Name: הכנה במבחנה אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: למד שיטה להעברת microRNA לתאי אנדותל באמצעות וקטור PEI/MNP ללא וירוסים. השיטה מאפשרת מגנטיזציה של תאים לשיפור השמדתם באתרי מטרה וזיהוי MRI ברפואה רגנרטיבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות ג פולדה (מרכז מיקרוסקופי אלקטרונים, רוסטוק אונ&#39;, גרמניה) עבור התמיכה הטכנית ברכישת תמונות TEM של חלקיקים פאראמגנטי מסוננים בביצוע ניתוח רנטגן שלהם. העבודה מתבצעת על רוסטוק RTC נתמכה על ידי המשרד הפדרלי לחינוך ולמחקר גרמניה (FKZ 0312138A, FKZ 316,159 ו VIP + 03VP00241) ואת פומרניה מדינת מקלנבורג-מערב עם הקרנות המבניות של האיחוד האירופי (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 ו ESF / IV-BM-B35-0010 / 12) ועל ידי DFG (DA 1296-1), ורטיבות-קרן, וקרן הלב גרמנית (F / 01/12). פרנק Wiekhorst נתמכה על ידי תוכנית המחקר FP7 האיחוד האירופי &quot;Nanomag&quot; FP7-NMP-2013-גדול 7.

אין לנו שום אינטרסים כלכליים מתחרים לחשוף.

את ייצור תאי מהונדסים גנטית עמוסה חלקיקים פאראמגנטי לקבלת הנחיות נוספות מגנטית נשלטת שלהם מוצג בפרוטוקול הנוכחי. היישום המוצלח של אסטרטגיה זו מאפשר לפתרון קשיים מסוימים של טיפול בתא, כגון החזקה נמוכה engraftment העני באזור נפצע 2, 3, 4, על ידי מתן מוצר תא למקד אליו להשתלה. יתר על כן, כניסתה סימולטני של חומר גנטי שנבחר כראוי יכולה לקדם מאפייני תא ובכך יכולה להגדיל יתרונות פונקציונליים <sup...

ג&#39;ין וטיפול תא הם כלים רבים עצמה יש פוטנציאל לפתור אתגרים נוכחיים בטיפול CVD. למרות העובדה כי הן הגישות הללו נבדקות כעת בניסויים קליניים, הם עדיין אינם מוכנים ליישום קליני רחב 1. יש לציין, גישה משותפת להתמודדות עם האתגרים של גן לבין טיפול בתא היא לפתח וקטורים למסירת גן רבים תכליתיים מתאימים ליישום קליני. היעדר מערכות למסירת הגן בטוחות ויעילות הוא הדאגה העיקרית של ריפוי גנטי. במקביל, ההנדסה הגנטית של מוצרי הסלולר לפני ההשתלה יכולה להתגבר על האתגרים הרציניים של טיפול בתא, כגון יעילות נמוכה (למשל, בתחום הלב, רק ~ 5% של שיפור תפקודי מושגת פוסט-תאי גזע להשתלת 1 ) ושימור / engraftment עני באתר של פציעה (כלומר, החזקת תא יורד מתחת 5 - 10% בתוך דקות עד שעות POst-יישום, ללא קשר לתוואי ממשל 2, 3, 4). נכון להיום, וקטורים ויראליים מאוד יעלו מערכות שאינן ויראליות במונחים של יעילות, אשר הביאה היישום הרחב יותר שלהם בניסויים קליניים (~ 67%) 5. עם זאת, כלי רכב ויראלי לשאת בסיכונים חמורים, כגון חיסוני (ואת התגובה הדלקתית שלאחר מכן, עם סיבוכים חמורים), oncogenicity, ומגבלות בגודל של החומר הגנטי הנישא 6. בשל חששות בטיחות אלה לבין העלויות הגבוהות של ייצור וקטור ויראלי, השימוש במערכות הלא-ויראלית עדיף במקרים מסוימים 7, 8. היא מתאימה במיוחד עבור הפרעות הדורשות תיקון גנטי חולף, כגון הביטוי של גורמי גדילה השליטה אנגיוגנזה (למשל, לטיפול CVD) או deliveר&quot;י של חיסונים. בקבוצה שלנו, מערכת מסירה תוכננה על ידי שילוב מסועף 25-kDa polyethyleneimine (תש&quot;ן) ואת חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי (MNP) קשורים יחדיו על ידי האינטראקציה ביוטין- streptavidin 9. וקטור זה הוא כלי פוטנציאלי עבור הנדסה גנטית של תאי, המאפשר המגנטיזציה שלהם סימולטני לפני ההשתלה. זה האחרון מספק בסיס הדרכה / שימור מגנטי, אשר מבטיחה במיוחד בימינו, כמו טכניקות מיקוד מגנטיות מתקדמות מפותח בהצלחה 10. יתר על כן, התא מגנטי תגובה וכתוצאה מכך יש את הפוטנציאל להיות פולשני במעקב דימות בתהודה מגנטית (MRI) או הדמית חלקיקים מגנטית 11, 12. במקרה של וקטור PEI / MNP, polyamine מבטיח התעבות חומצות גרעין ובכך הגנה מפני גורם משפיל<html> ים, הפנמת וקטור בתאים, ו endosomal להימלט 5. MNPs משלימים את המאפיינים של PEI, לא רק במונחים של הדרכה מגנטי, אלא גם על ידי הפחתת הרעילות 7 הידוע PEI, 13, 14. בעבר, תש&quot;ן / נכסים וקטור MNP הותאמו מבחינת יעילות משלוח (כלומר, pDNA ו מירנה) ובטיחות באמצעות פיברובלסטים ותאי גזע mesenchymal אנושי 15, 16. בכתב היד הזה, פרוטוקול מפורט על היישום של PEI / MNPs עבור הדור של תאי-modified מירנה מתואר 17. לשם כך, HUVECs משמש ומהווה מודל הוקם עבור אנגיוגנזה במבחנה. הם מאתגר transfect והם רגישים השפעה רעילה 18, 19,התחת = &quot;Xref&quot;&gt; 20. בנוסף, אנו מספקים אלגוריתם להעריך תאים כאלה במבחנה, כולל מיקוד שלהם, תקשורת בין-תאית, וזיהוי MRI.

<table><tbody><tr><td>PEI 25 kDa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21335</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 עמודי התפלה</td><td>GE Healthcare</td><td>17085101</td><td>המכילים תמיסת ריאגנט נינהידרין בינונית Sephadex G-25</td></tr><tr><td>2%</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>7285</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>410225</td><td></td></tr><tr><td>ערכת כימות ביוטין פירס</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>קורא מיקרופלייט דגם 680</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere חלקיקים פרמגנטיים</td><td>Promega</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV PVDF מסנן</td><td>Merck</td><td></td><td>SLHV013SL 0.45 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>מאזניים 120 מיקרוסקופ אלקטרונים שידור</td><td>Zeiss</td><td></td><td>מתח תאוצה 120&nbsp; גלאי</td></tr><tr><td>רנטגן ספיר</td> kV <td>EDAX-Amatek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים פלסטיק</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-אסתר אטו 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-31</td><td></td></tr><tr><td>NHS-אסתר אטו 488&nbsp;</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 488-31</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 miRNA תווית ערכת IT</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין אטו 565</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>קולגן מסוג IV Gibco</td><td>Thermo Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>מדיום גידול אנדותל, EGM-2</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 & CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>15140122</td><td>100 יח'/מ"ל, 100 ומיקרו; g/mL</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן נגד PECAM-1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-1506</td><td></td></tr><tr><td>MS MACS עמודות</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 Colour-Labeled Pre-miR Negative Control</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17120</td><td>"Cy3-miR" או "Cyanine-miR3" בכתב היד</td></tr><tr><td>Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM17110</td><td>"scr-miR" בכתב היד</td></tr><tr><td>מעכב סינתטי Anti-has-miR92a-3p&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM10916</td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1 מערכת</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>תמיסה 4% בכתם</td></tr><tr><td>גרעיני PBS DAPI</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin ערכת בידוד RNA</td><td>Machery-Nagel</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA ערכת בידוד</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA ערכת שעתוק הפוך</td><td>Thermo Scientific</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus מערכת PCR בזמן אמת Applied</td><td>Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה</td><td>Thermo Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>has-miR-92a TaqMan assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>000431</td><td>רצף miRNA בוגר: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU</td></tr><tr><td>FastGene Taq Ready Mix</td><td>Nippon Genetics</td><td>LS27</td><td></td></tr><tr><td>ITGA5 TaqMan assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>Hs01547673_m1</td><td></td></tr><tr><td>RNU6B TaqMan Assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>001093</td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA Endogenous Control</td><td>Thermo Scientific</td><td>4333760F</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace Calcein אדום-כתום</td><td>תרמו מדעי</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53500</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS buffer</td><td>Miltenyi Biotec&nbsp;</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>7.1 מערכת MRI לבעלי חיים טסלה</td><td>Bruker Corporation</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ImageJ</td><td>המכונים הלאומיים לבריאות</td><td></td><td>שודרגה עם מכשיר AngiogenesisAnalyzer (NIH)</td></tr><tr><td>MPS</td><td>תוכנת Bruker Biospin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>טבעת מגנט ניאודים&nbsp;</td><td>magnets4you GmbH</td><td>RM-10x04x05-G</td><td>&oslash; 10 מ"מ; שימור הוא ~ 1.3&nbsp; T, כפייה ו-ge; 955 kA/m</td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ערכת הדמיה</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>FluorSave Reagent</td><td>Merck</td><td>345789</td><td></td></tr><tr><td>אמבט אולטרסאונד</td><td>בנדלין</td><td>אלקטרוני סוג: RK 100 SH</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים mir-modified לתאי אנדותל

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

נכון להיום, הטיפולים כירורגיים תרופתיים הזמינים עבור מחלות לב וכלי דם (CVD) מוגבלים ולעתים קרובות פליאטיבי. במקביל, טיפולי גני תא הם מאוד גישות חלופיות מבטיחות לטיפול CVD. עם זאת, היישום הקליני הרחב של ריפוי גנטי מוגבל מאוד על ידי חוסר מערכות למסירת הגן מתאימות. ההתפתחות של וקטורים למסירת הגן מתאימים יכולה לספק פתרון לאתגרים נוכחיים טיפול בתא. בפרט, חסרונות קיימים, כגון יעילות מוגבלת ושימור תאי נמוך ב האיבר נפצע, ניתן להתגבר על ידי הנדסת תא מתאימה (כלומר, גנטי) לפני ההשתלה. הפרוטוקול המובא מתאר את השינוי החולף היעיל ובטוח של תאי האנדותל באמצעות ננו-חלקיקים מגנטיים פאראמגנטי polyethyleneimine (PEI / MNP) וקטור משלוח מבוסס. כמו כן, האלגוריתם ושיטות לאפיון תאים מוגדרים. Intracellu המוצלחמסירה של microRNA (miR) לתוך האדם ורידים טבורי תאים אנדותל (HUVECs) הושגה מבלי להשפיע על כדאיות התא, פונקציונליות, או תקשורת בין תאיים. יתר על כן, גישה זו הוכחה לגרום השפעה תפקודית חזקה מיר exogenous הציג. חשוב לציין, היישום של וקטור זה מבוסס MNP מבטיח מגנטיזציה התא, עם אפשרויות נלוות של מיקוד מגנטי לא מעקב פולשני MRI. זה עשוי לספק בסיס מגנטי מונחה, מהונדס גנטית תרפויטים תא שניתן לפקח ללא פולשנית עם MRI.

המטרה העיקרית של הפרוטוקול המוצע היא לייצר מגנטי תגובת תאי miR-modified וכדי לנהל האפיון המדויק שלהם (איור 1). כתוצאה מכך, תאי transfected ביעילות, מגיבים בחירה מגנטית והדרכה לזיהוי באמצעות MRI, יש לקבל. ראשית, את זהותם של HUVECs מבודד אושרו על ידי מכתים טיפוסי עם CD31 סמן אנדותל (PECAM) (איור 2 א) ועל ידי היכולת ש...

כתב היד הזה מתאר את משלוח יעיל, שאינו ויראלי של miR לתאי אנדותל ידי וקטור PEI / MNP ו המגנטיזציה שלהם. לכן, בנוסף שינוי גנטי, גישה זו מאפשרת להדרכת תא מגנטית ויכולת גילוי MRI. הטכניקה יכולה לשמש כדי לשפר את המאפיינים של מוצרי תא טיפוליים.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

המטרה הכללית של הליך זה היא להציג טכניקה המבטיחה שינוי של תאים באמצעות microRNA ובמקביל מגנטציה של התאים. שיטה זו יכולה לתת מענה לאתגרים מרכזיים בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון הנדסה גנטית של תאים לפני השתלה.בנוסף לשינוי תאים יעיל באמצעות microRNA, הם אפשרו זאת עם תחמוצת ברזל. ניתן להשתמש בכך לשיפור שימור התאים באזור המעניין באמצעות יישום שדה מגנטי. טיפול תאי הוא מבטיח מאוד לטיפול במחלות לב, ויש צורך דחוף בשיפור שימור התאים והישרדותם.התחילו הליך זה עם תרבית תאי אנדותל של וריד טבילית אנושי (HUVEC), תוך הכנת קומפלקסי טרנספקציה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. 48 שעות לפני הטרנספקציה, זרעו את תאי ה-HUVEC על פלטות יעורי תרבית תאים מפלסטיק בגודל מתאים, בצפיפות תאים התחלתית של כ-13,000 תאים לסנטימטר רבוע של שטח גידול.בשלב הבא, הכין ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל סופר-פרה-מגנטיים/polyethyleneimene/miR טריים. ראשית, דלל 2.5 picomoles של microRNA לסנטימטר רבוע של שטח גידול תאים ותמיסת גלוקוז בריכוז חמישה אחוזים כדי להגיע לריכוז סופי של 0.125 picomoles של microRNA למיקרוליטר. לאחר מכן, דלל את ה-PEI בנפח שווה של תמיסת גלוקוז בריכוז חמישה אחוזים.הוסיפו את ה-PEI המדולל לתמיסת ה-microRNA וערבבו את התערובת שהתקבלה באמצעות וורטקס למשך 30 שניות. לאחר מכן, הדגירו את תערובת ה-miR/PEI למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. בצעו סוניקציה ל-MNP's למשך 20 דקות לפחות באמבט מים סוניקטורי בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, הוסיפו את הכמות המתאימה של תמיסת MNP לתערובת miR/PEI המוכנה. לאחר ערבוב ב-vortex למשך 30 שניות, הדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת miR/PEI/MNP שהוכנה בטפטוף ישירות אל מצע התרבית שבו נמצאים התאים.החליפו תערובת זו במצע גידול טרי שש שעות לאחר הטרנספקציה. לאחר ניתוח בטיחות הווקטור כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט, אששו ואפיינו את הלוקליזציה התוך-תאית של קומפלקסים הטרנספקציה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית ומיקרוסקופיית הארה מובנית ברזולוציה גבוהה (super-resolution). לצורך כך, זרעו את תאי ה-HUVECs על לבישי זכוכית מצופים בג'לטין, המוצבים בבארות של פלטות תרבית בעלות 24 בארות, כפי שנעשה קודם לכן.בצע טרנספקציה לתאים באמצעות miR/PEI/MNP המסומן בשלושה צבעים והדגר אותם למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 °C באטמוספירה לחה המכילה 5% פחמן דו-חמצני. שטוף את כיסויי הזכוכית תחילה ב-2% bovine serum albumin ו-phosphate buffered saline, ולאחר מכן ב-PBS בלבד. קבע את התאים על ידי הדגרה ב-4% paraformaldehyde או PFA בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות.שטפו ב-PBS ולאחר מכן צבעו את הגרעינים ב-DAPI לפי הפרוטוקולים הסטנדרטיים. לאחר מכן, שטפו את התאים ב-PBS שלוש פעמים למשך 15 דקות על השייקר כדי להסיר את הצבע העודף. הניחו את כיסויי הזכוכית המוכנים על זכוכית מיקרוסקופ באמצעות מדיום קיבוע מתאים, והניחו לזכוכיות להתייבש למשך שעה אחת לפחות לפני השימוש במיקרוסקופיה.רכשו תמונות באמצעות עדשת שיקוע שמן של 63 פעמים, בהתאם להגדרות ה-SIM המופיעות בפרוטוקול הכתוב. לצורך מיקוד תאים ותנאים דינמיים מסומלצים in vitro, בצעו תחילה טרנספקציה של תאי HUVECs לפלטה בעלת 24 בארות כפי שנעשה בעבר. לאחר דגירה של 24 שעות, שטפו את התאים.לאחר מכן, הוסיפו one x trips ב-EDTA המדולל ב-PBS והדגרימו את התאים למשך ארבע דקות ב-37 degrees Celsius לפני איסוף התאים. סבבו את התאים שנאספו בצנטריפוגה במהירות של 300 times G למשך 10 דקות. ערבבו את משקע התאים שהתקבל מבאר אחת עם מיליליטר אחד של מצע גידול טרי.העבירו את התאים לבאר אחת של פלטת 12 בארות. קבעו מגנט קטן באופן מקומי באמצעות סרט דבק. הניחו את פלטת התרבית על השייקר והדגירו את תרחיף התאים למשך 12 שעות ב-150 RPM כדי לדמות תנאים דינמיים.לאחר מכן שטפו את התאים וקבעו אותם באמצעות PFA בריכוז של ארבעה אחוזים. צבעו את הגרעינים באמצעות DAPI. תיעדו את היצמדות התאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית עם סריקת לייזר (laser scanning confocal microscopy) עם לייזרים לעירור באורכי גל של 405 ו-504 ננומטר במצב z-stack כדי להשיג את הנתונים הגולמיים.השתמשו בעיבוד תמונות בשיטת הקרנה מקסימלית של עוצמה (maximum intensity projection) כדי ליצור תמונות לניתוח. לצורך ניתוח כמותי של תאים המגיבים למגנט ותאים שאינם מגיבים, בצעו תחילה טרנספקציה של HUVECs בלוחית בעלת 24 בארות. דגרו את התאים למשך 24 שעות לפני השטיפה ואיסוף התאים כפי שתיארנו קודם לכן.שחזר את משקע התאים שהתקבל מכל באר באמצעות 500 µL של באפר למיון תאים סטרילי וחם. העבר את תרחיף התאים לעמודת מיון מגנטית המקובעת באמצעות המגנט המצורף. לאחר מכן, שטוף את העמודות שעל המגנט שלוש פעמים עם באפר למיון תאים טרי.אספו את הנוזל שעבר (flow-through) כחלקיק שאינו מגיב למגנט. הסירו את העמודות מהמגנט ואספו מיד את פלג התאים המגיב למגנט על ידי דחיפת בופר מיון תאים טרי דרך העמודה באמצעות בוכנה. סבבו במערך צנטריפוגה את שתי הפלגיות, Mag- ו-Mag+, ב-300 ×g למשך 10 דקות.לאחר השהייה מחדש של משקע התאים ב-PBS, ספרו את התאים והעריכו את חיוניות התאים באמצעות מבחן הדירה של trypan blue. תאי HUVECs, המבודדים משרויות טבילה, מאופיינים על ידי ביטוי של הסמן האנדותליאלי CD31 ועל ידי יצירת צינורות על מטריקס של ממבס.והישרדותם נותרת ללא שינוי 24 שעות לאחר הטרנספקציה. בנוסף, מיקרוסקופיית רזולוציה-על מראה לוקליזציה פרא-נוקליארית של קומפלקסי טרנספקציה המסומנים בשלושה צבעים. רעילות ה-PEI מאוששת על ידי הפ funkcיונליות המופחתת של תאים שעברו טרנספקציה של miR/PEI.חשוב לציין כי MNP משחזר את תכונות התאים. תאים שעברו מודיפיקציה באמצעות miR/PEI/MNP אינם שונים מתאים שלא טופלו מבחינת יצירת צינוריות (tube formation). יתר על כן, תאים אלו שומרים על תקשורת בין-תאית דרך צממדים פערים (gap junctional communication), כפי שנחשף באמצעות התאוששות פלואורסצנטית לאחר הלבנה פוטוכימית (FRAP).לאחר שסספנזיה של תאים שעברו שינוי באמצעות miR/PEI/MNP נזרעה בבארות של פלטת תרבית שהוצבה על שייקר סיבובי, התאים נוטים לנדוד ולהיקשר באזור שבו מופעל המגנט המקומי. התמונות המייצגות מראות צמיחת תאים באזור שבו הופעל המגנט. ללא הפעלת מגנט.ובמרכז באר התרבית, שם זרימת הנוזל ריכזה את התאים. לאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצע טרנספקציית תאים תוך שעתיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם תמונה ברורה מאוד על האופן שבו ניתן לבצע שינוי זמני אך יעיל ביותר של תאים אנדותליאליים, כולל המגנטיזציה.וגם כיצד לאפיין את תוצר התאים בשלב הסופי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב להיצמד למספרים שסופקו עבור כמויות זריעת התאים, רכיבי ההכנה של קומפלקסי הטרנספקציה, זמן האינקובציה ושלב השטיפה לאחר הטרנספקציה. אנו אופטימיים מאוד שגישה זו תהיה ניתנת להעברה ביעילות לסוגי תאים אחרים לצורך טיפול באיברים פגועים אחרים.בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע מחקרי in vivo עם תאים ממגנטים שעברו מודיפיקציה. מחקרים אלו עשויים להשיב על שאלות נוספות לגבי השאלה האם טעינת ברזל של התאים יעילה להבטחת שימורם באזור המעניין. כמו כן, ניתן להגדיר באמצעותם את גבולות הגילוי של MRI ב-in vivo.

preparation-vitro-characterization-magnetized-mir-modified

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

סרטון זה מדגים טכניקה לטיהור תאי אב אנדותל CD31+ (EPC) מתרבית באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS). תרחיף התא מטופל בנוגדן מצומד פלואורופור הנקשר ל- CD31 על ה- EPC. השלמת התיוג של CD31+ EPCs כרוכה בהוספת קומפלקס נוגדנים, הנקשר לפלואורופורים, וננו-חלקיק מגנטי מצופה פולימר, הנקשר לקומפלקס הנוגדנים. התאים המסומנים מטוהרים לאחר מכן באמצעות שדה מגנטי, ומשליכים את כל תאי CD31.

טיהור תאים מקדימים אנדותל CD31+ באמצעות מיון תאים המופעלים מגנטית

תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

המטרות שלנו היו לעצב, לייצר ולבדוק סטנטים פרומגנטי ללכידת תא האנדותל. עשרה סטנטים נבדקו לשברים ועוד 10 סטנטים נבדקו למגנטיות עודפים. לבסוף, 10 סטנטים נבדקו ב- מבחנה ו8 יותר סטנטים הושתלו ב -4 חזירים להראות ללכוד תאים ושמירה.

Bare Metal פרומגנטי סטנט ללכיד תא האנדותל ושייר

פרוטוקול זה מוכן לחלוק את השיטה שלנו לבידוד תאי אנדותל כליליים של עכברים לצורך הדמיה או לביצוע ניסויים ביולוגיים מולקולריים.

בידוד של תאי האנדותל העכבר כלילי

פרוטוקול זה ממחיש הליך בטוחים ויעילים כדי לשנות CD133+ hematopoietic תאי גזע. הציג נגיפי, מגנטי polyplex-הגישה המבוססת על עשוי לספק בסיס אופטימיזציה של תאי גזע טיפולית אפקטים כמו גם לגבי ניטור המוצר תא מנוהל באמצעות תהודה מגנטית.

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

Microvascular תאי אנדותל של שרירי השלד (MMEC) לעצב את הדופן הפנימית של שריר נימים ולווסת את שניהם, חילופי נוזלים/מולקולות והעברה של תאים (חיסוניים) בין רקמת שריר, דם. בידוד של MMEC מאתר ראשי, כפי שמתואר כאן, מאפשר מקיף חקירות במבחנה של יחידת"myovascular".

בידוד של תאי אנדותל Microvascular ראשי שריר השלד מאתר

אנו מציגים פרוטוקול מפורט כדי ליצור מודל קסנוגרפט murine של מום ורדי. מודל זה מבוסס על הזרקה תת עורית של תאים אנדותל נגזר המטופל המכיל HYPER-activating TIE2 ו / או מוטציות גן PIK3CA. נגעים Xenograft מקרוב לסיכום התכונות ההיסטופתולוגיות של רקמת חולה VM.

מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל למום ורדי

פרוטוקול זה מפרט שיטה מותאמת להפקה, הרחבה והקפאה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח המתקבלים על ידי הבחנה בין תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם, ולחקור תכונות מחסום מוח בדם במודל אקס ויוו.

נגזרת, התרחבות, קריומורציה ואפיון של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול, שיטת תרבית תאי אנדותל מורחבת (EECM), המאפשרת התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאים דמויי תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC). תאים אלה מראים ביטוי של מולקולות היצמדות תאי אנדותל ולכן הם מודל מחסום דם-מוח אנושי המתאים לחקר אינטראקציות תאי מערכת החיסון במבחנה.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאים דמויי תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח עם פנוטיפ חיסוני בוגר

במאמר זה אנו מתארים שיטת הומוגניזציה מהירה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של ננו-שלפוחיות שמקורן באנדוזומים כסוג חדש של חיקוי אקסוזום (EMs) החולקים את אותו מקור ביולוגי ומבנה, מורפולוגיה והרכב חלבונים דומים של שלפוחיות חוץ-תאיות מקומיות (EV).

שיטת הומוגניזציה במהירות גבוהה בסיוע הפרדה מגנטית לייצור בקנה מידה גדול של שלפוחיות שמקורן באנדוזום

למד שיטה להעברת microRNA לתאי אנדותל באמצעות וקטור PEI/MNP ללא וירוסים. השיטה מאפשרת מגנטיזציה של תאים לשיפור השמדתם באתרי מטרה וזיהוי MRI ברפואה רגנרטיבית.

הכנה

גלה סרטונים נוספים