הכנה במבחנה אפיון ממוגנטים miR-modified לתאי אנדותל

המטרה הכוללת של הליך זה היא להציג טכניקה המבטיחה שינוי תאים עם מיקרו-RNA ובמגנטיזציה מקבילה של תאים. שיטה זו יכולה לתת מענה לאתגרים מרכזיים בתחום הרפואה הרגנרטיבית. כגון הנדסה גנטית של תאים לפני השתלה.

בנוסף לשינוי תאים יעיל עם מיקרו-רנ"א, הם אפשרו זאת עם תחמוצת ברזל. זה יכול לשמש לשיפור שימור התאים בצד העניין על ידי יישום שדה מגנטי. טיפול תאי מבטיח מאוד לטיפול במחלות לב, שימור תאי היפו ושיפור דחוף של הישרדות התאים.

התחל הליך זה עם תרבית תאי אנדותל וריד טבורי אנושי להכנת קומפלקסים של טרנספקציה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. 48 שעות לפני הטרנספקציה, זרע את ה-HUVECs על צלחות באר תרבית תאים מפלסטיק בגודל מתאים. עם צפיפות תאים התחלתית של כ-13,000 תאים לסנטימטר רבוע של משטח הגידול.

לאחר מכן, הכינו ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל טריים miR/פוליאתילן/סופר פרמגנטי. ראשית יש לדלל 2.5 פיקומולים של מיקרו-RNA לסנטימטר רבוע של משטח גידול התא ותמיסת גלוקוז של חמישה אחוזים כדי לקבל ריכוז סופי של 0.125 פיקומולים של מיקרו-RNA למיקרוליטר. לאחר מכן, יש לדלל את ה- PEI בנפח שווה של תמיסת גלוקוז של חמישה אחוזים.

מוסיפים את ה-PEI המדולל לתמיסת המיקרו-RNA ומערבלים את התערובת המתקבלת למשך 30 שניות. לאחר מכן דגרו את תערובת miR/PEI למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. סוניקציה של ה-MNP למשך 20 דקות לפחות באמבט המים הסוניקטיבי בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הוסיפו את הכמות המתאימה של תמיסת MNP לתערובת miR/PEI המוכנה. לאחר מערבולת של 30 שניות, יש לדגור למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו את תערובת ה-miR/PEI/MNP המוכנה ישירות למדיום התרבית שעל התאים.

החלף את התערובת הזו בתרבית טרייה בינונית שש שעות לאחר הטרנספקציה. לאחר ניתוח בטיחות הווקטור כמתואר בפרוטוקול הטקסט, אשר ואפיין את הלוקליזציה התוך-תאית של קומפלקסים טרנספקטיביים על ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה קונפוקלי וסופר-רזולוציה. לשם כך, זרעו את ה-HUVECs על פתקי כיסוי זכוכית מצופים ג'לטין המונחים בבארות של צלחות תרבית של 24 בארות כמו קודם.

העבירו את התאים עם תווית miR/PEI/MNP ב-3 צבעים ודגרו במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה לחה המכילה חמישה אחוזי פחמן דו חמצני. שטפו את החלקות הכיסוי תחילה עם שני אחוז אלבומין בסרום בקר ותמיסת מלח עם פוספט, ולאחר מכן עם PBS בלבד. תקן את התאים על ידי דגירה בארבעה אחוז פרפורמלדהיד או PFA ב -37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.

שטפו עם PBS ולאחר מכן צבעו את הגרעינים ב-DAPI בהתאם לפרוטוקולים הסטנדרטיים. לאחר מכן שטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים 15 דקות על השייקר כדי להסיר עודפי צבע. הנח את החלקות הכיסוי המוכנות על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות אמצעי הרכבה מתאים ותן לשקופיות להתייבש לפחות שעה לפני השימוש בהן למיקרוסקופיה.

רכוש תמונות באמצעות מטרת טבילת שמן פי 63 בהגדרות ה-SIM שנמצאות בפרוטוקול הטקסט. עבור מיקוד תאים ותנאים דינמיים מדומים במבחנה, תחילה העבירו את ה-HUVECs לצלחת של 24 בארות כמו קודם. לאחר הדגירה למשך 24 שעות, יש לשטוף את התאים.

לאחר מכן הוסיפו x נסיעות אחד ב-EDTA מדולל ב-PBS ודגרו על התאים במשך ארבע דקות ב-37 מעלות צלזיוס לפני איסוף התאים. צנטריפוגה את התאים שנאספו ב -300 פעמים G למשך 10 דקות. מערבבים את כדור התא המתקבל מבאר אחת עם מיליליטר אחד של מדיום תרבית טרי.

ולהעביר את התאים לבאר אחת של צלחת של 12 בארות. תקן מגנט קטן באופן מקומי באמצעות סרט. הנח את לוחית התרבית על השייקר ודגר את מתלה התא למשך 12 שעות ב-150 סל"ד כדי לדמות תנאים דינמיים.

לאחר מכן שטפו את התאים וקבעו אותם באמצעות ארבעה אחוזי PFA. מכתים את הגרעינים ב- DAPI. הקלט את חיבור התא באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר עם לייזרי עירור של 405 ו-504 ננומטר במצב z-stack כדי להשיג את הנתונים הגולמיים.

השתמש בעיבוד תמונה של הקרנה בעוצמה מרבית כדי ליצור תמונות לניתוח. לניתוח כמותי של תאים בעלי תגובה מגנטית ולא מגיבים, תחילה העבירו את ה-HUVECs בצלחת של 24 בארות. דגרו על התאים במשך 24 שעות לפני שטיפה ואיסוף התאים כפי שתואר קודם.

השעו מחדש את כדור התא המתקבל מכל באר עם 500 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים סטרילי מחומם. החל את מתלה התא על עמוד מיון מגנטי הקבוע על ידי המגנט המצורף. לאחר מכן שטפו את העמודים על המגנט שלוש פעמים עם מאגר מיון תאים טרי.

אסוף את הזרימה כשבר שאינו מגיב מגנטית. הסר את העמודות מהמגנט ואסוף מיד את חלק התא המגיב מגנטית על ידי דחיפה של מאגר מיון תאים טרי חשב העמודה באמצעות בוכנה. צנטריפוגה גם Mag-וגם Mag+fractions ב-300 פעמים G למשך 10 דקות.

לאחר השעיה מחדש של גלולת התא ב-PBS, ספור את התאים והעריך את כדאיות התא באמצעות בדיקת אי הכללה כחולה של טריפאן. מבודדים מחבל הטבור, HUVECs מאופיינים בביטוי של סמן האנדותל CD31 ובהיווצרות צינורות על מטריצת קרום מרתף. HUVECs שהועברו עם miR/PEI/MNP כולם תופסים miR מתויג.

והישרדותם נותרה ללא פגיעה 24 שעות לאחר הטרנספיקציה. בנוסף, מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה מציגה לוקליזציה פרה-גרעינית של קומפלקסים טרנספקטיביים בעלי 3 צבעים. רעילות PEI מאושרת על ידי הפונקציונליות המופחתת של תאים שעברו טרנספטציה של miR/PEI.

חשוב לציין, MNP משחזר את תכונות התא. תאים שעברו שינוי miR/PEI/MNP אינם שונים מתאים לא מטופלים מבחינת היווצרות הצינורות. יתר על כן, תאים אלה שומרים על תקשורת צומת פער בין-תאי כפי שמתגלה באמצעות התאוששות פלואורסצנטית לאחר הלבנת פוטו.

ברגע שתרחיף של תאים שעברו שינוי miR/PEI/MNP נזרע בבארות של צלחת תרבית המונחת על השייקר המסתובב, תאים נוטים לנדוד ולהיצמד לאזור יישום המגנט המקומי. תמונות מייצגות מתארות צמיחת תאים באזור עם יישום מגנט. ללא יישום מגנט.

ובמרכז התרבות באר בה זרימת הנוזל ריכזה את התאים. לאחר השליטה, ניתן לבצע טרנספקציה של תאים תוך שעתיים. לאחר צפייה בסרטון זה אמור להיות לך רושם טוב מאוד כיצד לשנות תאי אנדותל באופן חולף אך יעיל ביותר כולל המגנטיזציה.

וגם כיצד לאפיין באופן סופי את תוצר התא. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב אחר מספרים נתונים עבור כמויות זריעת תאים של רכיבים להכנת קומפלקסים של טרנספקציה, זמן הדגירה ושלב הכביסה לאחר הטרנספקציה. אנו אופטימיים מאוד שגישה זו תהיה ניתנת להעברה היטב לסוגי תאים אחרים לטיפול באיברים מושפעים אחרים.

בעקבות הליך זה ניתן לבצע מחקרים in vivo עם תאים ממוגנטים ששונו. הם יכולים לענות על שאלות נוספות האם העמסת ברזל של תאים יעילה כדי להבטיח את שימורם בצד העניין. וגם להגדיר את גבולות הזיהוי עם MRI in vivo.