Name: Assay רומן עבור הקרה Nociception ב דרוזופילה זחלים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: למד שיטה לחקר נוקיצפציה קרה בזחלי Drosophila באמצעות בדיקת Peltier מותאמת אישית. השיטה מאפשרת מניפולציה מדויקת של גירוי קר מזיק וכימות תגובות התנהגותיות קשורות לכאב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים שרה וו וקמיל גרהם לפיתוח בשלבים מוקדמים של assay הבדיקה הקר, המרכז במלאי Bloomington תסיסנית מניות זבוב, וחברי מעבדת Galko עבור האנושות לקרוא את כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי NIH NRSA (NIH F31NS083306) כדי HNT, ועל ידי NIH R01NS069828, R21NS087360 לבין אוניברסיטת טקסס MD Anderson קלארק המלגה בסיסי מחקר כדי MJG.

1. הכנת הזחלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רם מניות או צלבים גנטיים בתוך חממת 25 ºC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם culturing צלב, להשתמש 20-25 נקבות בתולה ו 15-20 זכרים לכל בקבוקון המכיל תקשורת זבוב קמח תירס רגילה. אפשר נקבות להטיל ביצים במשך כ 48 שעות לפני העברתי בקבוקון חדש של מזון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4-5 ימים לאחר ליי ביצה, לאסוף הזחלים instar 3 rd של הגנוטיפ הרצוי על ידי התזת בעדינות זרם של מים לתוך המזון וזחלים רגשני, ושופכים את תוכנה אל צלחת פטרי בגודל בינוני, נקי (60 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא, ולמיין זחלים בעדינות בעזרת מלקחיים באמצעות גודל או מכחול כדי למנוע גדול &quot;נדודי 3 rd instar&quot; או זחלים חולניים קטנים מ נבדק. זחלי מחק המכילים כל סמנים גנטיים או מאזנים רצויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש מאכלי תווית חבר במעבדת בחור או מכולות שבו זחלים ממוינים יוצבו כך הנסיין יכול להיות &quot;עיוור&quot; על האקסתנאי או הגנוטיפ perimental של הזחלים אם רלוונטי. הנסיין יכול להחיל תוויות מפוענחות נתונים שנאספו לאחר הניסוי באמצעות מפתח שנוצר על ידי חברי מעבדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות scoopula, להעביר סכום פרוטה בגודל של מזון טרי לתוך (35 מ&quot;מ x 10 מ&quot;מ או 60 מ&quot;מ x 15 מ&quot;מ) נקי, מלא צלחת פטרי שכותרתו בחצי הדרך עם מים בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להזיז את הזחלים הממוינים על המזון (כדי למנוע רעב או התייבשות אם צפויות בדיקות לקחת יותר מ 20 דקות) באמצעות מלקחיים או מכחול. </li></ol> 2. הקרה Probe Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את יחידת הבדיקה הקרה המאפשרת כמה דקות עד שיתקרר לטמפרטורה הרצויה. אם הגדרתי לטמפרטורות נמוכות, התעבות תהווה סבירה לאורך החללית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את כל עודף לחות עם מעבדה לנגב לפני בקשת הזחל. כאשר אינו בשימוש מיידי, במקום בידוד כובע על החללית לשני לבודד וכדי לשמור על קצה נקי ולמנוע נזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח זחל instar באמצע 3 rd גבי פיסת דקה של ויניל נייד הכהה (בדרך כלל, להשתמש חתיכה קטנה לחתוך מתוך קלסר מחברת) תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. העזרים ויניל השחורים להדמיה ניגודיות בהעברת הזחל מבלי לגעת בו כדי ליישר את זה כמו שצריך עם החללית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את המיקרוסקופ (ראו טבלה של חומרים) ויחידת אור (ראו טבלה של חומרים) כדי בהירות בינונית (בהירות מקסימום 50-75%) לספק בניגוד ולמנוע הזחל מהתייבשות מהר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבטל את כל זחלים אינם מציגים נורמליות ראשון נידות פריסטלטיות כפי שיכלו לבלבל את התוצאות. הזחל צריך להיות לח מצלחת פטרי של מים אחרים הזחל תדבק ויניל עיכוב תנועה נורמלית. מים צריכים לא רופסים סביב הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Advance החללית ביד לכיוון הזחל בזווית 90º לצייר גוף anteroposterior, באמצעות ויניל כדי להזיז את הזחל לתוך corעמדת rect (ראה איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הקצה של החללית להניח בעדינות על פני השטח הגבה באמצע של הזחל עם החללית בזווית של כ -45 אל במת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במגע חללי, להפעיל טיימר מעבדה. החל מספיק לחץ כלפי מטה על מנת להגדיל את כניסת המשטח מעט של לציפורן הזחל תוך התרה קדימה או תנועה לאחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק בדיקה במקום עד 10 s או עד לתגובה ההתנהגותית קר עורר הוא ציין - המוקדם מביניהם. ואז להסיר את החללית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את התגובה ההתנהגותית שנצפתה ואת חביון התגובה. זחלים כי לא ישיבו תוך 10 ימים נחשבים &quot;לא מגיב&quot;. זמן אחזור יכול גם להיות מוקלט עבור מגיבים ומשמש למדידת שינויים / משרעת חוסן תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל זחל ולהכין את הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 2.3-2.11 עד המספר הרצוי של זחלי מבחן הוא הגיע (שלושה סטים של n = 20-40 זחלים היו used כאן). </li></ol>

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).</li>
<li>Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+expression+of+tetanus+toxin+light+chain+in+Drosophila+specifically+eliminates+synaptic+transmission+and+causes+behavioral+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects.</a> Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).</li>
<li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li>
<li>Im, S. H., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pokes%2C+sunburn%2C+and+hot+sauce%3A+Drosophila+as+an+emerging+model+for+the+biology+of+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception.</a> Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).</li>
<li>Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+tool+for+studying+the+conserved+genetics+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain.</a> Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).</li>
<li>Turner, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRP+Channels+Pkd2%2C+NompC%2C+and+Trpm+Act+in+Cold-Sensing+Neurons+to+Mediate+Unique+Aversive+Behaviors+to+Noxious+Cold+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila.</a> Curr Biol. , (2016).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).</li>
<li>Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+filopodia%2C+Ripped+Pocket%2C+NOMPC%2C+and+NMDARs+contribute+to+the+sense+of+touch+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).</li>
<li>Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li>
<li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).</li>
<li>Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+methods+of+assessing+thermal+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (63), e3837(2012).</li>
<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
<li>Hughes, C. L., Thomas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensory+feedback+circuit+coordinates+muscle+activity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila.</a> Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).</li>
<li>Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pickpocket+is+a+DEG%2FENaC+protein+required+for+mechanical+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).</li>
<li>Neely, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrpA1+regulates+thermal+nociception+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila.</a> PLoS One. 6 (8), e24343(2011).</li>
<li>Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+directional+change+after+mechanical+stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila.</a> Mol Brain. 5, 39(2012).</li>
<li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tachykinin+acts+upstream+of+autocrine+Hedgehog+signaling+during+nociceptive+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila.</a> Elife. 4, e10735(2015).</li>
<li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+nociceptive+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization.</a> Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).</li>
<li>Berrigan, D., Pepin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/002219109400113U">How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera.</a> J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).</li>
<li>Galko, M. J., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+genetic+analysis+of+wound+healing+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae.</a> PLoS Biol. 2 (8), E239(2004).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+discovery+of+targets+and+anti-targets+for+cancer+polypharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology.</a> Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
<li>Gill, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistate+life-tables+and+regression+models%5BTitle%5D)+AND+%22Math+Popul+Stud%22%5BJournal%5D)">Multistate life-tables and regression models.</a> Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).</li>
<li>Mantel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ranking+procedures+for+arbitrarily+restricted+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrics%22%5BJournal%5D)">Ranking procedures for arbitrarily restricted observation.</a> Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).</li>
<li>Breslow, N. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2334776?seq=1#page_scan_tab_contents">A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship.</a> Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).</li>
<li>Gehan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalized+wilcoxon+test+for+comparing+arbitrarily+singly-censored+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biometrika%22%5BJournal%5D)">A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples.</a> Biometrika. 52, 203-223 (1965).</li>
</ol>

בקשה לפטנט בארה&quot;ב (CL) ממתינה על העיצוב של החללית הקרה. מידע נוסף על פרטים של מספרים הקטלוגיים קרה חללית ובנייה, וכן ייעוץ נוסף על עיצוב כלי יסופק לפי בקשה.

Assay המתואר כאן יכול לשמש כדי להעריך איכותית וכמותית nociception או רגישות nociceptive הזחלים של רקע גנטי שונים, השפעות סביבתיות, ו / או תנאי-induced נזק. מאז assay זה מאפשר יישום מוקד של גירוי קור, עם הכלי הזה אפשר להעריך את הפונקציה של קבוצת משנה של עצב סנסורי פריפריה במיוחד להגיב לטמפרטורות קרות. מעניין, התנהגויות קרות עורר אלה נראים לנצל סוגים שונים של נוירונים חושיים מאלה מופעלים על ידי חום 7, 11, אבל מעגל nociceptiv...

דרוזופילה הוכיחה להיות שימושי מאוד עבור זיהוי של גנים שמורים הרומן ומעגלים עצביים העומדים בבסיס התנהגויות מורכבות. זבובים לספק ערכת כלים גנטיות מתוחכמת ומערכת עצבים פשוטה המאפשרת מניפולציה גנטית מדויקת עצבית 1, 2, 3, 4 לנתח הבסיסים התאיים ומולקולריים של nociception 5, 6, 7. זחלים הם שימושיים במיוחד עבור ניתוחים אלו, בהתחשב בעובדת מבחני התנהגות עבור מגע עדין 8, 9, 10, חום רעיל 11, 12, 13 ו תחושה מכאנית של גירוי מזיק 4, </sup&gt; 11 כבר הוקמו, ואת לציפורן הזחל השקופה מאפשרת הדמיה לחיות או קבועה של האפידרמיס העצב סנסורי בסיסי. לאחרונה, ב assay עבור קר רעיל גם פותח 7, אשר אנו מתארים בפירוט רב יותר כאן. באמצעות בדיקה קרה בסדר, קוניים שקצהו, אנו מראים כי תערוכת זחלים תסיסנית סט של התנהגויות תגובתי קרות ספציפיות, נבדל התנהגויות שנצפו בזמן תנועה נורמלית, הבאים במגע עדין, או אחרי גירויי טמפרטורה מכאניים או גבוהים קשים 7, 8, 11 . ההתנהגויות הקרות ספציפיות כוללות התכווצות גוף מלא וחזקה (CT), העלאת 45-90º המגזרים האחוריים (יח&quot;צ) ו העלאה זמנית של הקדמי ואת הפלח אחורי לתוך בצורת U (ארה&quot;ב). השכיחות של התנהגויות אלה מגדילה עם טמפרטורות ופוחתות אך כל פסגות בבית היםטמפרטורות שונות קרות בקלילות. מחקר שנערך לאחרונה מצביע על כך תגובות CT מתווכות על ידי עצב סנסורי פריפריה שונה מאלו להגיב חום רעיל או גירויים מכאניים קשים 7. בדומה קולטן אזעקה החולייתנים, דנדריטים מרובים דרוזופילה (MD) עצב סנסורי הפריפריה יש מבנים דנדריטים מורכבים arborize מעל האפידרמיס 1. נוירונים MD נמצאים בכל מגזר גוף הזחל, מקרין האקסונים שלהם כדי העצב בחוט הגחון 14. עצב סנסורי MD מופרד לארבע כיתות שונות (I-IV) המבוססות על מורפולוגיה הדנדריטים ויש לי משתנה פונקציות חושיות 4, 9, 10, 15, 16, 17. בעוד נוירונים IV בכיתה נדרשים עבור תגובות רול גוף לרוחב זחללטמפרטורות גבוהות או גירויים מכאניים קשים III נוירונים 4, בכיתה נדרשות עבור תגובות מגע עדין 9, 10 ו לא מופעלים רק על ידי קר, אלא גם נדרשים עבור התגובות התנהגותיות הקרות עורר 7. שני נוירונים IV III ומעמד בכיתה לנצל ערוצי פוטנציאל הקולטן חולף דיסקרטיים (TRP) כדי להקל על תגובות התנהגותיות 7 רעילים, 11, 18 ו גירויים שאינם רעיל 9, 10, 17, 19. בהמשך, nociception הזחל הוא רגיש לפציעה הבאה, ברמה התאית 20 והתנהגותיים 12, 21. Assay המתואר כאן מאפשר quantification של אחד נורמלי, או פוטנציאל לשנות תגובות התנהגותיות לטמפרטורות קרות החל קר מזיק (≤ 10 ºC), מגניב מזיק (11-17 ºC), כדי בטמפרטורות הסביבה (18-22 ºC). הטמפרטורות הקרות המשמשות assay זה מסוגלות מפעיל ישירות בכיתת III נוירונים חושיים, לעורר עליות סידן חזקות, לשחזור קר עורר תגובות התנהגותיות, אשר יכולה להיות איכותית וכמותית נתחו 7. ניתן ליישם assay זה כדי זחלים של כל גנוטיפ כמעט כמו גם זחלים חשופים לתנאים סביבתיים מגוונים (תזונת שינה, פגיעה, סוכנים תרופתיים) כדי לקבוע שניהם גורמים גנטיים וסביבתיים המשפיעים nociception הקר, רגישות nociceptive או פלסטיות nociceptive. בהתחשב בכך thermosensation הוא נמצא בכל מקום על פני מינים רבים, assay זה מספק כלי רב ערך לחקר nociception ועלול לחשוף מטרות גן רומן או אינטראקציות עצביות שתשפרנההבנתנו nociception חוליות. החללית הקרה שהותקנה (ראה בדיקה קרה, טבלת החומרים) מנצלת טמפרטורת לולאה סגורה מבוקרת מכשיר פלטייה, אשר מקרר את פיר אלומיניום טיפ חרוטים באמצעות הולכה תרמית. Thermistor מוטבע בתוך קצה קוני אלומיניום מדווח הטמפרטורה בזמן אמת על יחידת הבקרה. כיור ומאוורר מחוברים מודול התרמו להסדיר את עומס החום של אפקט פלטייה (קוו) ולכן טווח הטמפרטורה הרצויה של (22-0 מעלות צלזיוס) יכול להיות מושגת (ראה יחידת בקרת תרמית, ענייני חומרים). הגירוי הקר המזיק של בדיקת הקצה הקר מוחל ביד אל קו אמצע הגב, כדי לפלח (הים) במרחק שווה מן הקצוות קדמיים וגם אחוריים (בערך קטע A4, לראות באיור 1 א) של הזחל. בתגובה לגירויים קרים, זחלים בדרך כלל לייצר אחד משלוש התנהגויות קרות עורר בתוך החיתוך של 10: גוף מלאהתכווצות (CT), העלאה 45-90º של מגזרים קדמיים וגם אחוריים לתוך בצורת U (ארה&quot;ב), או העלאה של המגזרים האחוריים (יח&quot;צ) (המתוארים תוצאות). אף אחד ההתנהגויות אלה מבוצעים בזמן תנועה פריסטלטיות רגילה או התנהגות שיחור מזון. התנהגויות אלו הן גם נבדלים תגובות מגע עדינות התגובה מתגלגלת מרתיעת טמפרטורה גבוהה או גירויים מכאניים רעילים.

<table><tbody><tr><td>Cold</td><td>Pro-Dev Engineering</td><td>נבנה בהתאמה אישית לפי דרישה</td><td>ניתן לספק מספרי חלקים ופרטי בנייה על פי בקשה</td></tr><tr><td>יחידת בקרה תרמית</td><td>TE Technology</td><td>מארז בנוי בהתאמה אישית</td><td>ניתן לספק מספרי חלקים ופרטי בנייה על פי בקשה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Zeiss Stemi 2000 Zeiss</td><td></td><td>NT55-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite MI-150 תאורה</td> <td>בעוצמה גבוההדולן-ג'נר תעשיות.</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Schott Dual Gooseneck 23 אינץ' מדריך אור סיבים אופטיים</td><td>Schott צפון אמריקה, בע"מ</td><td>שוט A08575</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>FST</td><td>FS-1670</td><td>משמש למיון וטיפול בזחלים. הקפד להחליק ולהקהות מעט את קצות המלקחיים כדי להפחית את הסיכון לנקב או לפצוע בטעות את הזחלים</td></tr><tr><td>Paintbrush</td><td>Dick Blick Art Materials</td><td>06762-1002</td><td>משמש למיון וטיפול בזחלים. זה מועיל אם המברשת לחה במהלך השימוש.</td></tr><tr><td>35 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי פוליסטירן</td><td>פלקון</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ x 10 מ"מ צלחת פטרי פוליסטירן</td><td>פלקון</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>חתיכת ויניל שחור (לפחות 2 אינץ' x 2 אינץ')</td><td></td><td></td> <td>משמש לספק ניגודיות ולכוון זחלים לבדיקה הקרה</td></tr><tr><td>פישרברנד סקופולה מרית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-357Q</td><td>משמש להעברת מזון</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>06-666A</td><td>משמש לייבוש הזחלים ובדיקה קרה אם יש עודף לחות</td></tr></tbody></table>

assay רומן עבור הקרה nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

איך אורגניזמים לחוש ולהגיב לטמפרטורות רעילות עדיין הוא הבין היטב. בהמשך, המנגנונים רגישים של המכונות החושיות, כגון בחולים חווים נוירופתיה היקפית או רגישות מושרה פציעה, אינם מתאפיינים גם. המודל תסיסנית הגנטי הצייתן נעשה שימוש כדי לחקור את תאי גנים דרושים זיהוי חום רעיל, אשר הניב גנים שמורים מרובים של עניין. מעט מאוד ידוע זאת על תאי קולטנים חשובים עבור חישה קרה רעילה. למרות, דרוזופילה לא לשרוד חשיפה ממושכת לטמפרטורות קרות (≤10 ºC), ותמנע מגניב, והעדיפה בטמפרטורות חמות מבחני העדפה התנהגותית, איך הם מרגישים ואולי למנוע גירויים קרים רעילים יש רק נחקר לאחרונה. כאן אנו מתארים ולאפיין הקור הרעיל הראשון (≤10 ºC) assay התנהגותייםדרוזופילה. שימוש בכלי זה assay, אנו מראים חוקרים כיצד איכותיים וכמותית להעריך התנהגויות nociceptive קרות. ניתן לעשות זאת בתנאי תרבות נורמלים / בריאים, או כנראה בהקשר של מחלה, פציעה או רגישות. יתר על כן, ניתן ליישם assay כדי זחלים שנבחרו עבור גנוטיפים רצוי, אשר עשוי להשפיע thermosensation, כאב, או רגישות nociceptive. בהתחשב בכך כאב הוא תהליך שמור ביותר, באמצעות assay ללמוד nociception תרמית נוספת יהיה ללקט הבנה חשובה סביר של תהליכי כאב מינים אחרים, כולל בעלי חוליות.

דרוזופילה מהלך זחלים בתנועה פריסטלטיות הכוללת הפסקות מדי פעם, מפנה את ראשו, ואת שינויים בכיוון 22. בתגובה לבקשת מוקד של גירוי קור רעיל אולם, תערוכת זחלי סט של התנהגויות ייחודיות, בניגוד הגליל לרוחב המרתיע חום רעיל גירויים מכאניים. התנהגויות אלו הן גם שונות מתגובות כדי מגע עדין 8, 9, 10 או למגע של החללית בטמפרטורת החדר. ההתנ...

כאן אנו מדגימים assay הרומן ללמוד nociception קר הזחלים תסיסנית. assay זה מנצל בדיקה שהותקנה פלטייה מסוגל ליישם גירוי קור מוקד רעיל וכתוצאה מכך התנהגויות קרות ספציפיות הניתנות לכימות. טכניקה זו תאפשר דיסקציה תאית ומולקולרית נוספת של nociception הקר.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

המטרה הכללית של בדיקה זו לקור מזיק היא לאפשר כימות והערכה של שינויים בזיהוי קור, מבלתי מזיק למזיק. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מרכזיות בתחום הנוציצפציה, כולל הקלה בזיהוי גנים חדשים ושמורים של נוציצפציה לקור ומודולטורים של תגובות כאב במצב של מחלה ו/או פציעה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מניפולציה מדויקת של גירוי הקור המזיק וכימות של תגובות המושרות על ידי קור במגוון הקשרים סביבתיים וגנטיים.בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יצטרכו לתרגל יישום עקבי של הגשוש לפני תחילת הניסוי. הרעיון לשיטה זו עלה תחילה כאשר גילינו שזחלי דרוזופילה מגיבים לחום מזיק, והסתקרנו לבדוק אם הם מגיבים באופן דומה לקור מזיק. גדלו מאגרי זבובים או הכלאות גנטיות של דרוזופילה באינקובטור בטמפרטורה של 25 degrees Celsius.שימו לב, אם אתם מגדלים הכלאה, השתמשו ב-20 עד 25 נקבות בתוליות וב-15 עד 20 זכרים לכל מבחנה המכילה מצע מזון רגיל של קמח תירס עבור זבובים, ושגדו למשך כ-48 שעות לפני העברת הזבובים למבחנה חדשה עם מזון. חמישה ימים לאחר תחילת הגידול, אספו פשפשים בשלב השלישי (third instar larvae) של הגנוטיפ הרצוי על ידי התזת זרם עדין של מים לתוך המזון הרך והפשפשים. לאחר מכן, שפכו את התוכן לתוך פטריה נקייה בגודל בינוני.בשלב הבא, מיינו בעדינות את הזחלים לפי גודלם, והשתמשו בפינצטה כדי למנוע מהזחלים הגדולים והנודדים של השלב השלישי, או מזחלים קטנים וחולים, להישם לבדיקה. השליכו זחלים הנושאים סממנים גנטיים לא רצויים או מאוזנים (balancers). בקשו מחבר מעבדה אחר לסמן את המכלים שבהם ימוקמו הזחלים הממוינים, כדי לשמור על סמיות של הבודק לגבי התנאי הניסויי או הגנוטיפ של הזחלים.השתמשו בכף מעבדה (scoopula) כדי להעביר כמות קטנה של מזון טרי אל תוך צלחת פטרי נקייה ומסומנת, הממולאת למחציתה במים בטמפרטורת החדר. לבסוף, השתמשו בפינצטה כדי להעביר בעדינות את הזחלים הממוינים אל המזון כדי למנוע הרעבה או התייבשות, במידה וצפוי כי הבדיקה תארך יותר מ-20 דקות. התחילו בהפעלת יחידת הגשש הקר והמתינו מספר דקות עד שהיא תתקרר לטמפרטורה הרצויה.נגבו בעזרת ניגב מעבדה שאריות לחות מהגשושית. כאשר הגשושית אינה בשימוש מיידי, הניחו עליה מכסה מבודד כדי לבודדה, לשמור על ניקיון הקצה ולמנוע נזק. לאחר מכן, הניחו זחל בשלב ג׳ של הגיל השלישי (middle third instar larva) על פיסת ויניל כהה ודקה הניתנת להזזה, כדי לסייע בניגודיות ויזואלית וביישור של הגשושית.לאחר מכן, הנח את פיסת הוויניל עם הזחל תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (bright field). כוון את המיקרוסקופ ואת יחידת התאורה לבהירות בינונית כדי לספק ניגודיות ולמנוע מהזחל להתייבש במהירות רבה מדי. בעזרת מכחול לח, ודא שהזחל לח ממספר המים של פטרי, כדי שלא יידבק לוויניל, והסר עודפי מים סביבו באמצעות KimWipe.הנח את הגשש ידנית לעבר הזחל בזווית של 90 מעלות לציר הגוף הקדמי-אחורי (anteroposterior), תוך שימוש בוויניל כדי להזיז את הזחל למצב הנכון. כעת, כוון את קצה הגשש כך שיונח בעדינות על פני השטח הדורסליים המרכזיים (mid-dorsal surface) של הזחל, כאשר הגשש נמצא בזווית של כ-45 מעלות למישור המיקרוסקופ. עם מגע הגשש, הפעל טיימר.הפעילו לחץ כלפי מטה מספיק כדי להוביל לשקיעה קלה של פני השטח של קוטיקולת הזחל, תוך שאתם עדיין מאפשרים תנועה קדימה או אחורה. לאחר מכן, החזיקו את הגשש במקומו למשך עד 10 שניות או עד להשגת תגובה התנהגותית ש ausgelöst על ידי קור, המוקדם מביניהם. לאחר מכן, הסירו את הגשש.תעדו את התגובה ההתנהגותית שנצפתה ואת השהיית התגובה. רשמו כל מקרה של אי-תגובה או זחלים שאינם מגיבים תוך 10 שניות. לבסוף, השליכו את הזחל והכינו את הבא בתור.חזור על הפרוצדורה עד להגעה למספר הזחלים הנדרש לבדיקה. לאחר מגע עם הגשוש הקר, תוצאות ניסוי זה מצביעות על כך שהזחלים מגיבים בהתנהגויות הבאות המושרות על ידי קור: כיווץ של המקטעים הקדמיים והאחוריים לעבר מרכז הגוף, CT; הרמה של המקטעים הקדמיים והאחוריים אל האוויר ליצירת צורת U, US; והרמה של המקטעים האחוריים בלבד אל האוויר, PR. יתרה מכך, התנהגויות שונות מגיעות לשיאן בטווחי קור משתנים, כך ש-PR ו-US מגיעים לשיא ב-3 עד 8 מעלות צלזיוס, בעוד ש-CT מגיע לשיא בסביבות 9 עד 14 מעלות צלזיוס. לבסוף, כאשר משווים את זמני השהייה של התנהגויות הקור השונות, נתונים אלו מראים כי תגובות CT היו שונות באופן מובהק מ-PR ו-US ב-3 מעלות צלזיוס וב-10 מעלות צלזיוס, ומ-US ב-20 מעלות צלזיוס.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים אותה בערך ב-30 עד 40 דקות עבור סט אחד של 30 זחלים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לשים לב לתנועה לא תקינה, לרמת הלחות של הזחל, וללחץ ומיקום של הגשוש הקר על גבי הזחל. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן יישום לא נכון של הגשוש הקר עלול להוביל לעקומות תגובה למינון שונות או להיעדר התנהגות תגובת קור.בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון דימוי באור פלואורסצנטי, ניתוח ביטוי גנים ובדיקות התנהגותיות. כולן יקבעו כיצד חשיפה לקור משפיעה על פעילות תאית, מורפולוגיה, ביטוי גנים או התנהגויות אחרות. טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים בתחום הנוציספציה לקור לבחון השפעות גנטיות, סביבתיות והשפעות של מחלות ב-drosophila.לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי השימוש בכלי ובבדיקה של גשש הקור (cold probe) לצורך ניתוח תגובות המושרות על ידי קור, ולהבנת המנגנונים התאיים והגנטיים של נוציספציה של קור.

novel-assay-for-cold-nociception-in-drosophila-larvae

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר זה וידאו, אנו מתארים שיטה חדשה המאפשרת בנייה של הדרגתיים odorant בגיאומטריות ויציב לשליטה. אנו בקצרה להמחיש כיצד הדרגתיים אלה יכולים לשמש מסך פגמים חוש הריח (תתרנות מלאה או חלקית) ו ללמוד תכונות מהותיות יותר של התנהגות chemotaxis.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

במאמר זה, אנחנו מדגימים מבחני ללמוד nociception...

שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; רימה

לזחלי דרוזופילה יש נוירונים חושיים ייעודיים – nociceptors – שתגובתם לגירויים תרמיים שעלולים להיות מזיקים מעוררת התנהגויות מרתיעות – או מה שמכונה "nocifensive" – אצל החיה. סרטון זה מתאר שיטה להערכת נוסיספטציה תרמית על ידי רישום התנהגות הזחל בתגובה ליישום מקומי של בדיקת חום על הקוטיקולה. שיטה זו נקראת, אם כן, בדיקת חום מקומית.

בדיקת חום מקומית: שיטה להערכת נוסיספטציה של טמפרטורות גבוהות בזחלי דרוזופילה

במאמר זה וידאו, אנו מתארים assay אוטומטי כדי למדוד את ההשפעה של רעב או שובע על התנהגות חיפוש מזון תלויה בריח הפירות המבוגרים לעוף melanogaster דרוזופילה.

יחיד לטוס Assay עבור התנהגות שיחור מזון ב דרוזופילה

רמות של מולקולת האיתות התאית הדלקתית תחמוצת החנקן (NO) נבדקות בדרך כלל באמצעות מגיב גריס. בפרוטוקול זה, יצרנו בדיקת גריס מותאמת תוך שימוש ברקמת מוח חיה של דרוזופילה על מנת לזהות הפרשת NO בשיטה פשוטה, ניתנת לכימות וניתנת לחזרה רבה.

בדיקה כמותית חדשה של רקמה שלמה של רמות תחמוצת החנקן בתגובה נוירו-דלקתית של דרוזופילה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקביעת הטמפרטורה הסביבתית המועדפת של הזחלים דרוזופילה באמצעות הדרגה תרמי רציפה.

וזמינותו שינוי טמפרטורה כדי לקבוע העדפות תרמי של הזחלים דרוזופילה

מטרת פרוטוקול זה היא להראות כיצד לבצע בדיקה משופרת עבור nociception מכני בזחלים Drosophila. אנו משתמשים בהסמכה כאן כדי להדגים כי רגישות יתר מכנית (allodynia והיפרלגזיה) קיימת בזחלים דרוזופילה.

מבחנים וכלים משופרים למדידת תפיסה מכנית בזחלי דרוזופילה

מאמר זה מציג שיטות למניפולציה אופטוגנטית ב-Drosophila melanogaster, תוך שימוש ב-CsChrimson ו-GtACR2 כדי להפעיל ולהשתיק נוירונים ספציפיים. ארבעה ניסויים מתוארים לשימוש באופטוגנטיקה כדי לחקור התנהגויות תרמוטקטיות וטעמיות, ומספקים תובנות לגבי המנגנונים העצביים הבסיסיים השולטים בתהליכים אלה.

מבחנים התנהגותיים למניפולציה אופטוגנטית של מעגלים עצביים בדרוזופילה מלנוגסטר

שיטה immunostain ולדמיין איברים chordotonal ב זחלים וגלמים...

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

זחלי תסיסנית מסוגלים לשייך גירויי ריח בתגמול בטעם. כאן אנו מתארים הפרדיגמה התנהגות פשוטה המאפשרת הניתוח של למידה אסוציאטיבית אפטטיבית הרחה.

למידה אסוציאטיבית הרחה באפטטיבית<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

למד שיטה לחקר נוקיצפציה קרה בזחלי Drosophila באמצעות בדיקת Peltier מותאמת אישית. השיטה מאפשרת מניפולציה מדויקת של גירוי קר מזיק וכימות תגובות התנהגותיות קשורות לכאב.

Assay רומן עבור הקרה Nociception ב

גלה סרטונים נוספים