כל מדיום RPMI מן צלחות תרבית תאים בעדינות לשטוף את התאים החסידים פעמים עם בופר פוספט (PBS) בעזרת פיפטה סרולוגיות 50 מיליליטר. הערה: גופים ליפידים להופיע קטן, ברור, מבנים כדוריים בציטופלסמה של THP-M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 40 מ&quot;ל של 5 מ&quot;מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב PBS על כל צלחת. דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרידו את מקרופאגים מקציף (FM) על ידי pipetting מעלה שוב ושוב ושוב על פני השטח של צלחת כולו באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מ&quot;ל. מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי 50 מ&quot;ל ומסובב ב XG 150 עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 10 מ&quot;ל של PBS (לשטוף PBS השלישי) אnd להעביר צינורות חרוטי טרום שקל 15 מ&quot;ל. ספין למטה שוב ב XG 150 עבור 5 דקות. בזהירות לשאוב supernatant בעזרת פיפטה, נושא הפסולת סרולוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנושא את כדורי FM כדי 3 מחזורים להקפיא להפשיר כדי lyse תאי דגירה אותם 75 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לפגל חלבונים במטריצה. אחסן את כדורי נייר -20 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol> Assay 3. דיאליזה ראפיד איזון (RED) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10 מניות פתרונות מ&quot;מ של כל תרכובות בדיקת sulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל את 500 מיקרומטר עובד פתרונות DMSO לפני כל assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הצינור המכיל את הגלולה הפונדקאית caseum. הפחת משקל הצינור הריק כדי לגזור את המשקל של הגלולה לבד. להוסיף 2-3 חרוזי מתכת לכל צינור ו, באמצעות homogenizer רקמות בבית 1200 משייכות / min 1 דק &#39;, לשבש caseum או המטריצה ​​הפונדקאית ב PBS (1: 9 w / v) כדי להשיג 10x השעיה מדוללת של כל מטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספייק 6.5 μL של 500ΜM הפתרון של המתחם הבדיקה לתוך 643.5 μL של homogenate כדי להשיג את הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר (≤ 1% DMSO) ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התוספות האדומות בצלחת הבסיס. הוסף 200 μL של מטריקס סמים ממוסגרת לתא התורם (טבעת אדומה) של כל הוספה אדום ו 350 μL של PBS לתוך כל חדר המקלט. הכן 3 מוסיף עבור כל מתחם הבדיקה (דגימות בשלושה עותקים). צלחת חותם עם דבק צלחת דבק ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס על thermomixer ב 200 סל&quot;ד (1 xg) במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לערבב בעדינות את התוכן של התורם ו המקלט חדרים על ידי pipetting מעלה ומטה 2-3 פעמים. פיפטה 20 aliquots μL של homogenate מתאי התורם ולהוסיף 20 μL של PBS נקי בצינור 1.5 מ&quot;ל (1: 1). באופן דומה, פיפטה 20 aliquots μL של דגימות PBS מתאי המקלט ולהוסיף μL 20 של homogenate נקי (התאמה מטריקס). 8 הערה: התאמת מטריקס מבטלת את neעבור 2 עקומות כיול נפרד (ב homogenate ו PBS) כדי להיעשות לצורך ניתוח כמותי. התוכן של החדר התורם עשוי משקעים לאורך זמן. בעדינות לערבב את התוכן על ידי pipetting לפני הסרת aliquots. </li></ol> 4. כימות LC-MS וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 160 μL של 1: 1 מתנול: אצטוניטריל המכיל 500 ng / מ&quot;ל ​​diclofenac או 10 ng / מ&quot;ל ​​verapamil (תקן פנימי) על כל צינור ו מערבולת כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 5 דקות למשקע משקע והעברת supernatants לתוך 96 היטב טוב צלחות היטב עבור ניתוח כרומטוגרפי נוזלי ספקטרומטריית מסה (LCMS). 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניית עקומות כיול מ 1-1,000 ננומטר עבור כל מתחם הבדיקה תוך שמירה על הרכב מטריקס זהה הדוגמאות לעיל. לכמת את הריכוז של מתחם הבדיקה בדגימות של התורם ו המקלט חדרים באמצעות שיטה LC-MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב החלק השבריר ( f u ) oF התרופה במטריצה מדוללת באמצעות משוואה 1. חשבה את f u במטריצה חייה באמצעות משוואה 2 (D = דילול פקטור של 10). 14 <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההתאוששות (מאזן מסה) של כל מתחם באמצעות משוואה 3 לזהות תרכובות עם יציבות / המטבוליזם / בעיות כריכה הלא ספציפיות. הערה: שחזור בדרך כלל נופל בין 70% ו 130%. 15 <img alt="משוואה 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+versus+bugs%3A+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li>
<li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Int+Union+Tuberc%22%5BJournal%5D)">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li>
<li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li>
<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li>
<li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li>
<li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://jpharmsci.org/article/S0022-3549(16)32735-6/pdf">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li>
<li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+localization%2C+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+a+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li>
<li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2423064/">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li>
<li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure%3A+implications+for+rational+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Drug+Dispos%22%5BJournal%5D)">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li>
<li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li>
<li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
</ol>

אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

נגעים וחללי נימקי ריאתי בחולים שנדבק בשחפת לכלול תת-אוכלוסיות של חיידקים שנמצאים סרבנים טיפול תרופתי. ליבות caseous של מבנים אלה הן בעיקר אחראיות מחסה persisters אלה בסביבה תאית. 16 נוחים הפצה של חומרים אנטי-בקטריאליים במיקומים מרוחקים אלה הוא האמין להיות גורם חשוב של יעילות התרופה שחפת. לפני כניסתם לתוקף של פרוטוקול זה, לא היו זמינים טכניקות במבחנה שיכול לחזות את ההפצה של תרכובות גילוי תרופות בנגעים caseous. כתוצאה מכך, ההערכה של הפצת סמי...

הטיפול במחלת שחפת ריאות מחייב הפצה יעילה של תרופות לסוגים שונים של נגעים. נגעים נקרוטיים וחללים מכילים מרכזים קוגניטיביים המאכלסים תת-אוכלוסיות של חיידקים סובלניים או &quot;מתמידים&quot;. 1 , 2 המחלה cavital קשורה עם שיעורי תרופה נחות ופרוגנוזה גרועה. 3 , 4 מחקרים קודמים הראו, באמצעות טכניקות כמותיות והדמיה, כי היכולת לחדור caseum משתנה באופן משמעותי משלב התרופות אחד למשנהו. 5 , 6 שיטות אלה, לעומת זאת, דורשים שימוש במודלים זיהום בבעלי חיים כי הם איטיים ומייגעים. ב assay במבחנה כי אמצעים מחייב סמים exum case vivo לשעבר תוכנן. מחייב זה נמצא בקורלציה הפוכה עם חדירת סמים גרנולומה במקרה, ומכאן, הואהמשמש כלי ניבוי. 7 שיווי המשקל דיאליזה נחשבת כגישה זהב רגיל למחקרים חלבון פלזמה מחייב. דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) המכשיר מספק מהיר, קל לשימוש מערכת אמינה לביצוע מבחנים כאלה. 8 המכשיר מורכב משני מרכיבים: תוספות חד פעמיות, חד פעמיות המורכבות משני תאים המופרדים על ידי גליל אנכי של קרום חדיר למחצה; ואת לוחות בסיס לשימוש חוזר שיכול להכיל עד 48 מוסיף בכל פעם. קרום דיאליזה יש 8 kDa משקל מולקולרי לחתוך (MWCO) כי הוא אידיאלי עבור מחקרים מקרומולקולה תרופה. היחס בין שטח השטח לנפח גדול של תא הממברנה מאפשר דיאליזה מהירה ושיווי משקל. הן התוספות והן צלחת הבסיס אומתו עבור מחייב מינימלי שאינו ספציפי. השילוב של המכשיר האדום עם טכניקות bioanalytical מספק הערכות מדויקות של שברים unbound של תרופות pLasma. 8 , 9 למרות תוכנן במקור למדוד מחלב פלזמה מחייב, המכשיר האדום כבר בשימוש במספר מחקרים מחייב רקמה באמצעות homogenates. 10 , 11 בפרוטוקול זה, אנו מודדים את התרופה מחייב caseum, פסולת נקרית נכרת מן נגעים נמק חללים של שפעת נגועים ארנבות. האופי ואת לא כלי הדם של חומר caseous עושה את זה קל homogenize לתוך ההשעיה הומוגנית התואמת assay. בהתחשב בכך caseum מייגע לייצר וקשה לבוא, הפרוטוקול יש גם תוקף לשימוש עם מטריצה ​​פונדקאית כי הוא מוכן מקרופאגים מקציף. THP-1 מונוציטים הנגזרות מקרופאגים הם המושרה עם חומצה אולאית לצבור מספר רב של גופים השומנים המעניקים להם את המראה &quot;מקציף&quot; שלהם. תאים אלה טעון שומנים נקצרים ומעובד כדי לייצר מטריצה ​​שאנחנו משתמשים בתור תחליף כדי caseum. מחקר זה הוכיח כי התרופה קשורה מטריקס זה פונדקאי מתואם היטב עם מחייב caseum, ביעילות מחקה את תהליך vivo כי מעכב חדירת סמים הליבה המקרה של גרנולומות וחללים.

<table><tbody><tr><td>ארנבות לבנות ניו זילנדיות</td> Covance-HN878 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>קטתזיה (קטמין) 100 מ"ג/מ"ל C3N</td><td>הנרי שיין בריאות בעלי חיים</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>אנסד (קסילזין) 100 מ"ג/מ"ל</td><td>הנרי שיין בריאות בעלי חיים</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Euthasol (פנטוברביטל נתרן ופניטואין נתרן&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 קו תאים מונוציטי</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 ס"מ&sup2; בקבוק מטופל TC (T175)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 מדיה ללא גלוטמין</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone סרום בקר עוברי, גמא מוקרן&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-גלוטמין, צלחת 200 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC, 145 מ"מ x 20 מ"מ, מאוורר</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אולאית&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device לוחית בסיס לשימוש חוזר</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>מוסיף מכשיר Pierce RED, 50/קופסה&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>כלי להסרת הכנסת פירס אדום&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>חותם צלחת דבק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 מ"ל (גיבקו)&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>סיגמא</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>ורפמיל הידרוכלוריד</td><td>סיגמא</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>מלח נתרן דיקלופנק</td><td>סיגמא</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת טריפן כחולה, 0.4%</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, 200 הוכחה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>אביזר הומוגנייזר טחנת חרוזים, חרוזי מתכת בתפזורת</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R קובלט 60 Irradiator</td><td>JL שפרד</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp; C-Chip חד פעמי Hemacytometers</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור זקוף</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>מערכת כרומטוגרפיה נוזלית בינארית</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר מסה</td> רב קומפנט <td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

an<em&gt; במבחנה</em&gt; assay מחייב assay כי חוזה חדירה לסמים בשחפת נגעים

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

חיסול מחלת השחפת דורש משטרי סמים שיכולים לחדור לשכבות מרובות של נגעים ריאתיים מורכבים. התפלגות הסמים של ליבות המקרה של חללים ו lesions הוא חיוני במיוחד משום שהם הנמל subpopulations של חיידקים סובלני חיידקים גם נפוץ המכונה פרעות. שיטות קיימות למדידת חדירת סמים בשחפת שחלות כרוך יקר זמן רב במחקרים vivo pharmacokinetic יחד עם טכניקות bioanalytical או הדמיה. המדידה במבחנה של תרופה מחייב מקרומולקולות המקרה הוצע כחלופה לטכניקות כאלה מאז מחייב זה מעכב את דיפוזיה פסיבית של מולקולות התרופה באמצעות caseum. דיאליזה מהירה שיווי המשקל היא מערכת מהירה ואמינה לביצוע מחקרים חלבון פלזמה ורקמות מחייב. בפרוטוקול זה, השתמשנו דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) מכשיר למדוד מחייב סמים homogenates של caseum כי הוא excisאד מן הנגעים והחללים של ארנבים נגועים בשחפת. הפרוטוקול גם מתאר כיצד ליצור מטריצה ​​פונדקאית מן השומנים טעון מקרופאגים THP-1 להשתמש במקום caseum. caseum / זה assay מחייב הפונדקאי הוא כלי חשוב לגילוי תרופות לשחפת ניתן להתאים לעזור ללמוד הפצת תרופת נגעים או מורסות נגרמים על ידי מחלות אחרות.

שימוש בפרוטוקול זה, בדקנו מאות תרכובות פיתוח התרופה שחפת עבור יעילות ניבאו שלהם חודר caseum. איור 1 מציג באופן ויזואלי את המושגים הבסיסיים של assay RED. קרום הדיאליזה של הוסיף RED מאפשר מולקולות קטנות מאוגדות לנטרל מן התורם גם למקלט היטב, ולבסוף השיגו איזון בין שני התאים. מולקולות קטנות המאוגדים מקרומולקולות כגון חלבונים או שומנים כלואות בתוך התורם גם. ניתוח כמותי של דגימות משני תאים ומאפשר לחשב את השבר מאוגד (ו u)</s...

כאן אנו מתארים שיווי משקל שיווי משקל מהיר (אדום) שיטה למדוד מחייב סמים כדי caseum מ נגעים שחפת ריאות וחללים. הפרוטוקול משמש גם עם מטריצה ​​קצף הנגזר מקרופאג כי הוא תחליף יעיל caseum.

An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay מחייב Assay כי חוזה חדירה לסמים בשחפת נגעים

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לחזות קישור של תרופות לקזאום (caseum) מנגעי שחפת. שיטה זו יכולה לסייע בקביעת היעילות שבה חומרי אנטימיקרוביאליים חודרים לליבת הקזאוס של נגעים נמקרה, ללא שימוש במודלים של בעלי חיים ובטכניקות דימות יקרות. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי גילוי ישיר של תרופות לשחפת, ניתן להחיל אותה גם על מחלות אחרות המאופיינות בהיווצרות נגעים או מורסות שבהם חדירות התרופה מוגבלת.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן עקביות בביצוע הפרוטוקול תבטיח שחזור של הנתונים בין ניסויים. היום, אני אדגים את הליך תרבית התאים ואת הכנת המטריצה התחליפית (surrogate matrix). Hsin-pin, עמית מחקר מהמעבדה שלנו, ידגים את המסה (assay) השנייה.גדלו מונוציטים מסוג THP-1 בבקבוקי תרבית תאים T-175 המכילים 80 mL של מצע RPMI 1640, עם 2 millimolar של l-glutamine ו-10 percent סרום בקר עוברי (fetal bovine serum). דגרו את הבקבוקים בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם חמישה percent פחמן דו-חמצני למשך שלושה עד ארבעה ימים. כאשר התאים מגיעים לכ-70 percent התמסכות (confluency), חלקו אותם לשתי מבחנות קוניות של 50 mL, וסבבו אותם בצנטריפוגה במהירות של 150 times g למשך חמש דקות.לאחר הסבוב, השליכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-10 mL של מצע RPMI 1640. העבירו באמצעות פיפט חמישה מיקרוליטרים מתרבית זו לשפופרת של 1.5 mL המכילה 45 מיקרוליטרים של trypan blue. ערבבו היטב באמצעות פיפוט.העבר 10 µL להמוציטומטר. ובאמצעות מיקרוסקופ אור בהגדלה של 10x, ספור את מספר תאי המונוציטים החיוניים מסוג THP-1. לאחר קביעת מספר התאים החיוניים למיליליטר של התרבית, דלל אותה עם מצע RPMI לצפיפות סופית של 1.25 × 10⁶ תאים למיליליטר.הוסף 40 µL של PMA בריכוז 100 µM למבחנה. לאחר מכן, העבר את התרבית לצלחת תרבית תאים בגודל 140 × 20 mm. אפשר לתאים להיצמד למשך לילה באינקובטור.בשלב הבא, דללו חומצה איליאית (iliac acid) טהורה באתנול לריכוז של 0.1 molar. בשלב זה, המיסו 31.7 µL של חומצה איליאית ב-968.3 µL של אתנול. דללו את התמיסה במצע RPMI טרי שחומם מראש לריכוז של 10 millimolar.דללו את תרחיף חומצה האיליאית (iliac acid) לריכוז עבודה סופי של 0.4 millimolar במדיום RPMI שחומם מראש ל-37 degrees Celsius. דילול חומצה האיליאית במדיום RPMI שחומם מראש הוא קריטי כדי להבטיח המסה מספקת של חומצת השומן בתמיסה מימית. באמצעות פיפטה, הסירו את המדיום הקיים ואת התאים שאינם נצמדים מלוח תרבית התאים המכיל מקרופאגים מסוג THP-1, והוסיפו בעדינות 40 mL של 0.1 millimolar חומצה איליאית.דגרו ב-37 degrees Celsius באינקובטור למשך הלילה. למחרת, השתמשו במיקרוסקופ אור בהגדלה של 40x כדי לאשר חזותית את נוכחותם של גופי ליפידים רבים בתאי THP macrophage. גופי הליפידים נראים כמבנים כדוריים, שקופים וקטנים בציטופלזמה.הסר את כל מצע ה-RPMI מלוח תרבית התאים ושטוף בעדינות את התאים הדבקים פעמיים ב-PBS, באמצעות פיפט סרולוגית של 50 mL. הוסף ללוח 40 mL של EDTA בריכוז 5 millimolar ו-PBS. הדגר למשך 15 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.בשלב הבא, כדי לנתק את המקרופאגים הקצפיים, השתמשו בפיפט סרולוגי של 10 mL ובצעו שאיבה והזרקה חוזרת (pipetting) על פני כל שטח הפלטה. העבירו את תרחיף התאים למבחנה קונית של 50 mL, וסובבו אותה בצנטריפוגה במהירות של 150 ×g למשך חמש דקות.לאחר הסבוב, השהו מחדש את משקע התאים ב-10 mL של PBS והעבירו אותו לשפופרת קונית של 15 mL שנשקלה מראש. צנטריפוגו שוב ב-150 times g למשך חמש דקות. לאחר מכן, שאבו בזהירות את הנוזל העליון באמצעות פיפטה סרולוגית והשליכו אותו.העבירו את פלטות המקרופאגים הקצפיים שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה (freestyle cycles). התניקו לסירוגין בין קרח יבש לבין אינקובציה ב-37 degree Celsius על בלוק תרמי כדי ללווס את התאים. לאחר מכן, דגרו אותם ב-75 degrees Celsius למשך 20 עד 30 דקות כדי לדנטור את החלבונים במטריקס.יש לאחסן את הפלטות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. את בדיקת ה-RED (rapid equilibrium devices), המוצגת בחלק זה של הסרטון, ניתן לבצע באמצעות המטריצה החלופית שהכנו כעת או באמצעות רקמה מנגעי ארנב שנדבקו ב-TB. כאן נדגים את ביצוע הבדיקה על המטריצה החלופית.הכינו תמיסות מלאי בריכוז 10 millimolar של כל תרכובות הבדיקה. במקרה זה, moxyfloxacin מוכן ב-DMSO. המסו לתמיסות עבודה בריכוז 500 micromolar ב-DMSO לפני כל בדיקה.שקלו את המבחנה המכילה את הגבינת הcaseum שהוצאה או את תחליף הפלטה. הפחיתו את משקל המבחנה הריקה כדי לקבל את משקל ה-caseum או תחליף הפלטה לבדם. הוסיפו שתי עד שלוש חרו지를 מתכת לכל מבחנה, ולאחר מכן הוסיפו PBS ביחס של 1:9 במשקל לנפח (W to V). באמצעות וורטקס, פרקו את ה-caseum או את מטריצת התחליף למשך דקה אחת.הוסף 6.5 µL של תרכובת הבדיקה שהוכנה ל-643.5 µL של ההומוגנאט. כדי להגיע לריכוז סופי של 5 µM, בצע ערבוב במערבל Vortex. לאחר מכן, מקם את התבניות האדומות בתוך פלטת הבסיס.הכינו את המערכות עבור כל בדיקה, כאשר כל תרכובת מבוצעת בשלוש חזרות. הוסיפו 200 µL של מטריצה עם התרופה לתא התורם האדום של כל מערכת אדומה. לאחר מכן, הוסיפו 350 µL של PBS לכל תא מקלט.הנח מדבקה אוטמת על הפלטה והדגר אותה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius במיקסר תרמי ב-200 rotations per minute למשך ארבע שעות. לאחר ההדגרה, ערבב בעדינות את תכולת תאי התורם והמקבל באמצעות פיפטינג (שאיבה ושחרור) פעמיים עד שלוש. העבר 20 microliters של הומוגנאט מכל אחד מתאי התורם אל 20 microliters של PBS נקי בתוך מבחנה של 1.5 mL.באופן דומה, העבירו מנות של 20 µL של דגימות PBS מתאי הקליטה לתוך 20 µL של הומוגנאט נקי. התאמת מטריצה (Matrix matching) מבטלת את הצורך ביצירת שתי עקומות ראייה צבעוניות נפרדות בהומוגנאט וב-PBS לצורך ניתוח כמותי. התוכן של תא התורם שוקע עם הזמן.ערבבו בעדינות את התוכן באמצעות פיפוט לפני הוצאת מנות (aliquots). הוסיפו לכל מבחנה 160 microliters של תערובת methanol ו-acetonitrile ביחס של אחד ለአחד, המכילה 500 nanograms per milliliter של diclofenac או 10 nanograms per milliliter של verapamil כסטנדרט פנימי. ערבבו במערבל Vortex כדי להשקיע את החלבונים.סבבו בצנטריפוגה ב-10000 x g למשך חמש דקות כדי לשקע את המשקע, ולאחר מכן העבירו את הנוזלים העליונים (supernatants) לפלטות עם 96 בארות עמוקות (deep well plates) לצורך ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית מספקטרומטריית מסות, LCMS. בנו את עקומות כיול בריכוזים של 1 עד 1000 nanomolars עבור כל תרכובת נבדקת, על ידי ביצוע דילולות של תמיסת המלאי של התרכובת תוך שמירה על הרכב מטריצה זהה לזה של הדגימות. כמתו את ריכוז התרכובת הנבדקת בדגימות מתאי התורם והמקבל באמצעות שיטת LCMS.חשבו את החלק הבלתי קשור, או fu, של התרופה והמטריצה המדוללת, באמצעות משוואה אחת המוצגת כאן. לאחר מכן, חשבו את ה-fu במטריצה שאינה מדוללת באמצעות משוואה שתיים, כאשר D שווה למקדם דילול של 10. לבסוף, בדקו את ההשבה (recovery) או את מאזן המסות של כל תרכובת באמצעות משוואה שלוש המוצגת כאן.לזיהוי תרכובות בעיות של יציבות, מטבוליזם או קישור לא ספציפי. שימו לב כי שיעור השחזור נע בדרך כלל בין 70% ל-130%. הפרוטוקול המתואר בסרטון זה שימש לבדיקת מאות תרכובות לפיתוח תרופות לשחפת כדי להעריך את יעילות החדירה החזויה שלהן לקאזאום (caseum).ממברנת הדיאליזה של ההכנסות האדומות מאפשרת למולקולות קטנות שאינן קשורות לד diffuse מהבאר התורמת (donor well) אל הבאר המקבלת (receiver well), עד להשגת שיווי משקל בין שני התאים. מולקולות קטנות הקשורות למקרו-מולקולות כגון חלבונים או ליפידים נלכדות בבאר התורמת. ניתוח כמותי של הדגימות משני התאים מאפשר חישוב של החלק הבלתי קשור, fu, של כל מולקולה קטנה בתוך ה-caseum או במטריצה התחליפית (surrogate matrix), כפי שמוצג כאן.ככל שה-fu גבוה יותר, כך התרופה מפעפפת באופן נרחב יותר לתוך הגבינה (caseum). דימות מספקטרומטריית מסות מסוג MALDI (יינון בסיוע מטריצה ודסורפציה בלייזר) בוצע עבור שש תרופות. מפות יונים של נגעים מייצגים בריאה מוצגות כאן, כאשר עוצמת האות מצוינת בסרגל הדרגות שמשמאל.צביעות Hematoxylin ו-ESN או HNE של חתכים סמוכים מוצגות מתחתיהם. קווי המתאר בשחור-לבן מדגישים את המרכז הגביסוֹני (caseous) של כל נגע. נתונים אלה עקביים עם ההשערה שחלקיקי התרופה מפעפעים אל החלק החיצוני של הגביסון מהממשק שבינו לבין השכבות התאיות של הנגע.קישור למקרו-מולקולות גבייתיות (caseous) מבודד את התרופה, ובכך מונע את דיפוזייתה להלאה אל תוך הליבה הגבייתית. כפי שמוצג כאן, המטריצה שהוכנה ממקרופאגים קצפיים המופקים מ-THP-1 מהווה תחליף יעיל לגבייה (caseum) אמיתית. הקישור בשתי המטריצות נמצא במתאם חזק זה עם זו.בעקבות הליך זה, ניתן לבחון מספר תרכובות בו-זמנית כדי לחסוך בזמן ובמשאבים. אנו מכנים זאת בדיקת קסאט (cassette testing). מאז פיתוחו, נעשה שימוש במסיי זה במספר תוכניות לאופטימיזציה של תרכובות מובילות (lead optimization) לצורך גילוי תרופות לשחפת.זכרו כי עבודה עם מיקרובקטריה ודגימות רקמה נגועות בשחפת עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש להשתמש בפרוטוקול סטריליזציה של רקמות שעבר תיקוף, באמצעות קרינת גמא, לפני טיפול בדגימות מעטפת נגועות במעבדה ברמת בטיחות BSL2. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

מקור: Sarathy, J. P. et al. מבחן קשירת קזאום במבחנה המנבא חדירת תרופות בנגעי שחפת. J. Vis. Exp. (2017)סרטון זה מדגים בדיקה חוץ גופית למדידת קשירת תרופות לקזאום מנגעי שחפת באמצעות דיאליזה מהירה בשיווי משקל. הוא מתאר את השלבים להכנת תרחיפי קזאום, ביצוע דיאליזה וחישוב חלק התרופה הלא קשור כדי לחזות את חדירת התרופה לקזאום.

מדידת קשירת תרופות לקזאום מנגעי שחפת בשיטת דיאליזה בשיווי משקל מהיר

סרטון זה מדגים בדיקה להערכת יעילות התרופות נגד זיהום Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  נוצר מודל זיהום במבחנה המכיל אגרגטים Mtb/מקרופאגים המחקה זיהום in vivo. עם החדרת אנטיביוטיקה מתאימה, יעילותם נבדקת באמצעות בדיקת resuzarin כדי לפקח על הישרדותם של חיידקים עם ריכוזי תרופות עולים.

בדיקה להערכת יעילות התרופה נגד מודל זיהום Mycobacterium tuberculosis

סרטון זה מדגים בדיקה במרק כדי לקבוע יעילות אנטיביוטית נגד Mycobacterium tuberculosis. תרבית החיידקים מודגרת בריכוזים שונים של אנטיביוטיקה קוטלת חיידקים. יעילות קוטל החיידקים נמדדת על ידי הערכת נוכחותם של חיידקים ברי קיימא באמצעות בדיקת רזזורין.

הערכת היעילות של תרכובת בדיקה נגד מיקובקטריה במרק

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

ה-charcoal agar resazurin assay (CARA) היא שיטה כמותית למחצה, תפוקה בינונית להערכת הפעילות של סוכני בדיקה כנגד מיקובקטריות המשכפלות, אינן משתכפלות או שניהם.  ה-CARA מאפשר הערכה מהירה של פעילות תלוית זמן וריכוז ומזהה פרמטרים שיש לעקוב אחריהם על ידי מבחני יחידת יצירת מושבה (CFU).

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

מודלים ומבחנים חדשים שישפרו את תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרופות נגד שחפת מהדור הבא הם רצויים מאוד. כאן, אנו מתארים בדיקה מהירה, זולה ותואמת BSL-2 להערכת יעילות התרופה נגד Mycobacterium tuberculosis שניתן להתאים בקלות לבדיקה בתפוקה גבוהה.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול באמצעות לייזר לכידת microdissection בשילוב עם ניתוח LC/MS במרחב-לכמת הפצות סמים בתוך גרנולומות שחפת הריאה. הגישה יש ישימות רחבה כדי לכימות ריכוז סמים בתוך רקמות-פירוט מרחבית גבוהה.

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

קביעת יחידות יוצרות מושבות (CFU) היא הטכניקה הסטנדרטית לכימות חיידקים, כולל Mycobacterium tuberculosis אשר יכול לקחת שבועות כדי ליצור מושבות גלויות. כאן אנו מתארים מיקרו-CFU לקביעת CFU עם יעילות זמן מוגברת, שטח מעבדה מופחת ועלות מגיב, ומדרגיות לניסויים בתפוקה בינונית וגבוהה.

בדיקת יחידה להקמת מושבות מיקרו להערכת יעילות חיסונים נגד שחפת

מחקר זה פיתח בדיקה לסינון בתפוקה גבוהה נגד Mycobacterium abscessus עם זן כפול של כתב שנוצר לאחרונה, תוך שימוש בפלואורסצנטיות ולומינסנציה כדי להעריך את כדאיות החיידקים במהירות. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי לחוקרים השואפים לסנן תרופות חדשות נגד חיידק עמיד לתרופות.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

למד את שיטת הדיאליזה המהירה (RED) לחיזוי קישור תרופות לקזאום בנגעי שחפת. הפרוטוקול משתמש במטריצה ממקרופאגים קצפניים כתחליף לקזאום ומאפשר הערכת חדירת אנטימיקרוביאלים ללא מודלים בעלי חיים.

An

גלה סרטונים נוספים